Expresión, purificación y caracterización de proteínas quiméricas de RsbP con el dominio sensorial Per‐ARNT‐Sim y dominios de respuesta histidina quinasa y fosfatasa

Los organismos monitorean una serie de señales internas y externas para ajustar su comportamiento frente a diferentes entornos. Las proteínas encargadas de la transducción de señales son llamadas proteínas sensoriales, y éstas contienen dominios sensoriales que son sensibles a las señales tales como la absorción de la luz o la unión de una sustancia química o ligando; y dominios de respuesta que poseen actividad biológica. Algunas proteínas sensoriales contienen dominios Per-­‐ARNT-­‐Sim(PAS), estos dominios son relativamente pequeños, de aproximadamente 110 aminoácidos y han sido reportados en todos los reinos de la vida. En proteínas, un dominio se caracteriza por una secuencia de aminoácidos específica, sin embargo, los dominios PAS difieren de esta definición, pero sí se caracterizan por poseer una estructura definida que consta de cinco plegamientos beta antiparalelos flanqueados por varias alfa hélices cuya estructura les permite detectar cambios físicos y químicos. Estos dominios pueden activar diferentes dominios de respuesta, que en bacterias incluyen a fosfatasa e histidina quinasa. Se planteó la siguiente hipótesis: El dominio Per-­‐ARNT-­‐Sim(PAS) de RsbP es capaz de interactuar con distintos dominios derespuesta, ya sea fosfatasa o histidina quinasa formando estructuras cuaternarias definidas. El objetivo general es: Establecer la relación estructura-­‐función de dominios PAS bacterianos determinando interacciones específicas con distintos dominios de respuesta. La metodología incluye las técnicas de clonación tradicionales, expresión y purificación de proteínas por medio de cromatografía por afinidad y por intercambio aniónico y finalmente el estudio del estado oligomérico por medio de cromatografía de exclusión. Contribuciones y Conclusiones: en el presente estudio se expresó, purificó y caracterizó el dominio sensorial PAS de RsbP (RsbP-­‐PAS) y la proteína completa RsbP de B. subtilis. Estas proteínas seexpresaron y purificaron utilizando la proteína glutatión S-­‐transferasa (GST) como proteína de fusión. Mediante cromatografía de exclusión por tamaño se determinó la estructura cuaternaria del dominio sensorial PAS de RsbP siendo un monómero y la proteína completa RsbP como tetrámero. Además en este estudio se llevó a cabo la construcción de dos proteínas quiméricas de RsbP. La primera esta compuesta de la siguiente manera, (RsbP-­‐PAS) como domino sensorial, bucle enrollado, el cual conecta al domino sensorial con el dominio de respuesta, e histidina quinasa (PAS-­‐HPK) como dominio de respuesta; y la segunda, (RsbP-­‐PAS) como domino sensorial, el primer dominio PAS del fitocromo A que conecta ambos dominios y fosfatasa como dominio de respuesta (PAS-­‐PASalt-­‐PPM). Estas proteínas se expresaron utilizando la proteína glutatión S-­‐transferasa como proteína de fusión la cual permite la purificación por afinidad. En el caso de PAS-­‐HPK se obtuvo suficiente proteína soluble, sin embargo,PAS-­‐PASalt-­‐HPK mostró la presencia de cuerpos de inclusión los cuales disminuyen el rendimiento de proteína soluble y dificultansu purificación. Es importante señalar que en estudios posteriores se mejorará la obtención de proteína soluble de las proteínas quiméricas, para mejorar sus rendimientos de purificación y su caracterización y de esta manera conocer el estado oligomérico que éstas presentan; para corroborar la teoría que el dominio PAS puede activar diferentes dominios de respuesta ya sea con la presencia del bucle enrollado y/o la presencia de dominios PAS alternos; y posteriormente determinar los mecanismos de transducción de señales que estos dominios presentan.

Síntese química e avaliação das propriedades antibacterianas e antiparasitárias de análogos de peptídeos antimicrobianos de anuros

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2015.

Degradación bacteriana de cianuro y compuestos nitrogenados tóxicos

La ruta de asimilación de cianuro en P. pseudoalcaligenes CECT5344 transcurre a través de un nitrilo formado por la reacción química del cianuro con el oxalacetato, siendo este último acumulado como consecuencia de la acción conjunta de una malato:quinona oxidoreductasa (MQO) y la oxidasa terminal resistente a cianuro (CioAB) (Luque-Almagro et al., 2011b). Los nitrilos pueden ser convertidos en amonio por la acción de una nitrilasa o un sistema nitrilo hidratasa/amidasa. Con el objetivo de elucidar la ruta de asimilación de cianuro en P. pseudoalcalígenes CECT5344, se ha analizado el proteoma de este microorganismo en condiciones cianotróficas frente a nitrato como fuente de nitrógeno como control. En este estudio se identificaron proteínas relacionadas con la ruta de asimilación de cianuro en la estirpe CECT5344, que aparecían inducidas por cianuro, como NitB y NitG, cuyos genes se encuentran localizados en la agrupación génica nit1C. Además de NitB y NitG, de función desconocida, la agrupación génica nit1C codifica un regulador transcripcional del tipo Fis dependiente de σ54 (NitA), una nitrilasa (NitC), una proteína que pertenece a la superfamilia S-adenosilmetionina (NitD), un miembro de la superfamilia N-aciltransferasa (NitE), un polipéptido de la familia AIRS/GARS (NitF) y una oxidorreductasa dependiente de NADH (NitH). Un análisis transcripcional mediante RT-PCR determinó que los genes nitBCDEFGH se cotranscriben, mientras que el gen regulador nitA se transcribe de forma divergente. Además, resultados obtenidos por RT-PCR confirman que la expresión de los genes nitBCDEFGH está inducida por cianuro y reprimida por amonio. La relación entre el cianuro y el grupo de genes nit1C queda patente por el fenotipo de los mutantes deficientes nitA, nitB y nitC, incapaces de usar complejos cianuro-metálicos o 2-hidroxinitrilos como única fuente de nitrógeno. Todos estos datos indican que la nitrilasa NitC, junto con la proteína NitB, utilizan de forma específica determinados nitrilos alifáticos como sustrato, entre los que se encuentran el formado durante la asimilación de cianuro (Estepa et al., 2012). Además, entre las proteínas inducidas por cianuro se identificaron una dihidropicolinato sintasa (DapA), una fosfoserina transaminasa (SerC) y una proteína de función desconocida (Orf1), las tres codificadas por genes del operón cio, una cianasa (CynS), la proteína S6 de la subunidad ribosomal 30S (RpsF), una superóxido dismutasa (SodB), la ferritina (Dps), una oxidorreductasa (Fpr) y un factor de elongación P (EF-P). Una vez identificadas, estas proteínas se han analizado funcionalmente y se han localizado en el genoma de P. pseudoalcaligenes CECT5344 los genes correspondientes, así como los genes adyacentes. La inducción de estas proteínas en condiciones cianotróficas sugiere que el metabolismo del cianuro incluye, además de la resistencia y asimilación de este tóxico, otros procesos biológicos relacionados con el metabolismo del cianato y de algunos aminoácidos, el estrés oxidativo y la homeostasis de hierro, entre otros. Por otra parte, el conocimiento en profundidad y la interpretación de la secuencia génica de P. pseudoalcaligenes CECT5344, así como el análisis comparativo frente a organismos no cianotrofos ha permitido entender algunos de los mecanismos implicados en la resistencia y asimilación de cianuro, lo que permitiría conducir a la posterior mejora del proceso de biodegradación de cianuro. Además, el estudio del genoma de la estirpe CECT5344 permitirá explorar la capacidad de este organismo para ser utilizado en procesos de biorremediación de residuos cianurados en los que se encuentran metales y otros tóxicos (Luque-Almagro et al., 2013; Wibberg et al., 2014). En este trabajo se muestran y discuten los resultados de la secuenciación del genoma de P. pseudoalcaligenes, así como el estudio del análisis filogenético y evolutivo de la cepa, estableciéndose de esta manera relaciones con otras especies en base a los genomas secuenciados de las mismas, entre las que destaca P. mendocina ymp relacionada con P. pseudoalcaligenes CECT5344. El estudio de las características del genoma de P. pseudoalcaligenes CECT5344 ha sido completado con un análisis comparativo frente a los genomas de otras especies de Pseudomonas, encontrándose así semejanzas y diferencias en cuanto a la distribución génica funcional. Por último, se muestra un análisis del genoma de P. pseudoalcaligenes CECT5344 en relación con los genes implicados probablemente en los procesos de asimilación de cianuro y residuos cianurados, tales como los codificantes de nitrilasas y aquellos implicados en la resistencia a cianuro como los constituyentes del operón cio que codifican la oxidasa terminal insensible a cianuro. Finalmente, se discute la presencia de genes implicados posiblemente en otros procesos con una alto potencial biotecnológico, tales como la producción de bioplásticos y la biodegradación de diversos contaminantes.

Química da vida : moléculas da vida

Académico - Licenciaturas

Protein disulfide isomerase as a target for besnoitiosis therapy : molecular characterization and studies of its role in infection and host immune response

Tese de Doutoramento em Ciências Veterinárias na especialidade de Sanidade Animal

Isolamento e caracterização biológica e bioquímica de um activador do factor x da coagulação presente no veneno da serpente Bothrops erythromelas

Dissertação de Mestrado Integrado em Medicina Veterinária

Análisis transcripcional de la vía de secreción y metabolismo del metanol durante la producción de una proteína heteróloga en Pichia pastoris

La levadura metilotrófica Pichia pastoris es de gran importancia industrial principalmente en la producción de proteínas heterólogas. En un estudio reciente se emplearon cinco factores ambientales para definir condiciones de cultivo a nivel de bioreactor que condujeron a altos (CM) y bajos (CP) niveles de la producción extracelular de una fitasa recombinante en una cepa Muts de P. pastoris. Los resultados de este estudio mostraron que bajo las condiciones CM, la demanda y consumo de O2 y de metanol fueron más altos y condujeron a valores más altos en la velocidad específica de crecimiento (μ), biomasa (2.7 veces), niveles de producción de fitasa extracelular (5.5 veces) y rendimientos (Yp/x) que en CP. Con el fin de comprender los mecanismos de regulación transcripcional que afectan a la fisiología de P. pastoris por la sobre-producción de la proteína recombinante y las condiciones de cultivo, en este trabajo se realizó un análisis de expresión diferencial de genes (DGE) empleando la tecnología de secuenciación masiva de mRNA (RNAseq) de la cepa Muts de P. pastoris crecida bajo las condiciones CM y CP reportadas previamente. Además se validaron los resultados del estudio de DGE mediante RT-qPCR. Resultados: La expresión de 4,950 genes, el 93% de los genes totales anotados, fueron detectados. Se sub- y sobre-expresaron 350 y 413 genes respectivamente en CM respecto a CP. En CM vs CP se sobre-expresaron significativamente términos relacionados con la biosíntesis de aminoácidos, biosíntesis de nucleósidos de purina, regulación de la traducción, glicosilación de proteínas y mitosis, indicando una mayor actividad anabólica en CM. La transcripción del gen heterólogo y de los genes de la ruta de desasimilación del metanol no mostraron diferencias entre ambas condiciones de cultivo y fue inducida en metanol. Sin embargo las enzimas claves (DAS1 y DAS2) de la ruta de asimilación del metanol se sobre-expresaron significativamente en CM vs CP, indicando que CM está favorecida la producción de biomasa y la generación de energía a través de esta vía, explicando los valores más altos para la μ y biomasa obtenidos en CM respecto a CP. De 110 genes analizados involucrados en la vía de secreción, 20 se sobre-expresaron en CM vs CP, la sobre-expresión de estos genes indicaron que bajo las condiciones de CM, se presenta una mayor actividad transcipcional de los genes implicados en el transporte y translocación hacia el RE (15%), genes implicados en el plegamiento de proteínas en RE (25%), así como genes relacionados en el procesamieto de las proteínas a través del RE (30%) y Golgi (35%) que permitieron un estado fisiológico favorable para la secreción de la proteína heteróloga. De los 44 genes relacionados con el estrés en RE durante la secreción, en CM vs CP se sobre-expresaron genes UPR indicando, que bajo condiciones de CM, se promueve la expresión de genes relacionados con el plegamiento de proteínas y probablemente se evita el acumulamiento de proteínas mal plegadas. La sub-expresión de todos los genes relacionados con autofagia, es uno de los factores que podría explicar la menor actividad proteolítica observada en CM. Finalmente se observó una correlación entre los métodos de RNA-seq y RTqPCR (r2=0.7). Conclusiones: El análisis de la DGE señala que los factores ambientales en CM condujeron a la regulación de la expresión de genes del proceso de secreción y genes relacionados al estrés en RE durante la secreción que condujeron a valores de Yp/x, más altos en CM que en CP y no se atribuyen a una expresión diferencial del gen heterólogo. La regulación de la ruta del metanol hacia la asimilación y una mejor respuesta de adaptación al estrés en CM condujeron a un mayor crecimiento y producción de biomasa en CM que en CP.

Effect of high densities on growth, stress response and plasma amino acid levels in senegalese sole (Solea senegalensis, Kaup 1858)

Dissertação de mest. em Aquacultura e Pescas, Faculdade de Ciências do Mar e do Ambiente, Univ. do Algarve, 2006

Avaliação da eficácia in vivo da L-arginina na elasticidade da pele

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2012.

Molecular biology of prolactin and prolactin receptor in a marine teleost: the sea bream(Sparus aurata)

Tese de dout. em Biologia, especialidade de Biologia Molecular, Unidade de Ciências e Tecnologias dos Recursos Aquáticos, Univ. do Algarve

Development of a novel platform for high-throughput gene design and artificial gene synthesis to produce large libraries of recombinant venom peptides for drug discovery

Tese de Doutoramento em Ciências Veterinárias na Especialidade de Ciências Biológicas e Biomédicas

Papel del inmunogen isg15 de lubina (Dicentrarchus labrax) en las infecciones por betanodavirus

En peces, al igual que en vertebrados superiores, la respuesta antiviral innata está mediada por el sistema interferón tipo I (IFN I), que actúa mediante la activación de genes denominados isg (interferon-stimulated genes), entre los que se incluye el gen isg15. La proteína codificada por este gen, denominada ISG15, presenta actividad antiviral actuando como citoquina, o mediante un mecanismo denominado ISGilación, que consiste en su unión covalente a proteínas víricas o celulares. Entre las enfermedades de etiología viral que afectan a la lubina (Dicentrarchus labrax), destaca la necrosis nerviosa viral, causada por el virus de la necrosis nerviosa (NNV, género Betanodavirus), que presenta dos segmentos de ARN monocatenario de polaridad positiva: ARN1 (polimerasa viral) y ARN2 (proteína de la cápside). Las diferencias en la secuencia de la región variable T4 del segmento ARN2 permiten su clasificación en 4 genotipos, siendo el genotipo RGNNV el único asociado a episodios de elevada mortalidad en lubina. El presente estudio contribuye a ampliar el conocimiento del papel del sistema IFN I en lubina frente a infecciones por betanodavirus, describiéndose la estructura del gen isg15, analizando su transcripción en respuesta a poli I:C y RGNNV; y evaluando su actividad in vitro. La lubina presenta un gen isg15, compuesto por dos exones y un intrón localizado en la región 5’-UTR. El ORF, de 474 pb, codifica una proteína de 157 aminoácidos constituida por dos dominios tipo ubiquitina y un motivo RLRGG en el extremo carboxilo terminal. La clonación del ORF en el plásmido pcDNA His/Max, y su posterior transfección en la línea celular E-11, ha permitido obtener una línea celular estable (DLISG15-E11), en la que se ha demostrado, mediante inmunofluorescencia indirecta, la localización citoplasmática de esta proteína. El análisis de transcripción muestra una respuesta más temprana e intensa tras la inducción por poli I:C que por RGNNV. Poli I:C estimula la expresión génica desde las 4 hasta las 24 h post-inyección (p.i.) en ambos órganos, y con una cinética similar. Sin embargo, ambos órganos difieren en el nivel de transcripción del gen tras la infección por RGNNV, produciéndose una estimulación temprana, desde las 12 h p.i., y de mayor nivel en el cerebro que en el riñón cefálico, órgano en el que la expresión comienza a las 72 h p.i. La actividad antiviral se ha evaluado mediante el análisis comparativo de la replicación de RGNNV, determinada mediante PCR cuantitativa, en células DLISG15-E11 y células control no transfectadas, no observándose diferencias significativas. Sin embargo, ISG15 podría actuar a otro nivel del ciclo de multiplicación viral, por lo que se están realizando ensayos de rendimiento vírico extracelular mediante titulación, y de ISGilación mediante Western-blot. El hecho de que el cerebro sea el principal órgano diana para la multiplicación de betanodavirus, y el papel antiviral atribuido a la ISG15, junto con los resultados obtenidos, contribuyen a dilucidar la importancia de este gen frente a las infecciones por RGNNV en lubina, incrementándose el conocimiento del papel del sistema del IFN I en la defensa frente a las infecciones vírcas y la relación patógeno-hospedador.

Análise da interação entre moléculas desenhadas a partir do ácido anacárdico e a proteína PPAR usando ferramentas in silico

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2016.

Estudio de las modificaciones conformacionales y su influencia en la actividad inmunológica de péptidos derivados de las familias de las proteínas spect-1 y -2, siap-1 y -2 de plasmodium falciparum

SPECT-1 y -2 y SIAP-1 y -2 son proteínas pertenecientes al esporozoíto de Plasmodium falciparum causante de la malaria más agresiva en los humanos. Estas proteínas están involucradas en el paso del parásito a través de las células del hospedero humano y en la invasión del hepatocito, haciéndolas blancos atractivos para ser estudiadas. Péptidos conservados de alta capacidad de unión (cHABPs) a células HeLa y HepG2 derivados de estas moléculas son no inmunogénicos porque son incapaces de generar una respuesta inmunitaria, pero son claves para el parásito porque cumplen una función importante durante la infección del hospedero humano. En este trabajo se encontró que algunos cHABPs pertenecientes a las proteínas SPECT-1 y -2, están posiblemente involucrados con la unión y formación de poros sobre la membrana de las células hospederas, ayudando al esporozoíto a abrirse paso través de las células del hospedero. Por otro lado, con el fin de cambiar el comportamiento inmunológico de cHABPs derivados de SPECT-1 y -2 y SIAP-1 y -2, se obtuvieron nuevos péptidos mediante el reemplazo de aminoácidos críticos por otros residuos cuya masa molecular sea similar, pero diferente en su polaridad. En este trabajo se reporta que dichas modificaciones promovieron cambios en la estructura secundaria (determinada por DC o 1H-RMN) de los péptidos modificados (mHABPs) cuando se comparó con la estructura de los cHABPs nativos; adicionalmente, estos mHABPs invirtieron su comportamiento inmunológico convirtiéndose en péptidos inmunogénicos inductores de anticuerpos. Lo que permite establecer la existencia de una relación entre la estructura que adoptan estos mHABPs con su actividad inmunológica. Además, algunos de los mHABPs estudiados aquí, pueden ser candidatos a ser incluidos en la vacuna contra la malaria químicamente sintetizada multi-epitope y multi-estadio que se está desarrollando en la Fundación Instituto de Inmunología de Colombia (FIDIC).

Estudio conformacional de péptidos modificados de las proteínas STARP, CelTOS, TRSP y SERA 5 de Plasmodium falciparum y su relación con una respuesta inmune en malaria

El desarrollo de una vacuna contra malaria es un área de exploración activa pero con enormes retos debido especialmente a la complejidad del ciclo del parásito. Así, es necesario bloquear las diferentes etapas de la invasión que tiene el Plasmodium falciparum y extraer de ellas la mayor información posible de la artillería que utiliza para su ataque. Para esto, péptidos de las proteínas STARP, CelTOS y TRSP (del esporozoito) y SERA 5 (del merozoito) que tienen alta afinidad de unión a células HepG2 y a glóbulos rojos respectivamente (conocidos como cHABPs), han sido modificados (conocidos como mHABPs), sintetizados y evaluados a nivel de respuesta inmune en monos Aotus así como estudiados en su conformación estructural por RMN de 1H. Los resultados muestran que los péptidos nativos no son inmunogénicos, pero pueden inducir altos títulos de anticuerpos cuando sus residuos críticos o sus vecinos son reemplazados por otro con un volumen y masa similar, pero diferente polaridad. El estudio conformacional pone de manifiesto que las estructuras de los péptidos nativos son diferentes de sus péptidos modificados ya sea que muestren regiones estructuradas más cortas o más largas o que no presenten ninguna, en comparación con sus análogos modificados altamente inmunogénicos. Las características estereoquímicas particulares en las cadenas laterales de algunos residuos de aminoácidos de estos péptidos modificados así como los rasgos fisicoquímicos parecen jugar un rol importante en la respuesta inmune apropiada cuando estos fueron inmunizados en grupos de monos Aotus confiriendo un avance al diseño de una vacuna contra malaria totalmente eficaz.