Nested-PCR do gene que codifica o antígeno b aplicada ao diagnóstico da tuberculose pulmonar

A reação em cadeia da polimerase usada para amplificação de uma seqüência interna de um fragmento previamente amplificado (nested-PCR) foi investigada como uma alternativa complementar a pesquisa de bacilos álcool ácido resistentes e a cultura do Mycobacterium tuberculosis em meio de Lowenstein-Jensen. Foram investigadas 144 amostras de escarro de pacientes suspeitos de tuberculose encaminhados ao Laboratório de Tuberculose do Instituto Evandro Chagas em Belém, no período de junho de 2002 a dezembro de 2003. Das 144 amostras, 121 foram caracterizadas como tuberculose, 119 foram positivas na cultura, 95 na baciloscopia e 128 na nested-PCR. A sensibilidade da nested-PCR foi 96% (116/121), enquanto a especificidade foi 48% (11/23). A nested-PCR poderá ser uma ferramenta complementar para o diagnóstico da tuberculose, pois apresenta sensibilidade equivalente à cultura, no entanto, necessita de maiores avaliações visando minimizar o número de resultados falso-positivos.

Detection of human herpesvirus-7 by qualitative nested-PCR: comparison between healthy individuals and liver transplant recipients

Diagnosis of human herpesvirus-7 active infection in transplant patients has proved difficult, because this virus is ubiquitous and can cause persistent infections in the host. The significance of viral DNA detected in leukocytes by PCR is unclear and cross-reaction in serological tests may occur. This study aimed to evaluate nested-PCR to detect human herpesvirus-7 active infection in liver transplant recipients compared to healthy individuals. human herpesvirus-7 nested-PCR was performed on leukocytes and sera of 53 healthy volunteers and sera of 29 liver transplant recipients. In healthy volunteers, human herpesvirus-7 was detected in 28.3% of leukocytes and 0% of serum. human herpesvirus-7 was detected in sera of 48.2% of the liver transplant recipients. Nested-PCR on DNA extracted from leukocytes detected latent infection and the study suggests that nested-PCR performed on serum could be useful to detect human herpesvirus-7 active infection in liver transplant recipients.

Caracterização de múltiplos polimorfismos de Pneumocystis Jirovecii por multiplex-PCR/Single base extension

Pneumocystis jirovecii é conhecido por causar infecções específicas no aparelho respiratório de seus hospedeiros, principalmente em doentes imunocomprometidos, manifestando-se por uma pneumonia grave e por vezes fatal, normalmente designada por pneumonia por Pneumocystis. A caracterização da diversidade genética de P. jirovecii tem demonstrado que determinados polimorfismos de base única poderão ser reconhecidos como marcadores moleculares de eleição para o estudo da distribuição geográfica, vias de transmissão, resistência/susceptibilidade a fármacos, factores de virulência e genética populacional de subtipos genéticos. Este estudo teve como objectivo a caracterização de polimorfismos de P. jirovecii, através da metodologia PCR multiplex/Extensão de base única (do inglês single base extension), com a principal finalidade de constatar eventuais associações entre polimorfismos de base única, genótipos multilocus, e dados clínicos e demográficos da infecção. Sessenta e seis espécimes pulmonares, previamente considerados positivos para P. jirovecii, obtidos entre 2001 e 2012, a partir de doentes portugueses imunocomprometidos, foram seleccionados de forma aleatória para este estudo multilocus. PCR multiplex foi utilizada para a amplificação simultânea de três regiões genómicas: subunidade grande do rRNA mitocondrial, superóxido dismutase e dihidropteroato sintetase. Cinco polimorfismos de base única, previamente correlacionados com parâmetros da doença, foram genotipados por extensão de base única: mt85, SOD110, SOD215, DHPS165 e DHPS171. Um total de 330 polimorfismos de base única e 29 genótipos multilocus putativos de P. jirovecii foram identificados e caracterizados nos espécimes pulmonares analisados. Os padrões de distribuição dos polimorfismos foram analisados, sendo considerada a variação temporal e/ou geográfica das suas formas alélicas. Constatou-se grande diversidade genotípica entre os isolados de P. jirovecii que poderá ter influência a nível epidemiológico. Foram observadas associações estatísticas entre mt85/genótipos multilocus e parâmetros demográficos e clínicos. A correlação mais importante verificou-se entre mt85C e cargas parasitárias baixas a moderadas, enquanto mt85T foi associado com cargas parasitárias altas; MLG5, MLG9 e MLG13 foram associados com cargas parasitárias baixas, moderadas e altas, respectivamente. Tais associações demonstram que potenciais marcadores moleculares da infecção por P. jirovecii poderão existir e que polimorfismos/genótipos específicos poderão determinar perfis epidemiológicos da pneumonia por Pneumocystis. A análise genética cruzada permitiu verificar associações entre polimorfismos de base única. Os polimorfismos SOD110T e SOD215C, SOD110C e SOD215T, DHPS165A e DHPS171C, DHPS165G e DHPS171T foram associados estatisticamente. Os genótipos multilocus mais prevalentes foram considerados para o teste recombinatório d1. Dois genótipos multilocus (MLG7 e MLG9) foram observados com elevada frequência, e a análise genética indicou que estes se encontravam sobre-representados na população de P. jirovecii estudada. Estas evidências indicam que o fenómeno de desequilíbrio de ligação e a propagação clonal de subtipos genéticos é frequente, considerando que a espécie P. jirovecii poderá ser representada por uma população com estrutura epidémica. O presente trabalho confirmou a importância do estudo de polimorfismos em P. jirovecii, sugerindo que a caracterização multilocus poderá fornecer informação relevante para a compreensão dos padrões, causas e controlo da infecção, melhorando assim a investigação deste importante patogéneo.

Diferenciação de micobactérias por PCR multiplex

O trabalho visou à otimização de um método baseado na reação em cadeia da polimerase multiplex - para diferenciação de micobactérias de interesse para a saúde pública. A PCR Multiplex baseou-se na amplificação simultânea do genehsp65, presente em todo gênero Mycobacterium, do gene dnaJ, presente apenas em Mycobacterium tuberculosis e Mycobacterium avium e da sequência de inserção IS6110 presente no complexo Mycobacterium tuberculosis, gerando amplicons de 165pb, 365pb e 541pb, respectivamente. O limite de detecção foi de 1fg para o alvo hsp65, 100pg para o dnaJ e 0,1fg para o IS6110. A PCR multiplex detectou até 100pg de DNA de Mycobacterium tuberculosis. O sistema demonstrou ser específico e sensível na detecção de Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium avium e Mycobacterium smegmatis. Os resultados obtidos utilizando cepas de referência demonstraram que a PCR multiplex pode ser uma ferramenta rápida, sensível e específica na diferenciação de micobactérias.

Evaluation of the use of real-time PCR for human T cell lymphotropic virus 1 and 2 as a confirmatory test in screening for blood donors

INTRODUCTION: HTLV-1/2 screening among blood donors commonly utilizes an enzyme-linked immunosorbent assay (EIA), followed by a confirmatory method such as Western blot (WB) if the EIA is positive. However, this algorithm yields a high rate of inconclusive results, and is expensive. METHODS: Two qualitative real-time PCR assays were developed to detect HTLV-1 and 2, and a total of 318 samples were tested (152 blood donors, 108 asymptomatic carriers, 26 HAM/TSP patients and 30 seronegative individuals). RESULTS: The sensitivity and specificity of PCR in comparison with WB results were 99.4% and 98.5%, respectively. PCR tests were more efficient for identifying the virus type, detecting HTLV-2 infection and defining inconclusive cases. CONCLUSIONS: Because real-time PCR is sensitive and practical and costs much less than WB, this technique can be used as a confirmatory test for HTLV in blood banks, as a replacement for WB.

Identificação por PCR e sensibilidade a antifúngicos de isolados clínicos vaginais de Candida sp

INTRODUÇÃO: A candidíase vaginal é uma condição que afeta um grande número de mulheres em idade fértil. Candida albicans é a espécie mais frequentemente isolada de secreção vaginal, entretanto, outras espécies mais resistentes às drogas antifúngicas podem ser isoladas de amostras clínicas vaginais. MÉTODOS: Foram identificadas as espécies de 30 isolados vaginais de Candida sp por PCR utilizando o primer universal ITS4 e primers espécie-específicos para C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis e C. krusei. A sensibilidade destes isolados frente à anfotericina B, fluconazol e voriconazol foi determinada pelo método de macrodiluição M27-A2 do CLSI. RESULTADOS: Através dos ensaios de PCR, 28 isolados foram caracterizados como C. albicans e 2 isolados apresentaram amplificação para os primers específicos de C. albicans e C. glabrata. A concentração inibitória mínima para anfotericina B variou de 0,03µg/mL a 0,25µg/mL, para o fluconazol de 0,125µg/mL a 16µg/mL e para o voriconazol de 0,03µg/mL a 0,25µg/mL. CONCLUSÕES: A identificação de Candida ao nível de espécie através de ensaios de PCR deve ser relevante para o gerenciamento clínico destas infecções.

PCR detection of multiple human herpesvirus DNA in saliva from HIV-infected individuals in Teresina, State of Piauí, Brazil

INTRODUCTION: Human herpesviruses are frequently associated with orofacial diseases in humans (HSV-1, EBV, CMV and HHV-8), some can also cause systemic disease (CMV and HHV-8). The transmission of these viruses occurs by contact with infected secretions, especially saliva. Human immunodeficiency virus infection is associated with an increased risk of HHVs and related diseases. METHODS: This work aimed to detect HSV-1, EBV, CMV and HHV-8 DNA in saliva of HIV-infected patients from Teresina, northeast Brazil, by PCR and compare these findings with age and sex matched HIV-seronegative individuals. RESULTS: No difference in prevalence was verified between HHV detection in the saliva of HIV-seropositive individuals and controls. The individual frequencies of these viruses in these two populations were different. HIV seropositivity correlated positively with the presence of CMV (OR: 18.2, p= 0.00032) and EBV (OR: 3.44, p= 0.0081). No association between CD4 counts and the prevalence of HHVs in the saliva was observed; however, a strong association was determined between seropositivity and the presence of multiple HHV DNAs in saliva (OR: 4.83, p = 0.0028). CONCLUSIONS: These findings suggest the asymptomatic salivary shedding of HHVs is a common event between HIV-seropositive and seronegative individuals from Teresina, Piauí, Brazil, and, especially for HIV-seropositive patients, saliva is a risk factor for the acquisition/transmission of multiple HHVs.

A semi-nested PCR assay for molecular detection of Paracoccidioides brasiliensis in tissue samples

INTRODUCTION: Paracoccidioidomycosis is a systemic infection caused by Paracoccidioides brasiliensis. METHODS: In this study, a semi-nested PCR for paracoccidioidomycosis diagnosis was developed. The primers ITS1 and ITS4 were used in the first reaction, while the primers MJ03 and ITS1 primer were used in the second reaction. The semi-nested PCR was used to investigate biopsies of five patients with oral lesions that resembled paracoccidioidomycosis. RESULTS: The semi-nested PCR was positive for four samples and negative for a sample from a patient later diagnosed with leishmaniasis. CONCLUSIONS: The new semi-nested PCR describe is useful for paracoccidioidomycosis diagnosis.

Evidência de transmissão de leishmaniose visceral por Lutzomyia cruzi no município de Jaciara, Estado de Mato Grosso, Brasil

INTRODUÇÃO: O município de Jaciara foi classificado em 2003, como área de transmissão de leishmaniose visceral em situação de surto. O trabalho objetivou determinar evidência de transmissão de Leishmania (Leishmania) infantum chagasi por Lutzomyia cruzi no município de Jaciara, Estado de Mato Grosso, Brasil. MÉTODOS: O município situa-se a 127km da capital Cuiabá e é um importante ponto de atração para os praticantes de eco-turismo. Fêmeas de Lutzomyia cruzi, capturadas com armadilha de CDC, foram dissecadas para confirmação da espécie e armazenadas a -20ºC em pools de 10 indivíduos para extração de DNA, PCR genérico, RFLP específico e eletroforese em gel de poliacrilamida. RESULTADOS: O levantamento entomológico demonstrou a ocorrência abundante de Lutzomyia cruzi e ausência de Lutzomyia longipalpis, principal vetora da Leishmania (Leishmania) infantum chagasi. Uma das três amostras analisadas apresentou banda característica de DNA de Leishmania (120pb) em PCR genérico. Para confirmação da espécie de Leishmania, na RFLP utilizaram-se controles positivos de Leishmania (Leishmania) amazonensis, Leishmania (Viannia) braziliensis e Leishmania (Leishmania) infantum chagasi digeridas com enzima de restrição HaeIII. Constatou-se um padrão de bandas semelhante à Leishmania (Leishmania) infantum chagasi em uma amostra, confirmando a detecção de infecção natural de Leishmania (Leishmania) infantum chagasi em Lutzomyia cruzi. CONCLUSÕES: A ocorrência de casos humanos e cães positivos, a presença da Lutzomyia cruzi e a ausência de Lutzomyia longipalpis, bem como a detecção de infecção natural por Leishmania (Leishmania) infantum chagasi, evidenciam a participação de Lutzomyia cruzi na transmissão da leishmaniose visceral em Jaciara, Estado de Mato Grosso, Brasil.

Improvement of a PCR test to diagnose infection by Mansonella ozzardi

INTRODUCTION: Mansonelliasis is caused by Mansonella ozzardi. It is widespread in the Amazon region, with a high prevalence. The common exam of thick blood smears stained with Giemsa shows low efficacy levels and has been an obstacle to diagnosing individuals with low blood parasitemia. METHODS: In order to increase diagnosis efficacy, the PCR technique was improved. RESULTS AND CONCLUSIONS: PCR demonstrated the best performance, with sensitivity and negative predictive values (NPV) of 100%, followed by blood filtration through membrane filters, which showed a sensitivity of 88.9% and a NPV of 84.6%, when compared to thick blood smears.

Rapid detection of Van genes in rectal swabs by real time PCR in Southern Brazil

INTRODUCTION: Laboratory-based surveillance is an important component in the control of vancomycin resistant enterococci (VRE). METHODS: The study aimed to evaluate real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) (genes vanA-vanB) for VRE detection on 115 swabs from patients included in a surveillance program. RESULTS: Sensitivity of RT-PCR was similar to primary culture (75% and 79.5%, respectively) when compared to broth enriched culture, whereas specificity was 83.1%. CONCLUSIONS: RT-PCR provides same day results, however it showed low sensitivity for VRE detection.

Detection and molecular analysis of Toxoplasma gondii and Neospora caninum from dogs with neurological disorders

INTRODUCTION: Toxoplasma gondii and Neospora caninum are related Apicomplexa parasites responsible for systemic diseases in many species of animals, including dogs. METHODS: This study aimed to determine the occurrence of T. gondii and N. caninum infections in 50 dogs with neurological signs that were admitted to the Veterinary Hospital of Universidade Estadual Paulista, City of Botucatu, Brazil. All animals were screened for antibodies using an immunofluorescent antibody test for both parasites. Tissues of positive animals were bioassayed in mice (T. gondii) and gerbils (N. caninum), and DNA was analyzed using the polymerase chain reaction (PCR). Positive samples for T. gondii by PCR were typed using restriction fragment length polymorphism-PCR for 11 markers: SAG1, SAG2 (5′-3′-SAG2 and alt.SAG2), SAG3, Btub, GRA6, L358, c22-8, c29-6, PK1 and Apico, and CS3 marker for virulence analysis. RESULTS: Specific antibodies were detected in 11/50 (22%; 95% confidence interval (CI95%), 12.8-35.3%) animals for T. gondii and 7/50 (14%; CI95%, 7.02-26.3%) for N. caninum. In the bioassay and PCR, 7/11 (63.6%; CI95%, 34.9-84.8%) samples were positive for T. gondii and 3/7 (42.9%; CI95%I, 15.7-75.5%) samples were positive for N. caninum. Three different genotypes were identified, but only 1 was unique. CONCLUSIONS: These data confirm the presence of T. gondii and N. caninum in dogs from Brazil, indicating the importance of this host as a sentinel of T. gondii for human beings, and the genotypic variation of this parasite in Brazil.

Polymerase chain reaction and nested-PCR approaches for detecting Cryptosporidium in water catchments of water treatment plants in Curitiba, State of Paraná, Brazil

Introduction Cryptosporidium is an important protozoan cause of waterborne disease worldwide of concern to public health authorities. To prevent outbreaks of cryptosporidiosis, the monitoring of this parasite in drinking water is necessary. In the present work, the polymerase chain reaction (PCR) and nested-PCR techniques were used to detect Cryptosporidium in raw water from catchment points of four water treatment plants (WTP) in Curitiba, Paraná, Brazil. Methods First, DNA extraction techniques were tested in samples containing decreasing amount of oocysts in reagent water, and PCR and nested-PCR with specific primers for 18SSU rDNA of Cryptosporidium were conducted to determine their sensitivity. In reagent water, a commercial extraction kit provided the best analytical sensitivity, and PCR and nested-PCR allowed the detection of five and two oocysts, respectively, with the primers XIAOR/XIAOF and XIAO1F/XIAO2R. Results In the spiking experiments, only the PCR with the primers AWA995F/AWA1206R was successful at detecting concentrations of 0.1 oocysts/mL. Two catchments samples of raw water and/or water sludge from four WTPs were contaminated with Cryptosporidium. Conclusions The application of the techniques to monitor Cryptosporidium in water and detect contamination in water catchments of WTPs in Curitiba are discussed in the present work.

Monitoring Trypanosoma cruzi infection in triatomines using PCR in Mato Grosso do Sul, Brazil

Introduction The aim of the present study was to assess the polymerase chain reaction (PCR) as a method for detecting Trypanosoma cruzi infection in triatomines that had been previously determined by microscopic examination in the State of Mato Grosso do Sul, Brazil. Methods In total, 515 specimens were collected. Material from the digestive tract of each triatomine was analyzed for the presence of T. cruzi by microscopic examination and PCR using the 121/122 primer set. Results Among the 515 specimens tested, 58 (11.3%) were positive by microscopy and 101 (19.61%) were positive by PCR and there was an association between the results of the techniques (χ2 = 53.354, p = 0.001). The main species of triatomine identified was T. sordida (95.5%) Conclusions The use of PCR in entomological surveillance may contribute to a better assessment of the occurrence of T. cruzi in triatomine populations.

Comparison of conventional serology and PCR methods for the routine diagnosis of Trypanosoma cruzi infection

Introduction Trypanosoma cruzi, a flagellated protozoan, is the etiologic agent of Chagas disease, and it is estimated that approximately 5 million people in Brazil are infected with this parasite. This work aimed to compare the current diagnostic methods for Chagas disease, including conventional serological (IFAT and ELISA) and molecular techniques (PCR), to introduce PCR as an auxiliary technique. Methods A total of 106 chagasic patients were evaluated: 88 from endemic areas of Parana, 6 from São Paulo, 3 from Minas Gerais, 3 from Rio Grande do Sul, 1 from Bahia and 5 from the Santa Catarina T. cruzi outbreak. The samples were analyzed by conventional serological methods (IFAT, ELISA), hemoculture and PCR to confirm Chagas disease. Results When IFAT was used to determine antibody levels, the sensitivity was 81.7% for patients with the cardiac form of the disease and 100% for the other clinical forms. In contrast, ELISA showed 84% sensitivity and 100% specificity. The use of serological and molecular techniques and their implications for the diagnosis of Chagas disease in non-endemics area are discussed. Conclusions PCR constitutes an excellent support methodology for the laboratory diagnosis of Chagas disease due to its high sensitivity and specificity.