Targeting the Transposase Domain of the DNA Repair Component Metnase to Enhance Chemotherapy

Previous studies have shown that the DNA repair component Metnase (SETMAR) mediates resistance to DNA damaging cancer chemotherapy. Metnase has a nuclease domain that shares homology with the Transposase family. We therefore virtually screened the tertiary Metnase structure against the 550,000 compound ChemDiv library to identify small molecules that might dock in the active site of the transposase nuclease domain of Metnase. We identified eight compounds as possible Metnase inhibitors. Interestingly, among these candidate inhibitors were quinolone antibiotics and HIV integrase inhibitors, which share common structural features. Previous reports have described possible activity of quinolones as antineoplastic agents. Therefore, we chose the quinolone ciprofloxacin for further study, based on its wide clinical availability and low toxicity. We found that ciprofloxacin inhibits the ability of Metnase to cleave DNA and inhibits Metnase-dependent DNA repair. Ciprofloxacin on its own did not induce DNA damage, but it did reduce repair of chemotherapy-induced DNA damage. Ciprofloxacin increased the sensitivity of cancer cell lines and a xenograft tumor model to clinically relevant chemotherapy. These studies provide a mechanism for the previously postulated antineoplastic activity of quinolones, and suggest that ciprofloxacin might be a simple yet effective adjunct to cancer chemotherapy. Cancer Res; 72(23); 6200-8. (C) 2012 AACR.

Antigenotoxic Effects of Piquia (Caryocar villosum) in Multiple Rat Organs

This study investigated the in vivo genotoxicity of piquia pulp (Caryocar villosum) and its potential antigenotoxicity on doxorubicin (DXR)-induced DNA damage by comet assay and micronucleus test. In addition, the phytochemicals present in piquia pulp were determined. Piquia fruit pulp (75, 150 or 300 mg/kg b.w.) was administered by gavage to Wistar rats for 14 days, and the animals received an injection of saline or DXR (15 mg/kg b.w., i.p.) 24 h before they were euthanized. The phytochemical analysis revealed the presence of carotenoids; phenolic compounds, including flavonoids; tannins and alpha-tocopherol in piquia pulp. No statistically significant differences were observed in the evaluated parameters, demonstrating the absence of cytotoxic and genotoxic effects of piquia pulp at all tested doses. In liver, kidney, cardiac and bone marrow cells, piquia significantly reduced the DNA damage induced by DXR. Our results showed that the lowest piquia dose caused the largest decrease in DNA damage and the highest dose caused the smallest decrease, demonstrating an inverse dose-response of piquia pulp. Furthermore, we observed a difference in the potential antigenotoxic effects in several tissues. In conclusion, our results demonstrated that piquia pulp was not genotoxic and inhibited the genotoxicity induced by DXR, but some of the protective effects that were observed depended on the doses and experimental conditions. Therefore, further investigations are needed to clarify how piquia pulp positively affects human health.

Characterization of anti-silencing factor 1 in Leishmania major

Anti-silencing factor 1 (ASF1) is a histone chaperone that contributes to the histone deposition during nucleosome assembly in newly replicated DNA. It is involved in chromatin disassembly, transcription activation and in the cellular response to DNA damage. In Leishmania major the ASF1 gene (LmASF1) is located in chromosome 20 and codes for a protein showing 67% of identity with the Trypanosoma brucei TbASF1a. Compared to orthologous proteins, LmASF1 conserves the main residues relevant for its various biological functions. To study ASF1 in Leishmania we generated a mutant overexpressing LmASF1 in L. major. We observed that the excess of LmASF1 impaired promastigotes growth rates and had no impact on cell cycle progress. Differently from yeast, ASF1 overproduction in Leishmania did not affect expression levels of genes located on telomeres, but led to an upregulation of proteins involved in chromatin remodelling and physiological stress, such as heat shock proteins, oxidoreductase activity and proteolysis. In addition, we observed that LmASF1 mutant is more susceptible to the DNA damaging agent, methyl methane sulphonate, than the control line. Therefore, our study suggests that ASF1 from Leishmania pertains to the chromatin remodelling machinery of the parasite and acts on its response to DNA damage.

DNA Dosimetry Assessment for Sunscreen Genotoxic Photoprotection

Background: Due to the increase of solar ultraviolet radiation (UV) incidence over the last few decades, the use of sunscreen has been widely adopted for skin protection. However, considering the high efficiency of sunlight-induced DNA lesions, it is critical to improve upon the current approaches that are used to evaluate protection factors. An alternative approach to evaluate the photoprotection provided by sunscreens against daily UV radiation-induced DNA damage is provided by the systematic use of a DNA dosimeter. Methodology/Principal Findings: The Sun Protection Factor for DNA (DNA-SPF) is calculated by using specific DNA repair enzymes, and it is defined as the capacity for inhibiting the generation of cyclobutane pyrimidine dimers (CPD) and oxidised DNA bases compared with unprotected control samples. Five different commercial brands of sunscreen were initially evaluated, and further studies extended the analysis to include 17 other products representing various formulations and Sun Protection Factors (SPF). Overall, all of the commercial brands of SPF 30 sunscreens provided sufficient protection against simulated sunlight genotoxicity. In addition, this DNA biosensor was useful for rapidly screening the biological protection properties of the various sunscreen formulations. Conclusions/Significance: The application of the DNA dosimeter is demonstrated as an alternative, complementary, and reliable method for the quantification of sunscreen photoprotection at the level of DNA damage.

Genome analysis of DNA repair genes in the alpha proteobacterium Caulobacter crescentus

Abstract Background The integrity of DNA molecules is fundamental for maintaining life. The DNA repair proteins protect organisms against genetic damage, by removal of DNA lesions or helping to tolerate them. DNA repair genes are best known from the gamma-proteobacterium Escherichia coli, which is the most understood bacterial model. However, genome sequencing raises questions regarding uniformity and ubiquity of these DNA repair genes and pathways, reinforcing the need for identifying genes and proteins, which may respond to DNA damage in other bacteria. Results In this study, we employed a bioinformatic approach, to analyse and describe the open reading frames potentially related to DNA repair from the genome of the alpha-proteobacterium Caulobacter crescentus. This was performed by comparison with known DNA repair related genes found in public databases. As expected, although C. crescentus and E. coli bacteria belong to separate phylogenetic groups, many of their DNA repair genes are very similar. However, some important DNA repair genes are absent in the C. crescentus genome and other interesting functionally related gene duplications are present, which do not occur in E. coli. These include DNA ligases, exonuclease III (xthA), endonuclease III (nth), O6-methylguanine-DNA methyltransferase (ada gene), photolyase-like genes, and uracil-DNA-glycosylases. On the other hand, the genes imuA and imuB, which are involved in DNA damage induced mutagenesis, have recently been described in C. crescentus, but are absent in E. coli. Particularly interesting are the potential atypical phylogeny of one of the photolyase genes in alpha-proteobacteria, indicating an origin by horizontal transfer, and the duplication of the Ada orthologs, which have diverse structural configurations, including one that is still unique for C. crescentus. Conclusion The absence and the presence of certain genes are discussed and predictions are made considering the particular aspects of the C. crescentus among other known DNA repair pathways. The observed differences enlarge what is known for DNA repair in the Bacterial world, and provide a useful framework for further experimental studies in this organism.

Bedeutung endogener Faktoren f��r Steady-State-Level und Reparatur oxidativer DNA-Modifikationen in S��ugerzellen

Die endogene Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) - wie beispielsweise Hydroxyl-Radikale, Superoxid-Radikalanionen, Wasserstoffperoxid und Singulett-Sauerstoff - bei essentiellen Stoffwechselreaktionen in allen aeroben Lebewesen stellt eine potentielle Gefahr f��r die Integrit��t der DNA in jeder Zelle dar. ROS generieren in der DNA unter anderem oxidative DNA-Modifikationen (zum gr����ten Teil wahrscheinlich 8-Hydroxyguanin (8-oxoG)), welche wiederum zu einem Teil zu Mutationen f��hren.In dieser Arbeit wurden Untersuchungen vorgenommen, in welchem Ausma�� zum einen die Steady-State-Level oxidativer DNA-Sch��den in S��ugerzellen zum anderen die Reparaturgeschwindig-keiten solcher DNA-Modifikationen durch verschiedene endogene Faktoren beeinflu��t werden.Im Mittelpunkt der Arbeit stand dabei die Charakterisierung der 8-Hydroxyguaninglykosylase der S��ugerzellen. Sie ist das Produkt des OGG1-Gens, das erst 1997 kloniert wurde. In transfizierten Zellinien konnte durch eine konstitutive ��berexpression des menschlichen OGG1-Gens demonstriert werden, da�� die Reparatur von induzierten oxidativen Basenmodifikationen bis zu dreifach beschleunigt wird und da�� eine Korrelation zwischen dem Grad der ��berexpression und der Reparaturrate besteht. Dagegen waren die Steady-State-Level der oxidativen DNA-Sch��den durch die ��berexpression unbeeinflu��t. Sowohl bei den spontanen Mutationsraten als auch bei den durch oxidative Sch��digungen induzierten Mutationsfrequenzen konnte keine Erniedrigung bedingt durch die hOGG1-��berexpression beobachtet werden.Weitere Untersuchungen zur Bedeutung von Ogg1-Protein konnten in M��usezellen durchgef��hrt werden, in denen das OGG1-homologe M��usegen, mOGG1, homozygot inaktiviert (mOGG1(-/-)) worden war. Hierbei konnte gezeigt werden, da�� in den mOGG1-defizienten Zellen im Vergleich zu den entsprechenden Wildtyp-Zellen (mOGG1(+/+)) eine Reparatur induzierter oxidativer Basenmodifikationen erst nach 8 h einsetzt, w��hrend in den Kontrollzellen schon nach 3-4 h 50 % der Modifikationen repariert waren. Die Steady-State-Level oxidativer Modifikationen in mOGG1(-/-)-Zellen waren in immortalisierten, schnell proliferierenden M��usefibroblasten nur um den Faktor 1.4, in prim��ren M��usehepatocyten jedoch um den Faktor 2.5 gegen��ber den Wildtyp-Zellen erh��ht.Inwieweit das menschliche Reparaturprotein Xrcc1 (X-ray repair cross complementing group 1) auch an der Prozessierung oxidativer DNA-Modifikationen beteiligt ist, und ob dabei m��glicherweise eine Interaktion mit Ogg1 vorliegt, wurde in der XRCC1-defizienten CHO-Zellinie EM9 untersucht. Dabei wurde ermittelt, da�� weder die Steady-State-Level noch die Reparaturkinetiken der oxidativen Basenmodifikationen durch die XRCC1-Defizienz beeinflu��t werden. Aufgrund weiterer Ergebnisse kann jedoch nicht ausgeschlossen werden, da�� das Xrcc1-Protein zumindest am Ligationsschritt w��hrend der Reparatur oxidativer DNA-Sch��den beteiligt ist.In einem weiteren Schwerpunkt der Arbeit wurde untersucht, ob Unterschiede im Steady-State-Level in Abh��ngigkeit von Organ-, Gewebe- und Zelltyp auftreten. Dazu wurden Untersuchungen in Bronchialkarzinom-Zellinien verschiedener Subtypen durchgef��hrt. Des weiteren wurde zur Frage der Zelltyp-Abh��ngigkeit in der menschlichen Zellinie HL60 der Einflu�� des Zelldifferenzierungsstadiums auf die Steady-State-Level untersucht.

Einfluss von Stickstoffmonoxid, Hydroxylradikalen und Peroxynitrit auf DNA-Sch��den, DNA-Reparatur und Mutationen

Im Rahmen dieser Arbeit wurde untersucht ��ber welche Mechanismen und unter welchen Bedingungen Stickstoffmonoxid (NO) und verwandte reaktive Spezies wie Peroxynitrit und Hydroxylradikale zur Krebsentstehung beitragen k��nnen. NO f��hrte an zellfreier DNA kaum zu oxidativen DNA-Sch��den. Peroxynitrit, generiert aus 3-Morpholinosydnonimin (SIN-1), induzierte neben Einzel-strangbr��chen und AP-L��sionen vor allem oxidierte Purinmodifikationen (50 % 8-Hydroxyguanin (8-oxoG)). Hydroxylradikale, freigesetzt aus 4-Hydroxypyridinthion, induzierten neben Einzelstrangbr��chen und AP-L��sionen oxidierte Pyrimidinmodifikationen in der DNA. Nach Transformation und Replikation der gesch��digten DNA in E. coli DT-2 wurden ��berwiegend GC nach AT Transitionen (Hydroxylradikalsch��digung), wahrscheinlich verursacht durch das in der DNA induzierte 5-Hydroxycytidin, bzw. GC nach TA Transversionen (Peroxynitrit), verursacht durch das induzierte 8-oxoG, detektiert. In Zellkulturexperimenten f��hrte endogenes NO, freigesetzt von B6-INOS-Zellen (8��M) nicht zu einem Anstieg der Gleichgewichtsspiegel oxidativer DNA-Sch��den, hatte keinen Einfluss auf deren Induzierbarkeit und Reparatur, die Zellpro-liferation und den Glutathionspiegel, sch��tzte jedoch vor der Induktion von Einzelstrangbr��chen und Mikrokernen durch Wasserstoffperoxid. Exogenes NO, freigesetzt durch den Zerfall von Dipropylentriamin-NONOat, hemmte in Konzentrationen ab 0,5 mM spezifisch die Reparatur oxidativer DNA-Sch��den, nicht jedoch die von Pyrimidindimeren, AP-L��sionen und Einzelstrangbr��chen,und f��hrte in Konzentrationen > 1 mM zu einer Induktion von DNA-Sch��den in den B6-Mausfibroblasten. Dabei ��hnelte das induzierte Schadensprofil sehr dem von SIN-1.

Transcriptional functions of DNA Topoisomerases at a genome-wide scale and a single gene levels

The DNA topology is an important modifier of DNA functions. Torsional stress is generated when right handed DNA is either over- or underwound, producing structural deformations which drive or are driven by processes such as replication, transcription, recombination and repair. DNA topoisomerases are molecular machines that regulate the topological state of the DNA in the cell. These enzymes accomplish this task by either passing one strand of the DNA through a break in the opposing strand or by passing a region of the duplex from the same or a different molecule through a double-stranded cut generated in the DNA. Because of their ability to cut one or two strands of DNA they are also target for some of the most successful anticancer drugs used in standard combination therapies of human cancers. An effective anticancer drug is Camptothecin (CPT) that specifically targets DNA topoisomerase 1 (TOP 1). The research project of the present thesis has been focused on the role of human TOP 1 during transcription and on the transcriptional consequences associated with TOP 1 inhibition by CPT in human cell lines. Previous findings demonstrate that TOP 1 inhibition by CPT perturbs RNA polymerase (RNAP II) density at promoters and along transcribed genes suggesting an involvement of TOP 1 in RNAP II promoter proximal pausing site. Within the transcription cycle, promoter pausing is a fundamental step the importance of which has been well established as a means of coupling elongation to RNA maturation. By measuring nascent RNA transcripts bound to chromatin, we demonstrated that TOP 1 inhibition by CPT can enhance RNAP II escape from promoter proximal pausing site of the human Hypoxia Inducible Factor 1��� (HIF-1���) and c-MYC genes in a dose dependent manner. This effect is dependent from Cdk7/Cdk9 activities since it can be reversed by the kinases inhibitor DRB. Since CPT affects RNAP II by promoting the hyperphosphorylation of its Rpb1 subunit the findings suggest that TOP 1inhibition by CPT may increase the activity of Cdks which in turn phosphorylate the Rpb1 subunit of RNAP II enhancing its escape from pausing. Interestingly, the transcriptional consequences of CPT induced topological stress are wider than expected. CPT increased co-transcriptional splicing of exon1 and 2 and markedly affected alternative splicing at exon 11. Surprisingly despite its well-established transcription inhibitory activity, CPT can trigger the production of a novel long RNA (5���aHIF-1���) antisense to the human HIF-1��� mRNA and a known antisense RNA at the 3��� end of the gene, while decreasing mRNA levels. The effects require TOP 1 and are independent from CPT induced DNA damage. Thus, when the supercoiling imbalance promoted by CPT occurs at promoter, it may trigger deregulation of the RNAP II pausing, increased chromatin accessibility and activation/derepression of antisense transcripts in a Cdks dependent manner. A changed balance of antisense transcripts and mRNAs may regulate the activity of HIF-1��� and contribute to the control of tumor progression After focusing our TOP 1 investigations at a single gene level, we have extended the study to the whole genome by developing the ���Topo-Seq��� approach which generates a map of genome-wide distribution of sites of TOP 1 activity sites in human cells. The preliminary data revealed that TOP 1 preferentially localizes at intragenic regions and in particular at 5��� and 3��� ends of genes. Surprisingly upon TOP 1 downregulation, which impairs protein expression by 80%, TOP 1 molecules are mostly localized around 3��� ends of genes, thus suggesting that its activity is essential at these regions and can be compensate at 5��� ends. The developed procedure is a pioneer tool for the detection of TOP 1 cleavage sites across the genome and can open the way to further investigations of the enzyme roles in different nuclear processes.

Untersuchungen zur Beeinflussung der Reparatur oxidativer DNA-Sch��den durch Poly(ADP-Ribose)-Polymerase, AP-Endonuklease 1 und das Xeroderma pigmentosum A Protein

Gegenstand dieser Arbeit war die Untersuchung der Bedeutung der Poly(ADP-Ribose)-Polymerase 1 (PARP 1), der AP Endonuklease 1 (Ape 1) und des Xeroderma pigmentosum A (XPA) Proteins f��r die DNA-Reparatur in S��ugerzellen.Zun��chst wurde der Einfluss der PARP 1-Aktivit��t auf die Reparatur verschiedener DNA-Modifikationen untersucht. Die Ergebnisse zeigen erstmalig, dass eine Hemmung der PARP-Aktivit��t nicht nur eine deutliche Verlangsamung der Reparatur von Einzelstrangbr��chen, sondern auch von oxidativen Purinmodifikationen und Pyrimidindimeren zur Folge hat. Interessanterweise erfolgte diese Verlangsamung der DNA-Reparatur nicht in Csb-defizienten Zellen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Aktivierung der PARP 1 und das Csb-Protein zusammen an einem neuartigen Mechanismus beteiligt sind, der die globale Reparatur verschiedener DNA-Modifikationen beschleunigt.Weiterhin wurde die Bedeutung der Nukleotidexcisionsreparatur als back-up Reparatur von 8 Hydroxyguanin untersucht. Dazu wurden normale und XPA-defiziente Fibroblasten des Menschen mit einem hOgg1-anitsense Konstrukt transfiziert und dann in diesen Zellen die Reparaturkinetiken oxidativer Basenmodifikationen bestimmt. Dadurch konnte eine Beteiligung des XPA-Proteins an diesem Reparaturweg ausgeschlossen werden.Au��erdem wurden die Auswirkungen einer AP Endonuklease-1-��berexpression in XRCC1-defizienten Zellen auf die Reparatur von Einzelstrangbr��chen untersucht. Die Reparatur der induzierten Einzelstrangbr��che war in XRCC1-defizienten Zellen erwartungsgem���� deutlich langsamer als in XRCC1-profizienten Zellen. Die ��berexpression der AP Endonuklease 1 in XRCC1-defizienten Zellen f��hrte zu einer teilweisen Beschleunigung der Einzelstrangbruchreparatur.

Endogene DNA-Sch��digung als Ursache genetischer Instabilit��t

Zusammenfassung Diese Arbeit beschreibt Untersuchungen ��ber die zellul��ren Mechanismen, die zur Bildung dieser DNA-Sch��den f��hren, sowie ��ber die biologischen Auswirkungen dieser Sch��den. Die Untersuchungen zu Uracil in der DNA wurden in ung-knockout-MEFs und M��usen durchgef��hrt, die es erlauben, die Konsequenzen eines Ausfalls der wichtigsten Reparaturglykosylase f��r Uracil zu beleuchten. Die Ergebnisse zeigen eine deutliche Akkumulation von Uracil in den ung-/--Mausfibroblasten im Vergleich zum Wildtyp. In frisch isolierten Leber- und Milzzellen der M��use konnte dieser genotypspezifische Unterschied, wenn auch weniger ausgepr��gt, ebenso beobachtet werden, nicht jedoch in reifen Spermien. Dieser gewebespezifische Unterschied und die quantitativ st��rker ausgepr��gte Akkumulation in ung-/--Mausfibroblasten im Vergleich zu den M��usegeweben gab Anlass zur Vermutung, dass die Proliferation der Zellen f��r den Haupteintrag an Uracil in die DNA verantwortlich ist. Erstmals konnte in Versuche mit konfluenten (nicht mehr proliferierenden) ung-/--Mausfibroblasten gezeigt werden, dass nicht die spontane hydrolytische Desaminierung von Cytosin, sondern der Fehleinbau von dUMP w��hrend der DNA-Replikation die Hauptquelle f��r Uracil in der DNA von S��ugerzellen darstellt. Da der Uracilmetabolismus ein wichtiges Target in der Chemotherapie ist, lag es nahe, das zur Verf��gung stehende ung-knockout-Modell der MEFs zur Untersuchung mit Fluorpyrimidinen, die als Zytostatika verwendet werden, einzusetzen. Da bisher die Ursachen der beobachteten Apoptose der Tumorzellen und aller anderen metabolisch hochaktiven Zellen eines behandelten Organismus noch nicht vollst��ndig verstanden ist, wurden diese Zellen mit verschiedenen Fluorpyrimidinen behandelt, die als Thymidylatsynthasehemmer die de novo Synthese von Thymidin unterbinden. Es konnte gezeigt werden, dass ung-/- Mausfibroblasten, im Gegensatz zu ung+/+ Mausfibroblasten, verst��rkt Uracil in der DNA akkumulieren. Obwohl die ung+/+ Mausfibroblasten keine erh��hten Uracil-Spiegel in der DNA aufwiesen, zeigten sie bei Inkubation mit einem der beiden Thymidylatsynthasehemmern, 5-Fluoruracil (5-FU), die gleiche Sensitivit��t in einem nachfolgenden Proliferationsversuch wie die ung-/- Mausfibroblasten. Dies l��sst darauf schlie��en, dass weder Reparatur noch Einbau von Uracil in die DNA f��r die beobachtete Toxizit��t dieser Zytostatika notwendig sind. Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit war die Untersuchung des DNA-sch��digenden Potenzials endogener ROS, die aus dem Fremdstoffmetabolismus stammen. Dazu wurden V79-Zellen verwendet, die mit dem humanen Enzym Cytochrom 2E1 (CYP2E1) transfiziert wurden (V79 CYP2E1) sowie Zellen, die ebenfalls durch Transfektion das humane Enzym Cytochromreduktase (auch Oxidoreduktase genannt) ��berexprimieren (V79 hOR). Beide Enzyme sind zusammen an der Hydroxylierung von Fremdstoffen beteiligt, bei der die Reduktion von molekularem Sauerstoff durch ��bertragung von zwei Elektronen notwendig ist. Wird anstatt zweier Elektronen in Folge nur eines auf den Sauerstoff ��bertragen, so f��hrt dieser von der Substratoxygenierung enkoppelte Vorgang zur Bildung von Superoxid. Daher galt es zu kl��ren, ob das so erzeugte Superoxid und daraus gebildete ROS in der Lage sind, die DNA zu sch��digen. Es konnte gezeigt werden, dass die ��berexpression von CYP2E1 nicht zu einem erh��hten basalen Gleichgewichtsspiegel oxidativer DNA-Sch��den f��hrt und die Metabolisierung von Ethanol durch dieses Enzym ebenfalls keine DNA-Modifikationen verursacht. Die ��berexpression der Cytochromreduktase hingegen f��hrte gegen��ber dem Wildtyp zu einem erh��hten basalen Gleichgewichtsspiegel oxidativer Basenmodifikationen nach Depletion von Glutathion, einem wichtigen zellul��ren Antioxidans. Im Mikrokerntest, der gentoxische Ereignisse wie Chromosomenbr��che in Zellen aufzeigt, zeigte sich schon ohne Glutathion-Depletion eine doppelt so hohe Mikrokernrate im Vergleich zum Wildtyp. In weiteren Versuchen wurden die V79-hOR-Zellen mit dem chinoiden Redoxcycler Durochinon inkubiert, um zu untersuchen, ob das vermutlich durch die Reduktase vermittelte Redoxcycling ��ber Generierung von ROS in der Lage ist, einen oxidativen DNA-Schaden und Toxizit��t zu verursachen. Hier zeigte sich, dass die ��berexpression der Reduktase Voraussetzung f��r Toxizit��t und den beobachteten DNA-Schaden ist. Die Wildtyp-Zellen zeigten weder einen DNA-Schaden noch Zytotoxizit��t, auch eine zus��tzliche Glutathion-Depletion ��nderte nichts an dem Befund. Die V79-hOR-Zellen hingegen reagierten auf die Inkubation mit Durochinon mit einer konzentrationsabh��ngigen Zunahme der Einzelstrangbr��che und oxidativen Basenmodifikationen, wobei sich der DNA-Schaden durch vorherige Glutathion-Depletion verdoppeln lie��.

Untersuchungen zum Mechanismus der zellul��ren und zellfreien DNA-Sch��digung durch photosensibilisierende Arzneistoffe

Einige Arzneistoffe verursachen unter dem Einfluss von Sonnenlichtstrahlung folgenschwere Hautver��nderungen. In der Arbeit wurden f��r sechs Photosensibilisatoren erstmals ���Fingerabdr��cke��� des zellfreien und zellul��ren photoinduzierten DNA Schadens in Form von Schadensprofilen erstellt. Untersucht wurden das Phenothiazin Chlorpromazin, sowie dessen Derivate 2-Hydroxypromazin, Chlorpromazinsulfoxid und Promazin; die Fluorchinolone Ciprofloxacin und Lomefloxacin; sowie Doxycyclin und Methylenblau unter Bestrahlung mit k��nstlich erzeugtem Sonnenlicht. Neben Strangbr��chen in der DNA konnten durch den Einsatz von spezifischen DNA-Reparaturendonukleasen als Sonden die Mengen an oxidativen Purinmodifikationen, oxidative Pyrimidinmodifikationen und abasische Stellen bestimmt werden. Durch Verwendung von modulierenden Zus��tzen wurde die Beteiligung von reaktiven Sauerstoffspezies ��berpr��ft. Besonders bei den Phenothiazinen zeigten sich Besonderheiten hinsichtlich der DNA-Sch��digung. Promazin induziert unter Photoaktivierung, vermutlich ��ber einen reduktiven Angriff an der DNA, eine hohe Anzahl sonst selten beobachteter L��sionen, n��mlich abasischen Stellen und Dihydropyrimidine. Photoaktiviertes Chlorpromazin konnte in Zellen unerwarteterweise wahrscheinlich ��ber die Reaktion von Photolyseprodukten mit einem endogenen Chromophor sonnenlichtinduzierte oxidative DNA-Modifikationen verhindern. Eine Sch��digung zellfreier DNA fand nur statt, wenn der Photosensibilisator im ��berschuss gegen��ber den DNA-Basenpaaren vorlag, vermutlich weil ansonsten die Photolyse des Chlorpromazins durch Interkalation in die DNA verhindert wurde. Fluorchinolone zeigten eine starke Generierung von DNA-Strangbr��chen in Zellen, welche m��glicherweise auf photoinduzierte Reaktionen der Arzneistoffe mit der eukaryotischen Topoisomerase zur��ckzuf��hren ist. Die Korrelation der gemessenen DNA-Sch��den mit der Mikrokerninduktion f��hrte zu der Annahme, dass besonders abasische Stellen bei der Entstehung von Mikrokernen eine Rolle spielen k��nnten.

Generierung und Prozessierung oxidativer DNA-Sch��den

Generierung und Prozessierung oxidativer DNA Sch��den --- Ziel dieser Arbeit war es, adaptive Antworten der Zellen auf einen DNA Sch��digung zu untersuchen. Hierzu wurden Experimente zur Reparatur oxidierter Basen (Substrate der Basen Exzisions Reparatur (BER)) oder von Pyrimidindimeren (Substrate der Nukleotid Exzisions Reparatur (NER)) nach einer Vorbehandlung mit DNA-sch��digender Agenzien durchgef��hrt. Die Ergebnisse zeigten, dass sowohl eine Vorbehandlung mit einer alkylierenden als auch mit einer oxidierenden Substanz zu einer adaptiven Erh��hung des zellul��ren Glutathionspiegels f��hrte, die 16 h nach der Sch��digung ihr Maximum erreichte. Jedoch waren die 8-oxoG Glykosylaseaktivit��ten ��ber einen Zeitraum von 18 h konstant. Diese Effekte waren unabh��ngig davon, ob Maus Embryofibroblasten, prim��re oder p53 profiziente menschliche Zellen verwendet wurden. Die BER war ebenfalls in keiner der verschiedenen Zelllinien signifikant verbessert. Die adaptive Antwort bez��glich der Glutathionspiegel war also nicht mit einer entsprechenden Ver��nderung bei der DNA-Reparatur verbunden. Folglich ist die Reparatur von oxidativen DNA-Sch��den durch eine vorausgehende Sch��digung nicht induzierbar. Der zweite Teil der Untersuchungen zu der Reparatur besch��ftigte sich mit der NER. Hierzu wurde die Reaktivierung eines mit UVB-Strahlung gesch��digten Plasmids untersucht. Als Wirtszellen fungierten prim��re menschliche Fibroblasten und Keratinozyten, die entweder mit UVB vorbehandelt oder ungesch��digt waren. Auch f��r die NER konnte keine signifikante Beschleunigung der Reparatur von Pyrimidindimeren durch eine Vorbehandlung festgestellt werden. Die Reaktivierung erfolgte ferner unabh��ngig vom p53-Status der Zellen, wie Versuche mit p53-siRNA zeigten. Neben der Prozessierung war die Generierung oxidativer DNA Sch��den Gegenstand der Arbeit. Die verwendete Substanz Tirapazamin (TPZ) ist ein f��r hypoxische Zellen selektives, neues Zytostatikum und befindet sich momentan in Phase 2/3 der klinischen Pr��fung. Ziel war es die von TPZ verursachten DNA Modifikationen zu charakterisieren, sowie die Toxizit��t und Genotoxizit��t zu untersuchen. Da es Hinweise auf eine Aktivierung von TPZ ��ber eine Oxidoreduktase (OR) gab, wurden die Experimente in Wildtyp und hOR ��berexprimierenden Zellen durchgef��hrt. Die Quantifizierung der verursachten DNA-Modifikationen zeigte, dass der von TPZ verursachte Schaden in Zellen mit hOR erh��ht war. Das erhaltene Schadensprofil der durch TPZ verursachten DNA-Modifikationen war dem Schadensprofil von durch Gamma-Strahlung intrazellul��r verursachten Hydroxylradikalen sehr ��hnlich. Da es nach der Aktivierung von TPZ durch eine OR zu einer Abspaltung von Hydroxylradikalen kommt, best��tigte dies den vermuteten Mechanismus. Weitere Untersuchungen mit t-Butanol, einem Hydroxylradikal F��nger, ergaben eine verminderte DNA-Sch��digung, was ebenfalls f��r eine DNA-Sch��digung durch Hydroxylradikale spricht. Untersuchungen zur Mutagenit��t zeigten das die Mutationsrate in Zellen mit hOR um das 4 fache erh��ht ist. Erstaunlich war jedoch, dass der im gleichen Ausma�� von Gamma-Strahlung verursachte DNA-Schaden f��r die beobachtete Toxizit��t dieser verantwortlich war, w��hrend bei TPZ unter den gleichen Bedingungen keine Toxizit��t vorlag. Erkl��rt werden k��nnte die erh��hte Toxizit��t und Mutagenit��t durch so genannte geclusterte DNA-Sch��den, die von Gamma-Strahlen, nicht jedoch von TPZ gebildet werden. Nach einer verl��ngerten Inkubation wurde sowohl f��r die Toxizit��t als auch f��r die Genotoxizit��t erneut ein verst��rkender Effekt durch die OR best��tigt. ��berraschend war weiterhin die von der OR unabh��ngige Generierung von Doppelstrangbr��chen, f��r die demnach ein grunds��tzlich anderer Mechanismus, wie zum Beispiel eine direkte Interaktion mit der Topoisomerase II, angenommen werden muss.

Modulation der Genexpression und des neuronalen Zelltods durch das Amyloid-Vorl��ufer-Protein (APP)

Das Amyloid-Vorl��ufer-Protein (APP) spielt eine zentrale Rolle in der Entstehung und Entwicklung von Morbus Alzheimer. Hierbei ist die proteolytische Prozessierung von APP von entscheidender Bedeutung. Das Verh��ltnis von neurotoxischen und neuroprotektiven Spaltprodukten, die ��ber den amyloidogenen und nicht-amyloidogenen Weg der APP-Prozessierung gebildeten werden, ist f��r das ��berleben von Neuronen und deren Resistenz gegen zytotoxische Stress-Stimuli von hoher Relevanz. St��rungen der Calcium-Hom��ostase sind ein bekanntes Ph��nomen bei Morbus Alzheimer. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle von ��berexprimiertem APP in der Regulation des neuronalen Zelltods nach Calcium Freisetzung untersucht. Die Calcium Freisetzung aus dem endoplasmatischen Retikulum wurde durch die Inhibition der sarko- und endoplasmatischen Calcium-ATPasen (SERCA) ausgel��st. Dies f��hrt zur Induktion der sogenannten ���unfolded protein response��� (UPR) und zu einer Aktivierung von Effektor-Caspasen. F��r APP-��berexprimierende PC12 Zellen konnte bereits zuvor eine im Vergleich zur Kontrolle nach der durch Calcium Freisetzung-induzierten Apoptose eine erh��hte intrazellul��re Calcium Konzentration nachgewiesen werden. ��ber die Messung der Aktivierung von Effektor-Caspasen konnte zudem ein gesteigerter Zelltod in den APP-��berexprimierenden Zellen gemessen werden. Zudem konnte gezeigt werden, dass der pro-apoptotische Transkriptionsfaktor CHOP, nicht aber die klassischen UPR-Zielgene spezifisch hochreguliert wurden. Die APP-modulierte gesteigerte Induktion von Apoptose nach Calcium Freisezung konnte durch Komplexierung der intrazellul��ren Calcium Ionen und durch Knockdown von CHOP im Vergleich zur Kontrolle g��nzlich unterdr��ckt werden. Ferner bewirkte die Inhibition der Speicher-aktivierten Calcium-Kan��len (SOCC) eine signifikante Unterdr��ckung der beobachteten erh��hten intrazellul��ren Calcium Konzentration und der gesteigerten Apoptose in den APP-��berexprimierenden PC12 Zellen. In diesem Teil der Arbeit konnte eindeutig gezeigt werden, dass APP in der Lage ist den durch Calcium-Freisetzung-induzierten Zelltod zu potenzieren. Diese Modulation durch APP verl��uft in einer UPR-unabh��ngigen Reaktion ��ber die Aktivierung von SOCC���s, einer erh��hten Aufnahme von extrazellul��rem Calcium und durch erh��hte Induktion des pro-apoptotischen Transkriptionsfaktors CHOP. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die sAPP��-vermittelte Neuroprotektion untersucht. Dabei handelt es sich um die N-terminale Ektodom��ne von APP, die ��ber die Aktivit��t der ��-Sekretase prozessiert wird und anschlie��end extrazellul��r abgegeben wird. Ziel dieser Versuchsreihe war die neuroprotektive physiologische Funktion von APP im Hinblick auf den Schutz von neuronalen Zellen vor diversen f��r Morbus Alzheimer relevanten Stress-Stimuli bzw. Apoptose-Stimuli zu untersuchen. Durch die Analyse der Effektor-Caspasen konnte gezeigt werden, dass sAPP�� in der Lage ist PC12 Zellen potent vor oxidativem Stress, DNA-Sch��den, Hypoxie, proteasomalem Stress und Calcium-Freisetzung zu sch��tzen. Au��erdem konnte gezeigt werden, dass sAPP�� in der Lage ist den pro-apoptotischen Stress-induzierten JNK/Akt-Signalweg zu inhibieren. Eine Beteiligung des anti-apoptotischen PI3K/Akt-Signalwegs bei der sAPP��-vermittelten Protektion konnte ��ber die Inhibition der PI3-Kinase ebenfalls demonstriert werden, die eine Aufhebung der sAPP��-vermittelten Neuroprotektion bewirkte. Diese Daten zeigen neue molekulare Mechanismen auf, die dem sAPP��-vermittelten Schutz vor pathophysiologisch relevanten Stress-Stimuli in neuronalen Zellen zugrunde liegen. Im letzten Teil der Arbeit wurden verschieden Gruppen von pharmakologischen Substanzen im Hinblick auf ihre neuroprotektive Wirkung untersucht und mit ihren Effekten auf den APP-Metabolismus korreliert. Die Untersuchungen ergaben, dass Galantamin, ein schwacher Acetycholinesterase Inhibitor und allosterisch potenzierender Ligand von nikotinischen Acetylcholin-Rezeptoren in der Lage war, naive, und mit noch h��herer Effizienz APP-��berexprimierende Zelllinien vor dem Stress-induzierten Zelltod zu sch��tzen. Zudem bewirkte Galantamin in APP-��berexprimierenden HEK293 Zellen eine rasche Erh��hung der sAPP�� Sekretion, so dass hier von einer Rezeptor-vermittelten Modulation des APP Metabolismus ausgegangen werden kann. Omega-3 Fetts��uren wirken sich positiv auf die Membranfluidit��t von Zellen aus und es konnte bereits gezeigt werden, dass die Bildung des toxischen A�� Peptids hierdurch vermindert wird. In Analogie zu Galantamin sch��tzte die Omega-3 Fetts��ure Docosahexaens��ure (DHA) neuronale Zellen vor dem Stress-induzierten Zelltod, wobei der Schutz in APP-��berexprimierenden Zellen besonders effizient war. Diese Daten legen nahe, dass die Aktivierung des antiamyloidogenen Wegs der APP-Prozessierung ein viel versprechender Ansatz f��r die Entwicklung neuer Therapien gegen Morbus Alzheimer sein k��nnte.

Bedeutung von Rho-GTPasen bei der Regulation zellul��rer Antworten auf genotoxischen Stress

SAPK/JNK regulieren nach genotoxischem Stress eine Vielzahl von Zielsubstraten, die bedeutsam f��r Reparatur und ��berleben der Zelle sind, somit nehmen sie Einfluss auf das zellul��re Schicksal der Zelle. Ob DNA-Sch��den eine Phosphorylierung von Stress-Kinasen nach sich ziehen ist bisher noch wenig untersucht. Mit reparaturdefizienten Zellen wurde der Einfluss von DNA-Sch��den, durch Cisplatin/Transplatin/UV-C, auf die SAPK/JNK Aktivierung untersucht. Die Aktivierung der Stress-Kinasen erfolgte agenzspezifisch und abh��ngig von verschieden Reparaturfaktoren. Die Aktivierung korrelierte in reparaturdefizienten Zellen teilweise mit dem sp��ten Auftreten von DNA-Strangbr��chen, war jedoch unabh��ngig von erh��hten initialen DNA-Sch��den. Diese Befunde zeigten, dass die sp��te Aktivierung der SAPK/JNK DNA-schadensabh��ngig verl��uft und das Cisplatin und Transplatin bei Verwendung von ��quitoxischen Dosen zu einer vergleichbaren Aktivierung von SAPK/JNK f��hrten. Die Hemmung der Rho-GTPasen sowohl durch Statine als auch mittels Clostridium difficile Toxin B zeigte weiterhin, dass Rho-GTPasen m��glicherweise die sp��te DNA-schadensabh��ngige Aktivierung der Stress-Kinasen vermitteln. Die Hemmung von Rho-GTPasen durch physiologisch relevante Konzentrationen von Statinen f��hrte in prim��ren humanen Endothelzellen (HUVECs) zu einer Protektion vor IR-Strahlung und Doxorubicin. In beiden F��llen konnte eine Hemmung des pro-apoptotischen Transkriptionsfaktors p53 sowie der Chk1, welche einen Zellzyklusarrest reguliert, mit der Statin-Behandlung erreicht werden. Effektor-Caspasen wurden dabei durch den HMG-CoA-Reduktase Hemmer nicht beeinflusst. Ausschlie��lich bei dem Statin-vermittelten Schutz vor Doxorubicin kam es zu einer Reduktion von initialen DNA-Sch��den, in Form von DNA-Strangbr��chen. Die IR-induzierten Strangbr��che in der DNA blieben von der Statin-Inkubation hingegen unbeeinflusst. Aufgrund ihrer protektiven Eigenschaften gegen��ber IR- und Doxorubicin-induzierter Zytotoxizit��t in Endothelzellen und ihrer pro-apoptotischen Wirkung auf Tumorzellen k��nnten Statine m��glicherweise die unerw��nschten Nebenwirkungen von Zytostatika und einer Strahlentherapie g��nstig beeinflussen

Untersuchungen zum Mechanismus der Zytotoxizit��t von alkylierenden Agenzien in malignen Melanomzellen

Maligne Melanome sind gegen��ber Chemotherapeutika relativ resistent. Das methylierende Alkylanz Temozolomid sowie das chlorethylierende und DNA-Interstrand Crosslink (ICL) bildende Alkylanz Fotemustin kommen bei der Behandlung des malignen Melanoms als Mittel erster Wahl zum Einsatz. In der vorliegenden Arbeit konnte das erste Mal nachgewiesen werden, dass die zytotoxische Wirkung von Temozolomid und Fotemustin in Melanomzellen durch Apoptose vermittelt wird. Unter Verwendung klinisch relevanter Dosen der beiden Alkylantien konnte die Induktion von Apoptose durch vier unabh��ngige Methoden (Bestimmung der SubG1-Fraktion und der Apoptose- / Nekrose-Frequenz, Aktivierung der Effektorcaspasen-3 und -7 sowie Spaltung von PARP-1) nachgewiesen werden. Die Alkylierungen an der O6-Position des Guanins, welche durch beide Agenzien induziert werden, sind auch in Melanomzellen die wichtigsten Zytotoxizit��t-bewirkenden L��sionen in der DNA, und die O6-Methylguanin-DNA-Methyltransferase (MGMT) ist folglich ein herausragender Resistenzmarker. Eine der verwendeten Zelllinien (D05) exprimierte p53-Wildtypprotein. Diese Zelllinie war resistenter als alle anderen Zelllinien gegen��ber Temozolomid und Fotemustin. Dies weist darauf hin, dass p53 nicht die Apoptoseinduktion in Melanomzellen verst��rkt. Die Prozessierung des O6MeG erfolgt ��ber die Mismatch-Reparatur (MMR) unter Generierung von DNA-Doppelstrangbr��chen (DSBs). Die Untersuchung der durch Temozolomid induzierten DSBs, nachgewiesen durch gammaH2AX-Induktion, korrelierte direkt mit der apoptotischen Antwort von Melanomzelllinien und DSBs k��nnen somit als eine entscheidende apoptoseausl��sende Gr����e angesehen werden. Eine Resistenz gegen��ber dem methylierenden Temozolomid in der Zelllinie MZ7 konnte auf einen Defekt in der MMR-Schadenserkennung auf der Ebene des MutSalpha-Komplexes zur��ckgef��hrt werden. Dieser Defekt hatte keinen Einfluss auf die Fotemustin-vermittelte Apoptoseinduktion. Neben MGMT konnte somit die MMR als Resistenzfaktor gegen��ber methylierenden Agenzien in Melanomen identifiziert werden. Die Fotemustin-induzierte Apoptose wurde in Melanomzelllinien im Detail untersucht. Es konnte erstmals gezeigt werden, dass Fotemustin-bedingte ICLs in Zellen einen G2/M-Arrest im Behandlungszyklus induzieren. Wie anhand G1-arretierter Zellen nachgewiesen werden konnte, war das Durchlaufen der DNA-Replikation vor Erreichen des Arrests f��r die Induktion der Apoptose notwendig. Die Prozessierung von ICLs ist im Vergleich zu Methylierungen der DNA deutlich komplexer. Dies k��nnte erkl��ren, warum in Melanomzellen die durch gammaH2AX-Induktion repr��sentierten DSBs nicht mit der Sensitivit��t der einzelnen Zelllinien korreliert. Die Untersuchung unterschiedlich sensitiver Zelllinien zeigte ein vergleichbares Schadensniveau an ICLs und eine ebenso vergleichbare initiale Prozessierung derselben unter Generierung von DSBs. Die Prozessierung dieser sekund��ren L��sionen, welche anhand der Abnahme von gammaH2AX-Foci untersucht wurde, war hingegen in der sensitiveren Melanomzelllinie deutlich weniger effektiv. Es konnte weiterhin nachgewiesen werden, dass eine uneffektive Prozessierung der sekund��ren L��sionen einhergeht mit einer verst��rkten und l��nger anhaltenden Aktivierung der in der DSB-Detektion beteiligten Kinase ATM und der Checkpoint Kinase 1. Es w��re daher denkbar, dass eine verst��rkte Aktivit��t dieser Kinasen proapoptotische Signale vermittelt. Unterschiede in der Prozessierung der sekund��ren L��sionen k��nnten somit ein wichtiger Marker der ICL-induzierten Apoptose darstellen. Des weitern konnte nachgewiesen werden, dass nach Fotemustingabe die mitochondrial-vermittelte Apoptose einen effektiven Exekutionsweg in Melanomen darstellt. W��hrend Cytochrom C-Freigabe, Bcl-2-Abnahme an den Mitochondrien, Bax-Rekrutierung und Caspase-9 Aktivit��t nachgewiesen werden konnten, wurden keine Hinweise auf eine Fas-Rezeptor-vermittelte Apoptose gefunden. Die Unf��higkeit, Rezeptor-vermittelte Apoptose zu unterlaufen, k��nnte die Bedeutungslosigkeit des p53-Gens in Melanomen begr��nden, da gerade dieser Weg in der Alkylantien-induzierten Apoptose in anderen Zellsystemen eine gro��e Relevanz besitzt. Bei der Suche nach einem alternativen proapoptotischen Signalweg konnten Hinweise f��r die Beteiligung des Rb/E2F-1-Wegs, welcher ��ber p73 agiert, in einer p53-mutierten Melanomzelllinie gefunden werden. Einen Einfluss der Proteine Survivin und XIAP als Resistenzfaktoren auf die Fotemustin-induzierte Apoptose wurde hingegen nicht nachgewiesen.