La production de thiols biogéniques par les microorganismes aquatiques

Les thiols à faible masse moléculaire (FMM) peuvent affecter la biodisponibilité du mercure et mener à une plus grande production de méthylmercure par les microorganismes méthylants. Les résultats d’une étude réalisée au sein de la matrice extracellulaire du périphyton de la zone littorale d’un lac des Laurentides ont démontré que les concentrations en thiols à FMM retrouvées dans cette matrice sont jusqu’à 1000 fois supérieures à celles de la colonne d’eau avoisinante. Ces thiols sont significativement corrélés à la chlorophylle a du périphyton, suggérant une production par les algues. Le mercure de la matrice extracellulaire, plus spécifiquement dans la fraction colloïdale mobile, est aussi corrélé aux thiols d’origine algale. Ces résultats suggèrent qu’une accumulation de thiols s’opère dans l’espace extracellulaire du périphyton et qu’ils peuvent favoriser le transfert du mercure vers les microorganismes produisant le méthylmercure. Les résultats d’une seconde étude menée sur les méthodes de préservation d’échantillons d’eau pour la conservation des thiols à FMM ont démontré que la température optimale d’entreposage était de -80 °C et que la lyophilisation menait à une sous-estimation des concentrations mesurées. Les taux de dégradation étaient plus rapides lors de la conservation à -20 °C et variables selon la chimie de l’eau utilisée et les espèces de thiols observées. Suivant ces résultats, nous proposons un cadre de recherche pour de futures études sur la spéciation du mercure dans le périphyton et nous suggérons des précautions lors de la manipulation et de la conservation des thiols à FMM d’échantillons naturels.

Les azasulfurylpeptides : synthèse, analyse conformationnelle et applications biologiques

Les azasulfurylpeptides sont des mimes peptidiques auxquels le carbone en position alpha et le carbonyle d’un acide aminé sont respectivement remplacés par un atome d’azote et un groupement sulfonyle (SO2). Le but premier de ce projet a été de développer une nouvelle méthode de synthèse de ces motifs, également appelés N-aminosulfamides. À cette fin, l’utilisation de sulfamidates de 4-nitrophénol s’est avérée importante dans la synthèse des azasulfuryltripeptides, permettant le couplage d’hydrazides avec l’aide d’irradiation aux micro-ondes (Chapitre 2). Par la suite, en quantité stoechiométrique d’une base et d’un halogénure d’alkyle, les azasulfurylglycines (AsG) formés peuvent être chimiosélectivement alkylés afin d’y insérer diverses chaînes latérales. Les propriétés conformationnelles des N-aminosulfamides à l’état solide ont été élucidées grâce à des études cristallographiques par rayons X : elles possèdent une structure tétraédrique autour de l’atome de soufre, des traits caractéristiques des azapeptides et des sulfonamides, ainsi que du potentiel à favoriser la formation de tours gamma (Chapitre 3). Après le développement d’une méthode de synthèse des N-aminosulfamides en solution, une approche combinatoire sur support solide a également été élaborée sur la résine amide de Rink afin de faciliter la génération d’une librairie d’azasulfurylpeptides. Cette étude a été réalisée en employant le growth hormone releasing peptide 6 (GHRP-6, His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2). Ce dernier est un hexapeptide possédant une affinité pour deux récepteurs, le growth hormone secretagogue receptor 1a (GHS-R1a) et le récepteur cluster of differenciation 36 (CD36). Une affinité sélective envers le récepteur CD36 confère des propriétés thérapeutiques dans le traitement de la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA). Six analogues d’azasulfurylpeptides de GHRP-6 utilisés comme ligands du CD36 ont été synthétisés sur support solide, mettant en évidence le remplacement du tryptophane à la position 4 de GHRP-6 (Chapitre 4). Les analogues de GHRP-6 ont été ensuite analysés pour leur capacité à moduler les effets de la fonction et de la cascade de signalisation des ligands spécifiques au Toll-like receptor 2 (TLR2), en collaboration avec le Professeur Huy Ong du département de Pharmacologie à la Faculté de Pharmacie de l’Université de Montréal. Le complexe TLR2-TLR6 est reconnu pour être co-exprimé et modulé par CD36. En se liant au CD36, certains ligands de GHRP-6 ont eu un effet sur la signalisation du TLR2. Par exemple, les azasulfurylpeptides [AsF(4-F)4]- et [AsF(4-MeO)4]-GHRP-6 ont démontré une capacité à empêcher la surproduction du monoxyde d’azote (NO), un sous-produit réactif formé suite à l’induction d’un signal dans les macrophages par des ligands spécifiques liés au TLR2, tel le fibroblast-stimulating lipopeptide 1 (R-FSL-1) et l’acide lipotéichoïque (LTA). En addition, la sécrétion du tumor necrosis factor alpha (TNFa) et du monocyte chemoattractant protein 1 (MCP-1), ainsi que l’activation du nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells (NF-kB), ont été réduites. Ces résultats démontrent le potentiel de ces azasulfurylpeptides à pouvoir réguler le rôle du TLR2 qui déclenche des réponses inflammatoires et immunitaires innées (Perspectives). Finalement, le potentiel des azasulfurylpeptides d’inhiber des métallo-bêta-lactamases, tels le New-Delhi Metallo-bêta-lactamase 1 (NDM-1), IMP-1 et le Verona Integron-encoded Metallo-bêta-lactamase 2 (VIM-2), a été étudié en collaboration avec le Professeur James Spencer de l’Université de Bristol (Royaumes-Unis). Certains analogues ont été des inhibiteurs micromolaires du IMP-1 (Perspectives). Ces nouvelles voies de synthèse des azasulfurylpeptides en solution et sur support solide devraient donc permettre leur utilisation dans des études de relations structure-activité avec différents peptides biologiquement actifs. En plus d'expandre l'application des azasulfurylpeptides comme inhibiteurs d'enzymes, cette thèse a révélé le potentiel de ces N-aminosulfamides à mimer les structures secondaires peptidiques, tels que les tours gamma. À cet égard, l’application des azasulfurylpeptides a été démontrée par la synthèse de ligands du CD36 présentant des effets modulateurs sur le TLR2. Compte tenu de leur synthèse efficace et de leur potentiel en tant qu’inhibiteurs, les azasulfurylpeptides devraient trouver une large utilisation dans les sciences de peptides pour des applications dans la médecine et de la chimie biologique.

Nanostructure des particules polymériques : aspects physiques, chimiques et biologiques

Les nanotechnologies appliquées aux sciences pharmaceutiques ont pour but d’améliorer l’administration de molécules actives par l’intermédiaire de transporteurs nanométriques. Parmi les différents types de véhicules proposés pour atteindre ce but, on retrouve les nanoparticules polymériques (NP) constituées de copolymères “en bloc”. Ces copolymères permettent à la fois l’encapsulation de molécules actives et confèrent à la particule certaines propriétés de surface (dont l’hydrophilicité) nécessaires à ses interactions avec les milieux biologiques. L’architecture retenue pour ces copolymères est une structure constituée le plus fréquemment de blocs hydrophiles de poly(éthylène glycol) (PEG) associés de façon linéaire à des blocs hydrophobes de type polyesters. Le PEG est le polymère de choix pour conférer une couronne hydrophile aux NPs et son l’efficacité est directement liée à son organisation et sa densité de surface. Néanmoins, malgré les succès limités en clinique de ces copolymères linéaires, peu de travaux se sont attardés à explorer les effets sur la structure des NPs d’architectures alternatives, tels que les copolymères en peigne ou en brosse. Durant ce travail, plusieurs stratégies ont été mises au point pour la synthèse de copolymères en peigne, possédant un squelette polymérique polyesters-co-éther et des chaines de PEG liées sur les groupes pendants disponibles (groupement hydroxyle ou alcyne). Dans la première partie de ce travail, des réactions d’estérification par acylation et de couplage sur des groupes pendants alcool ont permis le greffage de chaîne de PEG. Cette méthode génère des copolymères en peigne (PEG-g-PLA) possédant de 5 à 50% en poids de PEG, en faisant varier le nombre de chaînes branchées sur un squelette de poly(lactique) (PLA). Les propriétés structurales des NPs produites ont été étudiées par DLS, mesure de charge et MET. Une transition critique se situant autour de 15% de PEG (poids/poids) est observée avec un changement de morphologie, d’une particule solide à une particule molle (“nanoagrégat polymére”). La méthode de greffage ainsi que l’addition probable de chaine de PEG en bout de chaîne principale semblent également avoir un rôle dans les changements observés. L’organisation des chaînes de PEG-g-PLA à la surface a été étudiée par RMN et XPS, méthodes permettant de quantifier la densité de surface en chaînes de PEG. Ainsi deux propriétés clés que sont la résistance à l’agrégation en conditions saline ainsi que la résistance à la liaison aux protéines (étudiée par isothermes d’adsorption et microcalorimétrie) ont été reliées à la densité de surface de PEG et à l’architecture des polymères. Dans une seconde partie de ce travail, le greffage des chaînes de PEG a été réalisé de façon directe par cyclo-adition catalysée par le cuivre de mPEG-N3 sur les groupes pendants alcyne. Cette nouvelle stratégie a été pensée dans le but de comprendre la contribution possible des chaines de PEG greffées à l’extrémité de la chaine de PLA. Cette librairie de PEG-g-PLA, en plus d’être composée de PEG-g-PLA avec différentes densités de greffage, comporte des PEG-g-PLA avec des PEG de différent poids moléculaire (750, 2000 et 5000). Les chaines de PEG sont seulement greffées sur les groupes pendants. Les NPs ont été produites par différentes méthodes de nanoprécipitation, incluant la nanoprécipitation « flash » et une méthode en microfluidique. Plusieurs variables de formulation telles que la concentration du polymère et la vitesse de mélange ont été étudiées afin d’observer leur effet sur les caractéristiques structurales et de surface des NPs. Les tailles et les potentiels de charges sont peu affectés par le contenu en PEG (% poids/poids) et la longueur des chaînes de PEG. Les images de MET montrent des objets sphériques solides et l'on n’observe pas d’objets de type agrégat polymériques, malgré des contenus en PEG comparable à la première bibliothèque de polymère. Une explication possible est l’absence sur ces copolymères en peigne de chaine de PEG greffée en bout de la chaîne principale. Comme attendu, les tailles diminuent avec la concentration du polymère dans la phase organique et avec la diminution du temps de mélange des deux phases, pour les différentes méthodes de préparation. Finalement, la densité de surface des chaînes de PEG a été quantifiée par RMN du proton et XPS et ne dépendent pas de la méthode de préparation. Dans la troisième partie de ce travail, nous avons étudié le rôle de l’architecture du polymère sur les propriétés d’encapsulation et de libération de la curcumine. La curcumine a été choisie comme modèle dans le but de développer une plateforme de livraison de molécules actives pour traiter les maladies du système nerveux central impliquant le stress oxydatif. Les NPs chargées en curcumine, montrent la même transition de taille et de morphologie lorsque le contenu en PEG dépasse 15% (poids/poids). Le taux de chargement en molécule active, l’efficacité de changement et les cinétiques de libérations ainsi que les coefficients de diffusion de la curcumine montrent une dépendance à l’architecture des polymères. Les NPs ne présentent pas de toxicité et n’induisent pas de stress oxydatif lorsque testés in vitro sur une lignée cellulaire neuronale. En revanche, les NPs chargées en curcumine préviennent le stress oxydatif induit dans ces cellules neuronales. La magnitude de cet effet est reliée à l’architecture du polymère et à l’organisation de la NP. En résumé, ce travail a permis de mettre en évidence quelques propriétés intéressantes des copolymères en peigne et la relation intime entre l’architecture des polymères et les propriétés physico-chimiques des NPs. De plus les résultats obtenus permettent de proposer de nouvelles approches pour le design des nanotransporteurs polymériques de molécules actives.

Activation chimiosélective et dérivatisation d’amides et d'alcools : synthèse de plusieurs groupements fonctionnels et hétérocycles

Un objectif majeur en chimie organique est le développement de méthodes de synthèses générales, simples et peu coûteuses permettant la modification efficace des ressources naturelles en différents produits d’intérêt public. En particulier, la recherche de méthodes chimiosélectives et de méthodes dites « vertes » représente un intérêt croissant pour le secteur industriel (dont le domaine pharmaceutique). En fait, l’application en synthèse sur grande échelle de procédés catalytiques, sélectifs et utilisant des conditions douces permet de réduire le volume de déchets et la demande énergétique, minimisant ainsi les coûts de production et les effets néfastes sur l’environnement. Dans ce contexte, le groupe de recherche du Professeur André B. Charette de l’Université de Montréal s’intéresse au développement de méthodes générales et chimiosélectives permettant la transformation de fonctionnalités aisément accessibles tels que les amides et les alcools. La fonction amide, aussi appelée liaison peptidique dans les protéines, est présente dans diverses familles de molécules naturelles et est couramment employée comme intermédiaire synthétique dans la synthèse de produits d’intérêt pharmaceutique. Le groupement alcool est, quant à lui, l’une des fonctionnalités les plus abondantes dans la nature, intrinsèquement et largement utilisé en chimie de synthèse. Dans le cadre de cette thèse, des transformations simples, générales et chimiosélectives ont été réalisées sur des amides secondaires et tertiaires, ainsi que sur des alcools primaires et secondaires. La première partie de ce manuscrit se penche sur l’activation de la fonction amide par l’anhydride triflique (Tf2O), suivie de l’addition nucléophile de différents réactifs permettant ainsi la formation de plusieurs groupements fonctionnels versatiles, parfois indispensables, couramment employés en chimie organique tels que les aldimines, les aldéhydes, les amines, les cétones, les cétimines et des dérivés de la fonction amidrazone. Cette dernière fonctionnalité a également été utilisée dans des réactions successives vers la formation d’hétérocycles. De ce fait, des 1,2,4-triazoles ont été formés suite à une cyclodéshydratation initiée en conditions thermiques et faiblement acides. D’autre part, des 3-aminoindazoles ont été synthétisés par une fonctionnalisation C–H catalysée par un sel de palladium (II). La deuxième partie de la thèse est consacrée à la réaction de Mitsunobu en conditions acides, permettant ainsi la substitution nucléophile d’alcools en présence de carbamines (ou amines ne possédant pas de groupement électro-attracteurs). Ce type de nucléophile, basique lorsqu’utilisé comme base libre (avec un pKa se situant au-dessus de 13 dans le DMSO), n’est intrinsèquement pas compatible dans les conditions standards de la réaction de Mitsunobu. Contrairement aux conditions usuelles multi-étapes employant la réaction de Mitsunobu, la méthode développée au cours de cette étude permet la formation d’amines substituées en une seule étape et ne requiert pas l’emploi de groupements protecteurs.

Inhibition réversible et photomarquage de la transglutaminase tissulaire

La transglutaminase tissulaire est une enzyme dépendante du calcium qui catalyse la formation de liens isopeptidiques, entre les chaînes latérales de résidus glutamine et lysine, permettant, par le fait même, la réticulation des protéines dans les systèmes biologiques. Elle joue un rôle, entre autres, dans l’endocytose, la régulation du développement des cellules, et même dans l’apoptose. Néanmoins, une dérégulation de l’activité biologique de cette enzyme peut entrainer différentes pathologies, comme la formation de cataractes, de plaques amyloïdes dans la maladie d’Alzheimer, ou encore peut mener au développement de la maladie céliaque. C’est pourquoi une meilleure connaissance du mécanisme d’action de cette enzyme et la possibilité de réguler son action à l’aide de substrats ou d’inhibiteurs sont nécessaires. Dans cette optique, une méthode d’expression et de purification de la transglutaminase humaine a été développée, permettant de travailler directement avec la cible pharmacologique désirée. De plus, une étude du mode d’inhibition et de liaison d’une classe d’inhibiteurs réversibles précédemment découverte dans le groupe, soit la famille des trans-cinnamoyles, a permis d’identifier que la puissance de ces molécules est influencée par la présence du calcium et qu’une inhibition dépendante du temps est observée, en lien avec un potentiel équilibre conformationnel lent de la transglutaminase. D’un autre côté, la susceptibilité à une attaque nucléophile par des thiols de cette classe de molécule rend leur potentiel pharmacologique grandement diminué, et c’est pourquoi une nouvelle famille de molécules a été identifiée, basée sur un squelette ynone, avec une valeur d’IC50 très prometteuse de 2,6 μM, en faisant un des meilleurs inhibiteurs réversibles de la transglutaminase développés à ce jour. Finalement, une stratégie de photomarquage jumelée à une analyse de spectrométrie de masse en tandem a été développée pour la découverte du site de liaison du substrat dérivé de la lysine, dans le but de mieux comprendre le mécanisme complexe de cette enzyme.

Nouvelles stratégies pour l’analyse des cyanotoxines par spectrométrie de masse

Les cyanobactéries ont une place très importante dans les écosystèmes aquatiques et un nombre important d’espèces considéré comme nuisible de par leur production de métabolites toxiques. Ces cyanotoxines possèdent des propriétés très variées et ont souvent été associées à des épisodes d’empoisonnement. L’augmentation des épisodes d’efflorescence d’origine cyanobactériennes et le potentiel qu’ils augmentent avec les changements climatiques a renchéri l’intérêt de l’étude des cyanobactéries et de leurs toxines. Considérant la complexité chimique des cyanotoxines, le développement de méthodes de détection simples, sensibles et rapides est toujours considéré comme étant un défi analytique. Considérant ces défis, le développement de nouvelles approches analytiques pour la détection de cyanotoxines dans l’eau et les poissons ayant été contaminés par des efflorescences cyanobactériennes nuisibles a été proposé. Une première approche consiste en l’utilisation d’une extraction sur phase solide en ligne couplée à une chromatographie liquide et à une détection en spectrométrie de masse en tandem (SPE-LC-MS/MS) permettant l’analyse de six analogues de microcystines (MC), de l’anatoxine (ANA-a) et de la cylindrospermopsine (CYN). La méthode permet une analyse simple et rapide et ainsi que la séparation chromatographique d’ANA-a et de son interférence isobare, la phénylalanine. Les limites de détection obtenues se trouvaient entre 0,01 et 0,02 μg L-1 et des concentrations retrouvées dans des eaux de lacs du Québec se trouvaient entre 0,024 et 36 μg L-1. Une deuxième méthode a permis l’analyse du b-N-méthylamino-L-alanine (BMAA), d’ANA-a, de CYN et de la saxitoxine (STX) dans les eaux de lac contaminés. L’analyse de deux isomères de conformation du BMAA a été effectuée afin d’améliorer la sélectivité de la détection. L’utilisation d’une SPE manuelle permet la purification et préconcentration des échantillons et une dérivatisation à base de chlorure de dansyle permet une chromatographie simplifiée. L’analyse effectuée par LC couplée à la spectrométrie de masse à haute résolution (HRMS) et des limites de détections ont été obtenues entre 0,007 et 0,01 µg L-1. Des échantillons réels ont été analysés avec des concentrations entre 0,01 et 0,3 µg L-1 permettant ainsi la confirmation de la présence du BMAA dans les efflorescences de cyanobactéries au Québec. Un deuxième volet du projet consiste en l’utilisation d’une technologie d’introduction d’échantillon permettant des analyses ultra-rapides (< 15 secondes/échantillons) sans étape chromatographique, la désorption thermique à diode laser (LDTD) couplée à l’ionisation chimique à pression atmosphérique (APCI) et à la spectrométrie de masse (MS). Un premier projet consiste en l’analyse des MC totales par l’intermédiaire d’une oxydation de Lemieux permettant un bris de la molécule et obtenant une fraction commune aux multiples congénères existants des MC. Cette fraction, le MMPB, est analysée, après une extraction liquide-liquide, par LDTD-APCI-MS/MS. Une limite de détection de 0,2 µg L-1 a été obtenue et des concentrations entre 1 et 425 µg L-1 ont été trouvées dans des échantillons d’eau de lac contaminés du Québec. De plus, une analyse en parallèle avec des étalons pour divers congénères des MC a permis de suggérer la possible présence de congénères ou d’isomères non détectés. Un deuxième projet consiste en l’analyse directe d’ANA-a par LDTD-APCI-HRMS pour résoudre son interférence isobare, la phénylalanine, grâce à la détection à haute résolution. La LDTD n’offre pas de séparation chromatographique et l’utilisation de la HRMS permet de distinguer les signaux d’ANA-a de ceux de la phénylalanine. Une limite de détection de 0,2 µg L-1 a été obtenue et la méthode a été appliquée sur des échantillons réels d’eau avec un échantillon positif en ANA-a avec une concentration de 0,21 µg L-1. Finalement, à l’aide de la LDTD-APCI-HRMS, l’analyse des MC totales a été adaptée pour la chair de poisson afin de déterminer la fraction libre et liée des MC et comparer les résultats avec des analyses conventionnelles. L’utilisation d’une digestion par hydroxyde de sodium précédant l’oxydation de Lemieux suivi d’une purification par SPE a permis d’obtenir une limite de détection de 2,7 µg kg-1. Des échantillons de poissons contaminés ont été analysés, on a retrouvé des concentrations en MC totales de 2,9 et 13,2 µg kg-1 comparativement aux analyses usuelles qui avaient démontré un seul échantillon positif à 2 µg kg-1, indiquant la possible présence de MC non détectés en utilisant les méthodes conventionnelles.

L’étude des stratégies de séparations préparatrices de protéines par électrophorèse capillaire

La protéomique est un sujet d'intérêt puisque l'étude des fonctions et des structures de protéines est essentiel à la compréhension du fonctionnement d'un organisme donné. Ce projet se situe dans la catégorie des études structurales, ou plus précisément, la séquence primaire en acides aminés pour l’identification d’une protéine. La détermination des protéines commence par l'extraction d'un mélange protéique issu d'un tissu ou d'un fluide biologique pouvant contenir plus de 1000 protéines différentes. Ensuite, des techniques analytiques comme l’électrophorèse en gel polyacrylamide en deux dimensions (2D-SDS-PAGE), qui visent à séparer ce mélange en fonction du point isoélectrique et de la masse molaire des protéines, sont utilisées pour isoler les protéines et pour permettre leur identification par chromatographie liquide and spectrométrie de masse (MS), typiquement. Ce projet s'inspire de ce processus et propose que l'étape de fractionnement de l'extrait protéique avec la 2D-SDS-PAGE soit remplacé ou supporté par de multiples fractionnements en parallèle par électrophorèse capillaire (CE) quasi-multidimensionnelle. Les fractions obtenues, contenant une protéine seule ou un mélange de protéines moins complexe que l’extrait du départ, pourraient ensuite être soumises à des identifications de protéines par cartographie peptidique et cartographie protéique à l’aide des techniques de séparations analytiques et de la MS. Pour obtenir la carte peptidique d'un échantillon, il est nécessaire de procéder à la protéolyse enzymatique ou chimique des protéines purifiées et de séparer les fragments peptidiques issus de cette digestion. Les cartes peptidiques ainsi générées peuvent ensuite être comparées à des échantillons témoins ou les masses exactes des peptides enzymatiques sont soumises à des moteurs de recherche comme MASCOT™, ce qui permet l’identification des protéines en interrogeant les bases de données génomiques. Les avantages exploitables de la CE, par rapport à la 2D-SDS-PAGE, sont sa haute efficacité de séparation, sa rapidité d'analyse et sa facilité d'automatisation. L’un des défis à surmonter est la faible quantité de masse de protéines disponible après analyses en CE, due partiellement à l'adsorption des protéines sur la paroi du capillaire, mais due majoritairement au faible volume d'échantillon en CE. Pour augmenter ce volume, un capillaire de 75 µm était utilisé. Aussi, le volume de la fraction collectée était diminué de 1000 à 100 µL et les fractions étaient accumulées 10 fois; c’est-à-dire que 10 produits de séparations étaient contenu dans chaque fraction. D'un autre côté, l'adsorption de protéines se traduit par la variation de l'aire d'un pic et du temps de migration d'une protéine donnée ce qui influence la reproductibilité de la séparation, un aspect très important puisque 10 séparations cumulatives sont nécessaires pour la collecte de fractions. De nombreuses approches existent pour diminuer ce problème (e.g. les extrêmes de pH de l’électrolyte de fond, les revêtements dynamique ou permanent du capillaire, etc.), mais dans ce mémoire, les études de revêtement portaient sur le bromure de N,N-didodecyl-N,N-dimethylammonium (DDAB), un surfactant qui forme un revêtement semi-permanent sur la paroi du capillaire. La grande majorité du mémoire visait à obtenir une séparation reproductible d'un mélange protéique standard préparé en laboratoire (contenant l’albumine de sérum de bovin, l'anhydrase carbonique, l’α-lactalbumine et la β-lactoglobulin) par CE avec le revêtement DDAB. Les études portées sur le revêtement montraient qu'il était nécessaire de régénérer le revêtement entre chaque injection du mélange de protéines dans les conditions étudiées : la collecte de 5 fractions de 6 min chacune à travers une séparation de 30 min, suivant le processus de régénération du DDAB, et tout ça répété 10 fois. Cependant, l’analyse en CE-UV et en HPLC-MS des fractions collectées ne montraient pas les protéines attendues puisqu'elles semblaient être en-dessous de la limite de détection. De plus, une analyse en MS montrait que le DDAB s’accumule dans les fractions collectées dû à sa désorption de la paroi du capillaire. Pour confirmer que les efforts pour recueillir une quantité de masse de protéine étaient suffisants, la méthode de CE avec détection par fluorescence induite par laser (CE-LIF) était utilisée pour séparer et collecter la protéine, albumine marquée de fluorescéine isothiocyanate (FITC), sans l'utilisation du revêtement DDAB. Ces analyses montraient que l'albumine-FITC était, en fait, présente dans la fraction collecté. La cartographie peptidique a été ensuite réalisée avec succès en employant l’enzyme chymotrypsine pour la digestion et CE-LIF pour obtenir la carte peptidique.

Study of Langmuir-Blodgett Films of Self-Assembled Diblock Copolymers

L'auto-assemblage des copolymères à bloc (CPBs) attire beaucoup d'intérêt grâce à leur capacité de générer spontanément des matériaux ordonnés avec des propriétés uniques. Les techniques Langmuir-Blodgett (LB) et Langmuir-Schaefer (LS) sont couramment utilisées pour produire des monocouches ou des films ultraminces à l'interface air/eau suivi de transfert aux substrats solides. Les films LB/LS de CPBs amphiphiles s'auto-assemblent dans des morphologies variables dépendamment de la composition du CPB ainsi que d'autres facteurs. Dans notre travail, nous avons étudié les films LB/LS de polystyrène-b-poly(4-vinyl pyridine) (PS-P4VP) et leurs complexes supramoléculaires avec le naphtol (NOH), l'acide naphtoïque (NCOOH) et le 3-n-pentadécylphenol (PDP). La première partie de ce mémoire est consacré à l'investigation du PS-P4VP complexé avec le NOH et le NCOOH, en comparaison avec le PS-P4VP seul. Il a été démontré qu'un plateau dans l'isotherme de Langmuir, indicatif d'une transition de premier ordre, est absent à des concentrations élevées des solutions d'étalement des complexes. Cela a été corrélé avec l'absence de morphologie en nodules avec un ordre 2D hexagonal à basse pression de surface. L'ordre au-delà de la pression de cette transition, lorsque présente, change à un ordre 2D carré pour tout les systèmes. La deuxième partie du la mémoire considère à nouveau le système PS-P4VP/ PDP, pour lequel on a démontré antérieurement que la transition dans l'isotherme correspond a une transition 2D d'un ordre hexagonal à un ordre carré. Cela est confirmé par microscopie à force atomique, et, ensuite, on a procédé à une étude par ATR-IR des films LB pour mieux comprendre les changements au niveau moléculaire qui accompagnent cette transition. Il a été constaté que, contrairement à une étude antérieure dans la littérature sur un autre système, il n'y a aucun changement dans l'orientation des chaînes alkyles. Au lieu de cela, on a découvert que, aux pressions au-delà de celle de la transition, le groupe pyridine, qui est orienté à basse pression, devient isotrope et qu'il y a une augmentation des liaisons hydrogènes phénol-pyridine. Ces observations sont rationalisées par un collapse partiel à la pression de transition de la monocouche P4VP, qui à basse pression est ordonné au niveau moléculaire. Cette étude a mené à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires qui se produisent à l'interface air/eau, ce qui fournit une meilleure base pour la poursuite des applications possibles des films LB/LS dans les domaines de nanotechnologie.

Glycosidation avec protection minimale en solution et sur support solide

Les glycosides sont reconnus pour leur potentiel pharmaceutique tels que les antibiotiques, les agents anticancéreux et antiviraux. Ils sont impliqués dans plusieurs processus biologiques entre autres la reconnaissance cellulaire, l’inflammation, la réponse immunitaire, la croissance, le transport cellulaire, l’adhésion cellulaire et les groupes sanguin. Notre groupe excelle dans la glycosidation stéréocontrôlée avec un minimum de protection suivant le concept d’activation à distance d’aglycones hétérocycliques anomériques. La présence d’une quantité sous stoechiométrique d’acide de Lewis, les (2-pyridyl)-β-D-glycosides déprotégés sont d’excellents donneurs permettant de haute sélectivité pour l’anomère- α-D de glycosides simples et complexes. Inversement, (2-pyridyl)-α-D-glycosides donnent les β-D-glycosides avec de bonne sélectivité. Des exemples de formation stéréocontrôlée de glycosides sont présentés dans cette thèse avec des accepteurs tels que les phénols, les stéroïdes, les terpènes et les acides hydroxyaminés. Cette méthodologie de glycosidation a été appliquée sur support solide.

Systematic construction of models for the exchange hole of density functional theory.

Dans ce travail, nous étendons le nombre de conditions physiques actuellement con- nues du trou d’échange exact avec la dérivation de l’expansion de quatrième ordre du trou d’échange sphérique moyenne exacte. Nous comparons les expansions de deux- ième et de quatrième ordre avec le trou d’échange exact pour des systèmes atomiques et moléculaires. Nous avons constaté que, en général, l’expansion du quatrième ordre reproduit plus fidèlement le trou d’échange exact pour les petites valeurs de la distance interélectronique. Nous démontrons que les ensembles de base de type gaussiennes ont une influence significative sur les termes de cette nouvelle condition, en étudiant com- ment les oscillations causées par ces ensembles de bases affectent son premier terme. Aussi, nous proposons quatre modèles de trous d’échange analytiques auxquels nous imposons toutes les conditions actuellement connues du trou d’échange exact et la nou- velle présentée dans ce travail. Nous évaluons la performance des modèles en calculant des énergies d’échange et ses contributions à des énergies d’atomisation. On constate que les oscillations causeés par les bases de type gaussiennes peuvent compromettre la précision et la solution des modèles.

The effects of additives and chemical modification on the solution properties of thermo-sensitive polymers

Cette thèse concerne l’étude de phase de séparation de deux polymères thermosensibles connus-poly(N-isopropylacylamide) (PNIPAM) et poly(2-isopropyl-2-oxazoline) (PIPOZ). Parmi des études variées sur ces deux polymères, il y a encore deux parties de leurs propriétés thermiques inexplicites à être étudiées. Une partie concerne l’effet de consolvant de PNIPAM dans l’eau et un autre solvant hydromiscible. L’autre est l’effet de propriétés de groupes terminaux de chaînes sur la séparation de phase de PIPOZ. Pour ce faire, nous avons d’abord étudié l’effet de l’architecture de chaînes sur l’effet de cosolvant de PNIPAMs dans le mélange de méthanol/eau en utilisant un PNIPAM en étoile avec 4 branches et un PNIPAM cyclique comme modèles. Avec PNIPAM en étoile, l’adhérence de branches PNIPAM de à un cœur hydrophobique provoque une réduction de Tc (la température du point de turbidité) et une enthalpie plus faible de la transition de phase. En revanche, la Tc de PNIPAM en étoile dépend de la masse molaire de polymère. La coopérativité de déhydratation diminue pour PNIPAM en étoile et PNIPAM cyclique à cause de la limite topologique. Une étude sur l’influence de concentration en polymère sur l’effet de cosolvant de PNIPAM dans le mélange méthanol/eau a montré qu’une séparation de phase liquide-liquide macroscopique (MLLPS) a lieu pour une solution de PNIPAM dans le mélange méthanol/eau avec la fraction molaire de méthanol entre 0.127 et 0.421 et la concentration en PNIPAM est constante à 10 g.L-1. Après deux jours d’équilibration à température ambiante, la suspension turbide de PNIPAM dans le mélange méthanol/eau se sépare en deux phases dont une phase possède beaucoup plus de PNIPAM que l’autre. Un diagramme de phase qui montre la MLLPS pour le mélange PNIPAM/eau/méthanol a été établi à base de données expérimentales. La taille et la morphologie de gouttelettes dans la phase riche en polymère condensée dépendent de la fraction molaire de méthanol. Parce que la présence de méthanol influence la tension de surface des gouttelettes liquides, un équilibre lent de la séparation de phase pour PNIPAM/eau/méthanol système a été accéléré et une séparation de phase liquide-liquide macroscopique apparait. Afin d’étudier l’effet de groupes terminaux sur les propriétés de solution de PIPOZ, deux PIPOZs téléchéliques avec groupe perfluorodécanyle (FPIPOZ) ou groupe octadécyle (C18PIPOZ) comme extrémités de chaîne ont été synthétisés. Les valeurs de Tc des polymères téléchéliques ont beaucoup diminué par rapport à celle de PIPOZ. Des micelles stables se forment dans des solutions aqueuses de polymères téléchéliques. La micellization et la séparation de phase de ces polymères dans l’eau ont été étudiées. La séparation de phase de PIPOZs téléchéliques suit le mécanisme de MLLPS. Des différences en tailles de gouttelettes formées à l’intérieur de solutions de deux polymères ont été observées. Pour étudier profondément les différences dans le comportement d’association entre deux polymères téléchéliques, les intensités des signaux de polymères correspondants et les temps de relaxation T1, T2 ont été mesurés. Des valeurs de T2 de protons correspondants aux IPOZs sont plus hautes.

Films minces de copolymères à blocs supramoléculaires et photosensibles

La technique de trempage («dip-coating») est un procédé rapide et efficace pour former des films minces de copolymères à blocs (CPB) d’épaisseur et de nano-morphologies variées. Très peu d’études ont toutefois porté sur le trempage des CPB supramoléculaires et/ou photosensibles. Le trempage du CPB poly(styrène-b-4-vinyl pyridine) (PS-P4VP) a premièrement été étudié avec des petites molécules (PM) d’acide 1-naphtoïque (NCOOH) et de 1-naphtol (NOH) capables de former des ponts hydrogène (ponts H) avec le bloc P4VP dans 4 solvants (tétrahydrofurane (THF), p-dioxane, toluène et chloroforme). Le ratio d’incorporation (RI) molaire PM/VP dans les films trempés augmente avec la vitesse de retrait mais sa variation dépend fortement du solvant et de la PM utilisés. Le RI et la morphologie des films minces dépendent de la possibilité (ou non) du solvant à former des ponts H avec la PM et de sa sélectivité au bloc de PS menant (ou non) à des micelles de P4VP/PM en solution dont la rigidité influence l’état cinétique du système en film mince. La dépendance en une courbe en V de l’épaisseur des films en fonction la vitesse de retrait définit deux régimes, nommés régimes capillaire et de drainage. Ces régimes influencent différemment le RI et la morphologie finale. Nous nous sommes ensuite intéressés aux complexes de PS-P4VP avec des azobenzènes (AB) photosensibles, le 4-hydroxy-4’-butyl-azobenzène (BHAB) et le 4-hydroxy-4’-cyano-azobenzène (CHAB). Ces AB peuvent non seulement former des ponts H avec le bloc P4VP mais aussi s'isomériser entre les formes trans et cis sous illumination. Les expériences avec PS-P4VP/BHAB dans le THF et le toluène ont révélé que l'irradiation pendant le trempage permet de provoquer une transition entre les morphologies sphérique et cylindrique à basses vitesses de retrait. Ces transitions sont expliquées par l’augmentation du ratio molaire BHAB/VP pris dans les films sous illumination et par le plus grand volume des isomères BHAB-cis par rapport aux BHAB-trans. L'irradiation permet également de moduler l'épaisseur des films sans égard à la présence des AB. Finalement, des solutions de PS-P4VP/CHAB et PS-P4VP/BHAB dans le THF avec un CPB de masse molaire plus élevée ont été étudiées afin de comprendre l’effet d'un temps de demi-vie plus court de l’AB et de la présence de micelles en solution. Le photocontrôle morphologique perd de son efficacité avec le CHAB car l’augmentation du RI de CHAB dans les films illuminés par rapport aux films non irradiés est moins prononcée que pour les complexes de BHAB. Le choix du PS-P4VP est également important puisque la présence de micelles dans les solutions de THF du PS-P4VP(36,5k-16k), même si elle n’influence pas les RI BHAB/VP, fige davantage la morphologie sphérique en solution par rapport à une solution non-micellaire de PS-P4VP(24k-9,5k), limitant les possibilités de transition morphologique.

Développement d’une méthode SPRi-MALDI-IMS pour la quantification et l’identification des protéines dans des empreintes de tissus biologiques

Plusieurs tests médicaux, comme celui du dépistage du cancer du sein, se basent sur l’observation de section tissulaire sous un microscope. Ces tests se basent sur l’interprétation d’un spécialiste et les résultats peuvent varier d’un expert à un autre dû la subjectivité des observations. L’utilisation d’une technique analytique offrant une quantification et une identification de cibles moléculaires dans une section tissulaire permettrait aux experts de produire des diagnostics plus objectifs et diminuerait possiblement le nombre de faux diagnostics. Les travaux présentés dans ce mémoire portent sur le développement d’une technique SPRi-MALDI-IMS permettant l’imagerie en deux dimensions de protéines contenues dans une section tissulaire. La MALDI-IMS est la technique de choix pour l’imagerie de biomolécules dans les sections tissulaires. Par contre, elle ne parvient pas à elle seule à quantifier de façon absolue le matériel adsorbé à la surface. Donc, le couplage de la MALDI-IMS avec la SPRi permet la quantification absolue de protéines en deux dimensions et crée une technique répondant aux besoins des experts médicaux. Pour ce faire, nous avons étudié, l’effet de la chimie de surface sur la nature et la quantité de matériel adsorbé à la surface du capteur. De plus, la cinétique de transfert des protéines du tissu vers le capteur a dû être optimisée afin de produire des empreintes correspondant au tissu d’origine, afin d’atteindre la gamme dynamique des instruments SPRi et MALDI-IMS. La technique résultante de ces optimisations permet d’obtenir les premières images quantitatives et qualitatives de protéines en deux dimensions d’une seule section tissulaire.

Identification des résidus essentiels à l’interaction du récepteur CXCR7 avec ses ligands SDF-1 et ITAC

Les chimiokines sont des petites protéines secrétées dont la fonction principale est la stimulation de la migration de cellules immunitaires vers différents organes et tissus. Elles sont souvent impliquées lors des maladies inflammatoires, auto-immunes et des cancers. Ainsi, les chimiokines et leurs récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) sont la cible pharmacologique de plusieurs molécules, actuellement testées en essais cliniques. Nous avons pris comme modèle, lors de notre étude, le récepteur atypique CXCR7. Ce récepteur est dit atypique, car il ne signalise pas via la voie classique des protéines G, mais plutôt via la voie de la β-arrestine. CXCR7 est impliqué dans de nombreux cancers, favorise la progression métastatique et est un co-récepteur pour le virus de l’immunodéficience humaine (VIH). Cependant, aucune donnée sur son mode de liaison avec ses ligands CXCL11/ITAC et CXCL12/SDF-1 n’existe à date. Nous pensons que cette information est essentielle pour le développement efficace d’agonistes et d’antagonistes, et nous nous sommes intéressés à identifier les résidus essentiels à la liaison des deux ligands de CXCR7 et à son activation par ces derniers. Pour cela, nous avons créé une série de mutants par substitution ou délétion d’acides aminés de la partie N-terminale, des boucles extracellulaires et des domaines transmembranaires du récepteur. Nous avons testé leur marquage en surface cellulaire par cytométrie en flux, leur liaison des deux ligands par expériences de radio-liaison, et leur capacité à recruter la β-arrestine en réponse aux ligands par essais BRET. Les résultats obtenus ont permis d’identifier des résidus importants à l’interaction des systèmes CXCR7/SDF-1 et CXCR7-ITAC et suggèrent des modes de liaison à CXCR7 différents entre ITAC et SDF-1. Tout comme la liaison d’ITAC à son autre récepteur CXCR3, sa liaison à CXCR7 suivrait le mode conventionnel de liaison en deux étapes des récepteurs de chimiokines. Cependant, la liaison de SDF-1 à CXCR7 suivrait un autre mode de liaison, contrairement à sa liaison à son autre récepteur, CXCR4.

Analyse par spectrométrie de masse des antibiotiques vétérinaires liés à l’élevage porcin

L’élevage des porcs représente une source importante de déversement d’antibiotiques dans l’environnement par l’intermédiaire de l’épandage du lisier qui contient une grande quantité de ces molécules sur les champs agricoles. Il a été prouvé que ces molécules biologiquement actives peuvent avoir un impact toxique sur l’écosystème. Par ailleurs, elles sont aussi suspectées d’engendrer des problèmes sanitaires et de contribuer à la résistance bactérienne pouvant mener à des infections difficilement traitables chez les humains. Le contrôle de ces substances dans l’environnement est donc nécessaire. De nombreuses méthodes analytiques sont proposées dans la littérature scientifique pour recenser ces composés dans plusieurs types de matrice. Cependant, peu de ces méthodes permettent l’analyse de ces contaminants dans des matrices issues de l’élevage agricole intensif. Par ailleurs, les méthodes analytiques disponibles sont souvent sujettes à des faux positifs compte tenu de la complexité des matrices étudiées et du matériel utilisé et ne prennent souvent pas en compte les métabolites et produits de dégradation. Enfin, les niveaux d’analyse atteints avec ces méthodes ne sont parfois plus à jour étant donné l’évolution de la chimie analytique et de la spectrométrie de masse. Dans cette optique, de nouvelles méthodes d’analyses ont été développées pour rechercher et quantifier les antibiotiques dans des matrices dérivées de l’élevage intensif des porcs en essayant de proposer des approches alternatives sensibles, sélectives et robustes pour quantifier ces molécules. Une première méthode d’analyse basée sur une technique d’introduction d’échantillon alternative à l’aide d’une interface fonctionnant à l’aide d’une désorption thermique par diode laser munie d’une source à ionisation à pression atmosphérique, couplée à la spectrométrie de masse en tandem a été développée. L’objectif est de proposer une analyse plus rapide tout en atteignant des niveaux de concentration adaptés à la matrice étudiée. Cette technique d’analyse couplée à un traitement d’échantillon efficace a permis l’analyse de plusieurs antibiotiques vétérinaires de différentes classes dans des échantillons de lisier avec des temps d’analyse courts. Les limites de détection atteintes sont comprises entre 2,5 et 8,3 µg kg-1 et sont comparables avec celles pouvant être obtenues avec la chromatographie liquide dans une matrice similaire. En vue d’analyser simultanément une série de tétracyclines, une deuxième méthode d’analyse utilisant la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse à haute résolution (HRMS) a été proposée. L’utilisation de la HRMS a été motivée par le fait que cette technique d’analyse est moins sensible aux faux positifs que le triple quadripôle traditionnel. Des limites de détection comprises entre 1,5 et 3,6 µg kg-1 ont été atteintes dans des échantillons de lisier en utilisant un mode d’analyse par fragmentation. L’utilisation de méthodes de quantifications ciblées est une démarche intéressante lorsque la présence de contaminants est suspectée dans un échantillon. Toutefois, les contaminants non intégrés à cette méthode d’analyse ciblée ne peuvent être détectés même à de fortes concentrations. Dans ce contexte, une méthode d’analyse non ciblée a été développée pour la recherche de pharmaceutiques vétérinaires dans des effluents agricoles en utilisant la spectrométrie de masse à haute résolution et une cartouche SPE polymérique polyvalente. Cette méthode a permis l’identification d’antibiotiques et de pharmaceutiques couramment utilisés dans l’élevage porcin. La plupart des méthodes d’analyse disponibles dans la littérature se concentrent sur l’analyse des composés parents, mais pas sur les sous-produits de dégradation. L’approche utilisée dans la deuxième méthode d’analyse a donc été étendue et appliquée à d’autres classes d’antibiotiques pour mesurer les concentrations de plusieurs résidus d’antibiotiques dans les sols et les eaux de drainage d’un champ agricole expérimental. Les sols du champ renfermaient un mélange d’antibiotiques ainsi que leurs produits de dégradation relatifs à des concentrations mesurées jusqu’à 1020 µg kg-1. Une partie de ces composés ont voyagé par l’intermédiaire des eaux de drainage du champ ou des concentrations pouvant atteindre 3200 ng L-1 ont pu être relevées.