Characterization of type I interferon pathway during hepatic differentiation of human pluripotent stem cells and hepatitis C virus infection

Pluripotent stem cells are being actively studied as a cell source for regenerating damaged liver. For long-term survival of engrafting cells in the body, not only do the cells have to execute liver-specific function but also withstand the physical strains and invading pathogens. The cellular innate immune system orchestrated by the interferon (IFN) pathway provides the first line of defense against pathogens. The objective of this study is to assess the innate immune function as well as to systematically profile the IFN-induced genes during hepatic differentiation of pluripotent stem cells. To address this objective, we derived endodermal cells (day 5 post-differentiation), hepatoblast (day 15) and hepatocyte-like cells (day 21) from human embryonic stem cells (hESCs). Day 5, 15 and 21 cells were stimulated with IFN-alpha and subjected to IFN pathway analysis. Transcriptome analysis was carried out by RNA sequencing. The results showed that the IFN-alpha treatment activated STAT-JAK pathway in differentiating cells. Transcriptome analysis indicated stage specific expression of classical and non-classical IFN-stimulated genes (ISGs). Subsequent validation confirmed the expression of novel ISGs including RASGRP3, CLMP and TRANK1 by differentiated hepatic cells upon IFN treatment. Hepatitis C virus replication in hESC-derived hepatic cells induced the expression of ISGs - LAMP3, ETV7, RASGRP3, and TRANK1. The hESC-derived hepatic cells contain intact innate system and can recognize invading pathogens. Besides assessing the tissue-specific functions for cell therapy applications, it may also be important to test the innate immune function of engrafting cells to ensure adequate defense against infections and improve graft survival. (C) 2015 The Authors. Published by Elsevier B.V.

Roles for Transcription Factors Sp1, NF-kappa B, IRF3, and IRF7 in Expression of the Human IFNL4 Gene

The expression of a biologically active human IFN4 depends on the presence of a frameshift deletion polymorphism within the first exon of the interferon lambda 4 (IFNL4) gene. In this report, we use the lung carcinoma-derived cell line, A549, which is genetically viable to express a functional IFN4, to address transcriptional requirements of the IFNL4 gene. We show that the GC-rich DNA-binding transcription factor (TF) specificity protein 1 (Sp1) is recruited to the IFNL4 promoter and has a role in induction of gene expression upon stimulation with viral RNA mimic poly(I:C). By using RNAi and overexpression strategies, we also show key roles in IFNL4 gene expression for the virus-inducible TFs, nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells (NF-B), IFN regulatory factor 3 (IRF3), and IRF7. Interestingly, we also observe that overexpression of IFN4 influences IFNL4 promoter activity, which may further be dependent on the retinoic acid-inducible gene-I (RIG-I)-like receptor pathway. Together, our work for the first time reports on the functional characterization of the human IFNL4 promoter.

Structural studies on tobacco streak virus coat protein: Insights into the pleomorphic nature of ilarviruses

Tobacco streak virus (TSV), the type member of Ilarvirus genus, is a major plant pathogen. TSV purified from infected plants consists of a ss-RNA genome encapsidated in spheroidal particles with diameters of 27, 30 and 33 nm constructed from multiple copies of a single species of coat protein (CP) subunits. Apart from protecting the viral genome, CPs of ilarviruses play several key roles in the life cycle of these viruses. Unlike the related bromo and cucumoviruses, ilarvirus particles are labile and pleomorphic, which has posed difficulties in their crystallization and structure determination. In the current study, a truncated TSV-CP was crystallized in two distinct forms and their structures were determined at resolutions of 2.4 angstrom and 2.1 angstrom, respectively. The core of TSV CP was found to possess the canonical beta-barrel jelly roll tertiary structure observed in several other viruses. Dimers of CP with swapped C-terminal arms (C-arm) were observed in both the crystal forms. The C-arm was found to be flexible and is likely to be responsible for the polymorphic and pleomorphic nature of TSV capsids. Consistent with this observation, mutations in the hinge region of the C-arm that reduce the flexibility resulted in the formation of more uniform particles. TSV CP was found to be structurally similar to that of Alfalfa mosaic virus (AMV) accounting for similar mechanism of genome activation in alfamo and ilar viruses. This communication represents the first report on the structure of the CP from an ilarvirus. (C) 2015 Elsevier Inc. All rights reserved.

Intracellular delivery of antibodies by chimeric Sesbania mosaic virus (SeMV) virus like particles

The therapeutic potential of antibodies has not been fully exploited as they fail to cross cell membrane. In this article, we have tested the possibility of using plant virus based nanoparticles for intracellular delivery of antibodies. For this purpose, Sesbania mosaic virus coat protein (CP) was genetically engineered with the B domain of Staphylococcus aureus protein A (SpA) at the beta H-beta I loop, to generate SeMV loop B (SLB), which self-assembled to virus like particles (VLPs) with 43 times higher affinity towards antibodies. CP and SLB could internalize into various types of mammalian cells and SLB could efficiently deliver three different monoclonal antibodies-D6F10 (targeting abrin), anti-a-tubulin (targeting intracellular tubulin) and Herclon (against HER2 receptor) inside the cells. Such a mode of delivery was much more effective than antibodies alone treatment. These results highlight the potential of SLB as a universal nanocarrier for intracellular delivery of antibodies.

Immune responses against hepatitis C virus genotype 3a virus-like particles in mice: A novel VLP prime-adenovirus boost strategy

Chronic hepatitis C virus (HCV) infection represents a major health threat to global population. In India, approximately 15-20% of cases of chronic liver diseases are caused by HCV infection. Although, new drug treatments hold great promise for HCV eradication in infected individuals, the treatments are highly expensive. A vaccine for preventing or treating HCV infection would be of great value, particularly in developing countries. Several preclinical trials of virus-like particle (VLP) based vaccine strategies are in progress throughout the world. Previously, using baculovirus based system, we have reported the production of hepatitis C virus-like particles (HCV-LPs) encoding structural proteins for genotype 3a, which is prevalent in India. In the present study, we have generated HCV-LPs using adenovirus based system and tried different immunization strategies by using combinations of both kinds of HCV-LPs with other genotype 3a-based immunogens. HCV-LPs and peptides based ELISAs were used to evaluate antibody responses generated by these combinations. Cell-mediated immune responses were measured by using T-cell proliferation assay and intracellular cytokine staining. We observed that administration of recombinant adenoviruses expressing HCV structural proteins as final booster enhances both antibody as well as T-cell responses. Additionally, reduction of binding of VLP and JFH1 virus to human hepatocellular carcinoma cells demonstrated the presence of neutralizing antibodies in immunized sera. Taken together, our results suggest that the combined regimen of VLP followed by recombinant adenovirus could more effectively inhibit HCV infection, endorsing the novel vaccine strategy. (C) 2015 Elsevier Ltd. All rights reserved.

Structural studies on chimeric Sesbania mosaic virus coat protein: Revisiting SeMV assembly

The capsid protein (CP) of Sesbania mosaic virus (SeMV, a T=3 plant virus) consists of a disordered N-terminal R-domain and an ordered S-domain. Removal of the R-domain results in the formation of T=1 particles. In the current study, the R-domain was replaced with unrelated polypeptides of similar lengths: the B-domain of Staphylococcus aureus SpA, and SeMV encoded polypeptides P8 and P10. The chimeric proteins contained T=3 or larger virus-like particles (VLPs) and could not be crystallized. The presence of metal ions during purification resulted in a large number of heterogeneous nucleoprotein complexes. N Delta 65-B (R domain replaced with B domain) could also be purified in a dimeric form. Its crystal structure revealed T=1 particles devoid of metal ions and the B-domain was disordered. However, the B-domain was functional in N Delta 65-B VLPs, suggesting possible biotechnological applications. These studies illustrate the importance of N-terminal residues, metal ions and robustness of the assembly process. (C) 2015 Elsevier Inc. All rights reserved.

Evaluación preliminar de dos variedades de frijol común (Phaseolus vulgaris L.) inoculadas en diferentes etapas fenológicas con el virus del mosaico común del frijol BCMV

Con el objetivo de evaluar la respuesta de dos variedades de frijol Phaseolus vulgaris L. al virus del mosaico común del frijol (BCMV) se llevó acabo este trabajo en dos etapas de investigación; La etapa I se realizó en la Universidad Nacional Agraria, en los meses de julio a septiembre de 1991, y la etapa II en la estación experimental La Compañía, en los meses de octubre a diciembre de 1991. Para la etapa I, se sembraron en 40 maceteras, semillas de frijol de las variedades Criolla A-1936 y Revolución 79. En la etapa II los tratamientos estaban arreglados en un Bloque Completamente al Azar en un arreglo de parcelas divididas con tres repeticiones. En las dos etapas las variedades fueron inoculadas mecánicamente en tres momentos a los 7, 15, y 21 días después de la emergencia (DDE), y un testigo sin inocular en la etapa I. Se describieron los síntomas y se tomaron los datos de rendimiento. En las dos etapas de investigación ambas variedades resultaron susceptibles al virus. Tendiendo a ser más afectada en los rendimientos la variedad Revolución 79 que la Criolla a-1936 en la etapa II. El momento de inoculación en el que las variedades fueron más afectadas fue a los 15 DDE y no a los 7 DDE y de manera más notable en la variedad Criolla A-1936, esta respuesta se atribuye a: la temperatura, la concentración del virus y a la respuesta de hipersensibilidad en el caso particular de la variedad Criolla A-1936.

Evaluación preliminar de dos variedades de frijol común (Phaseolus vulgaris L.) inoculadas en diferentes etapas fenológicas con el virus del mosaico amarillo del frijol (BYMV)

Con el objetivo de evaluar la respuesta del frijol común (Phaseolus vulgaris L.) al virus del mosaico amarillo del frijol (BYMV) se seleccionaron las variedades Revolución 81 y Revolución 84, las cuales fueron inoculadas con BYMV en diferentes etapas fenológicas. El experimento consistió de dos etapas; Etapa 1 (vivero) en el período comprendido de julio-septiembre de 1991, en el campo de la Escuela de Sanidad Vegetal, Universidad Nacional Agraria, kilómetro 12 1/2 carretera norte, Managua; y la Etapa II (campo), en La Compañía, Masatepe, Carazo. Las variables evaluadas fueron, número de vainas por planta, número de granos por vaina y rendimiento (peso de granos). Para evaluar las diferencias estadísticas de las variables mencionadas se realizó análisis de varianza. En la Etapa 1 se observó que el menor rendimiento se presentó en el momento de inoculación a los 7 DDE para la variedad Rev. 81 y para la variedad Rev. 84 el menor rendimiento fue a los 15 DDE. En la Etapa II el mayor rendimiento se presentó cuando la inoculación se hizo a los 15 DDE, para la variedad Rev.81 y a los 7 DDE, para la variedad Rev.84. Los resultados obtenidos indican que la variedad Rev.81 y Rev. 84 son susceptibles al BYMV resultando con un menor rendimiento la variedad Rev. 81.

Determinación de daño y período crítico del virus del mosaico amarillo del frijol (BYMV) en cuatro variedades de frijol común (Phaseolus vulgaris L.) en Nicaragua

Con el objetivo de determinar el daño y periodo crítico del BYMV en cuatro variedades de frijol (Phaseolus vulgaris L.), utilizándose para dicho fin las variedades mejoradas DOR-364, REV-84 y las variedades Criollas-A-2343 y la Criolla-A-1923, las cuales fueron inoculadas en cuatro etapas fenológicas, siendo estas las etapas V2, V3, V4, R5 y un testigo sin inocular. De acuerdo a los resultados obtenidos en el estudio la variedad Criolla-A-1923 resultó la más afectada con reducciones que oscila entre 88.26% y 70.58% Resultando la variedad Criolla-A-2343 con daños que oscila entre 38.75 y 0%, la variedad Rev-84 con daños de 53.04% y 1.13% y la variedad Dor-364 con daños de 65.66% y 11.24%, lo cual indica que la variedad menos afectada es la Criolla-A-2343, seguido de la variedad Rev-84 y Dor-364. A pesar de que las variedades mejoradas presentan rendimientos superiores ocasionados por el BYMV. El periodo crítico para las variedades evaluadas comprende hasta la etapa V4 de manera general o sea 18 días después de la siembra. Desde el punto de vista del comportamiento individual de las variedades se definió el periodo crítico para las variedades Criolla-A-2343 y Rev-34 hasta la etapa V2, o sea 8 días después de la siembra, a la variedad Dor-364 se le determinó un periodo crítico hasta la etapa V3 equivalente a 13 días después de la siembra y a la variedad Criolla-A-1923 se le asignó hasta finales de la etapa V4 equivalente a 25 días después de siembra.

Determinación de daño y período crítico del virus del mosaico común del frijol (BCMV) en cuatro variedades de frijol común (Phaseolus vulgaris L.) en Nicaragua

Este ensayo experimental se realizó en época de postrera de 1992, en los terrenos del vivero de la Universidad Nacional Agraria, con el objetivo de determinar el daño causado por el virus del mosaico común del frijol BCMV y determinar el periodo critico necesario para proteger el cultivo. Las variedades que se utilizaron durante la investigación fueron DOR-364, REV-84, (variedades mejoradas) CA-2343 y CA-1923 (variedades criollas). La metodología usada fue inocular el virus mecánicamente, realizada en 4 momentos (Etapas fenológicas V2, V3, V4, R5). y un testigo sin inocular. Se realizaron observaciones de sistomatología desde la primera inoculación hasta la etapa de maduración fisiológica del cultivo. A partir de la cosecha se tomaron datos del número de vainas por planta, número de semillas por vainas y el peso de semillas por panta (gramos). Los resultados indican que la inoculación del BCMV efectuada en las diferentes etapas influyen sobre el daño en las plantas. Las plantas que fueron inoculadas en la primera etapa mostraron daños más severos y aquellas que se inocularon en la etapa R5 con daños menos severos. La variedad DOR-364 presentó daños por 7,5-36.1 %, la variedad REV-84 de 6-37.5%, la variedad CA-2343 de 8-35.1% y la variedad CA-1923 resultó con daños más severos siendo de 48.9-97.4%. En relación al período crítico las variedades DOR-364, REV-84 y CA-2343, el tiempo de protección requerido para reducir el daño fue de 13 días (Etapa V3) y para la variedad CA-1923 de 25 días (Etapa V2-R5)

Producción de plantas libres de virus y morfogénesis indirecta a partir del cultivo de meristemo de tres genotipos de quequisque (Xanthosoma saggittifolium (L) Schott

Se establecieron dos ensayos con el objetivo de determinar en que condición de cultivo se induce: 1) mayor cantidad de plantas libres del DMV diagnosticado con la prueba ELISA; 2) mayor cantidad de callos y plantas regeneradas a partir de callos en tres genotipos de quequisque. Ambos ensayos se iniciaron utilizando meristemos como explantes. Los ensayos se establecieron en esquema de diseño DCA bifactorial: a) genotipos de quequisque, Masaya (My), Nueva Guinea (NG) y Blanco (Bco); b) 5 variantes medios de cultivos. Se realizaron 3 pruebas ELISA a plantas de los tres genotipos que presentasen síntomas del DMV en el campo, a plantas del campo seleccionadas al azar y a plantas provenientes del cultivo de meristemos. En el ensayo de saneamiento del DMV se empleó en el medio MS suplido con combinaciones de AIA y 6-BAP, y para el ensayo de producción de callos se utilizaron combinaciones de 2,4-D y 6-BAP. La regeneración de plantas a partir de callos se logró en el medio MS sencillo. El desarrollo de los explantes en el primer ensayo se cuantificó utilizando escalas arbitrarias para el color y el crecimiento. En el segundo ensayo se utilizó una escala para medir el desarrollo. A los datos de cada variable se realizó un ANDEVA y la prueba de rangos múltiples Tukey, al α= 0.05, cuando hubo diferencias estadísticas entre tratamientos. Cien porciento de las muestras de hojas de plantas de los 3 genotipos que presentaban síntomas del DMV en el campo, resultaron positivas. Las plantas del campo de los genotipos My, NG y Bco elegidas al azar, registraron 88.32, 98.70 y el 90.00% de infección con el DMV; en cambio las plantas in vitro registraron 93.7, 100 y 100% libres de DMV en los mismos genotiposrespectivamente. A los 90 días de establecido el primer ensayo, el medio MS sin reguladores de crecimiento resultó estadísticamente superior con 84% de explantes creciendo y 8% plantas formadas. El medio MS + 1 mgl-16-BAP + 1 mgl-1 AIA registró los valores más discretos con 53% de explantes sin crecer y 41% plantas creciendo. El genotipo My fue superior en todos los medios con 90% de explantes creciendo y 7% plantas formadas. El genotipo Bco registró los más bajos valores con 58% de explantes sin crecer y 5% plantas formadas. Las variables color y crecimiento reportaron similar comportamiento. El medio de cultivo testigo fue estadísticamente superior con 64% de explantes color verde, 30% amarillo y 6% necróticos. El genotipo My sobresalió con 40% de explantes amarillos y 60% verdes. Los genotipos NG y Bco tuvieron comportamientos similares. En el ensayo de producción de callos, tres tratamientos resultaron estadísticamente superiores: el genotipo NG en el medio MS + 3 mgl-12,4-D (60% de explantes formando callos) y el genotipo Masaya en los medios MS+ 5 mg l-12,4-D y MS + 3 mg l-12,4-D (26.7 y 40% callos formados, respectivamente). No se registraron diferencias estadísticas entre los genotipos (16, 17 y 17% callos formados). El medio de cultivo MS + 3 mg l-12,4-D indujo la formación de 4% callos y 44% plantas. El medio de cultivo testigo (MS sin reguladores de crecimiento) resultó en 47% explantes sin crecer y ningún callo formado. Después de los 60 días del trasplante de los callos a un medio sin hormonas, los genotipos Masaya, Nueva Guinea y Blanco reportaron que el 94, 83 y 58 % regeneraron yemas respectivamente.

Evaluación de la eficacia de cinco bioplaguicidas sobre poblaciones de gusano cogollero (Spodoptera frugiperda J.E. Smith) y su efecto sobre el crecimiento y rendimiento en el cultivo de maiz (Zea mays L.)

Con el fin de evaluar la efectividad de cinco bioplaguicidas para el manejo del gusano cogollero (Spodoptera frugiperdaJ. E. Smith) en el cultivo de maíz, se estableció el presente ensayo en el Centro experimental de Campos Azules municipio de Masatepe, en época de primera del año 2003. Los bioplaguicidas evaluados corresponden a los nombres de Spintor, Dipel 8L, Dipel 6.4 WP, Dipel 2X, y VPN (Virus de la poliedrosis nuclear) junto a ellos se evaluó Cypermetrina como testigo químico y aplicación de agua como testigo absoluto. El genotipo utilizado fue la variedad NB-6. Los tratamientos fueron arreglados en diseño de bloques completos al azar con cuatro réplicas y las variables evaluadas fueron sometidas a análisis de varianza y separación múltiple de medias. Al evaluar el porcentaje de eficacia de los bioplaguicidas, los tratamientos Spintor y Dipel 6.4 WP mostraron los mayores promedios respectivamente en las dos evaluaciones realizadas presentando diferencias altamente significativas. El número de larvas por planta a los 33, 37, 44 y 51 días después de la siembra fue también altamente significativo. Para la variable altura de planta, se registraron diferencias estadísticas entre los tratamientos; a los 89 días después de la siembra, las plantas tratadas con Spintor presentaron la mayor altura promedio. En cuanto al rendimiento la diferencia entre los tratamientos fue altamente significativa obteniendo el mayor promedio el tratamiento con Spintor. No se observó diferencias significativas entre los tratamientos para las variables de mazorcas sanas, mazorcas podridas, mazorcas dañadas y peso de mil granos. En cuanto al análisis económico se demostró que económicamente el tratamiento con Spintor fue el más rentable presentando una taza de retorno marginal de 208.1 % con respecto al tratamiento con Cypermetrina (tratamiento tradicional) la cual fue de 741 %.

Comportamiento agronómico en vitroplantas sanas e infestadas con el virus del dasheen (DMV) en tres cultivares de quequisque (Xanthosomas spp.) en el CNIA-INTA, Managua

Con el objetivo de evaluar el comportamiento agronómico de vitroplantas de tres cultivaresde quequisque (Xanthosoma spp.) libres del virus DMV producidas a través del cultivo de meristemos, se estableció el ensayo en el CNIA-INTA (Centro Nacional de Investigación Agropecuaria–Instituto Nicaragüense de Tecnología Agropecuaria) en el departamento de Managua, entre los meses abril-diciembre del año 2004. Se evaluaron variables morfológicas: altura de la planta (cm), área foliar (cm²), diámetro del pseudotallo (cm) y número de hojas; de rendimiento: número de cormelos por planta, peso de cormelo (g), rendimiento (kg ha), diámetro de cormelo (cm) y largo de cormelo (cm) y la presencia del virus e insectos asociados al cultivo en los cultivares Masaya (MY), Nueva Guinea (NG) y Blanco (Bco). Se utilizó un diseño de arreglos en Parcelas Divididas conformado por tres bloques, en la parcela grande se ubicaron los cultivares y en las pequeñas la condición sanitaria (sana e infectada). Se realizó ANDEVA y la separación de medias de rangos múltiples de Tukey ( ∞ =0.05). Los cultivares y la condición sanitaria presentaron diferencias estadísticas entre ellas en las variables morfológicas, habiendo obtenido el cultivar NG los mayores promedios: altura de la planta con (64.23 cm ), área foliar con (1129 cm²), diámetro del pseudotallo con (4.68 cm) y número de hojas con (3.90 cm). El rendimiento presentó efecto significativo en las condiciones fitosanitarias, pero no en los cultivares e interacción. Se encontró tendencia al incremento del porcentaje de reinfección de plantas con presencia del DMV a través del tiempo, el cultivar Bco a los 192 dds reportó un máximo valor del (90 %), seguido de los cultivares MY (65 %) y NG (60 %). Las principales plagas asociadas a los cultivares de quequisque fueron del orden Diptera, Homoptera, Coleoptero, Heminoptero y Lepidoptero, considerándose al áfido Aphis gossypii del orden Homoptera como el posible vector del virus DMV.

Insecticides evaluated for control of fall armyworm (Lepidóptera: Noctuidae) on Sorghum)

El gusano cogollero [Spodoptera fnugiperda (J.E. Smith) (lnsecta: Lepidoptera: Noctuidae)], es uno de los principales insectos que afectan el cultivo de sorgo en El Salvador. En vista de lo anterior, durante los meses de septiembre de 2001 y enero de 2002, se realizó una investigación en la estación experimental dos del Centro Nacional de Tecnología Agropecuaria y Forestal (CENTA), ubicado en el valle de San Andrés, departamento de La Libertad. El objetivo de la investigación fue determinar la efectividad de productos químicos, botánicos y biológicos para el control del gusano cogollero. Se utilizó un diseño de bloques completos al azar, con nueve tratamientos y cuatro repeticiones. Los tratamientos fueron: insecticida botánico (Agrolnagor), Aceite de Nim, Beauveria bassiana, Virus de la Poliedrosis Nuclear (VPN), Lufenuron, Teflubanzuron, Agua azucarada, testigo relativo ( clorpirifos) y testigo absoluto (sin aplicación). Los datos de mortalidad se obtuvieron 24 horas y cuatro días después de las aplicaciones. Los resultados muestran diferencias significativas entre tratamientos en los porcentajes de mortalidad de la plaga. Los insecticidas inhibidores de la quitina, lufeneron y tetlubenzuron, mostraron mayor efectividad (superior al 90 por ciento) comparados con los otros tratamientos insecticidas, los cuales mostraron niveles de mortalidad interior al 65 por ciento cuatro días después de su aplicación. El porcentaje de mortalidad obtenido en parcelas tratadas con chlorpyrifos fue de 63.3 por ciento durante el primer muestreo. La mortalidad fue superior en larvas de los primeros estadios, comparada con larvas de los últimos estadios. Los tratamientos con Neem, productos biológicos (Beauveria bassiana y el virus de la poliedrosis nuclear) y agua azucarada presentaron los más bajos niveles de mortalidad. Hubo diferencias significativas en el rendimiento del cultivo, sin embargo, dichas diferencias no siempre estuvieron relacionadas a los niveles de mortalidad presentados por los tratamientos insecticidas.