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The DNA-activated serine/threonine protein kinase (DNA-PK) is composed of a large (approximately 460 kDa) catalytic polypeptide (DNA-PKcs) and Ku, a heterodimeric DNA-binding component (p70/p80) that targets DNA-PKcs to DNA. A 41-kbp segment of the DNA-PKcs gene was isolated, and a 7902-bp segment was sequenced. The sequence contains a polymorphic Pvu II restriction enzyme site, and comparing the sequence with that of the cDNA revealed the positions of nine exons. The DNA-PKcs gene was mapped to band q11 of chromosome 8 by in situ hybridization. This location is coincident with that of XRCC7, the gene that complements the DNA double-strand break repair and V(D)J recombination defects (where V is variable, D is diversity, and J is joining) of hamster V3 and murine severe combined immunodeficient (scid) cells.
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The ability of DNA polymerases (pols) to catalyze the template-directed synthesis of duplex oligonucleotides containing a nonstandard Watson-Crick base pair between a nucleotide bearing a 5-(2,4-diaminopyrimidine) heterocycle (d kappa) and a nucleotide bearing either deoxyxanthosine (dX) or N1-methyloxoformycin B (pi) has been investigated. The kappa-X and kappa-pi base pairs are jointed by a hydrogen bonding pattern different from and exclusive of those joining the AT and GC base pairs. Reverse transcriptase from human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) incorporates dXTP into an oligonucleotide opposite d kappa in a template with good fidelity. With lower efficiency and fidelity, HIV-1 reverse transcriptase also incorporates d kappa TP opposite dX in the template. With d pi in the template, no incorporation of d kappa TP was observed with HIV reverse transcriptase. The Klenow fragment of DNA pol I from Escherichia coli does not incorporate d kappa TP opposite dX in a template but does incorporate dXTP opposite d kappa. Bovine DNA pols alpha, beta, and epsilon accept neither dXTP opposite d kappa nor d kappa TP opposite d pi. DNA pols alpha and epsilon (but not beta) incorporate d kappa TP opposite dX in a template but discontinue elongation after incorporating a single additional base. These results are discussed in light of the crystal structure for pol beta and general considerations of how polymerases must interact with an incoming base pair to faithfully copy genetic information.
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A system for tetracycline-regulated inducible gene expression was described recently which relies on constitutive expression of a tetracycline-controlled transactivator (tTA) fusion protein combining the tetracycline repressor and the transcriptional activation domain of VP16 [Gossen, M. & Bujard, H. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5547-5551]. This system yielded only low levels of transactivator protein, probably because tTA is toxic. To avoid this difficulty, we placed the tTA gene under the control of the inducible promoter to which tTA binds, making expression of tTA itself inducible and autoregulatory. When used to drive expression of the recombination activating genes 1 and 2 (RAG-1 and RAG-2), the autoregulatory system yielded both substantially higher levels of variable (diversity) joining [V(D)J] recombination activity (70-fold on average) and inducible expression in a much larger fraction of transfected cells (autoregulatory, 90%, vs. constitutive, 18%). In addition, this system allowed the creation of transgenic mice in which expression of a luciferase transgene was inducible tens to hundreds of times the basal levels in most tissues examined. Induced levels of expression were highest in thymus and lung and appear to be substantially higher than in previously reported inducible luciferase transgenic mice created with the constitutive system. With the modified system, inducible transactivator mRNA and protein were easily detected in cell lines by RNA and Western blotting, and transactivator mRNA was detected by RNA blotting in some tissues of transgenic mice. This autoregulatory system represents an improved strategy for tetracycline-regulated gene expression both in cultured cells and in transgenic animals.
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To determine whether T-cell-receptor (TCR) usage by T cells recognizing a defined human tumor antigen in the context of the same HLA molecule is conserved, we analyzed the TCR diversity of autologous HLA-A2-restricted cytotoxic T-lymphocyte (CTL) clones derived from five patients with metastatic melanoma and specific for the common melanoma antigen Melan-A/MART-1. These clones were first identified among HLA-A2-restricted anti-melanoma CTL clones by their ability to specifically release tumor necrosis factor in response to HLA-A2.1+ COS-7 cells expressing this tumor antigen. A PCR with variable (V)-region gene subfamily-specific primers was performed on cDNA from each clone followed by DNA sequencing. TCRAV2S1 was the predominant alpha-chain V region, being transcribed in 6 out of 9 Melan-A/MART-1-specific CTL clones obtained from the five patients. beta-chain V-region usage was also restricted, with either TCRBV14 or TCRBV7 expressed by all but one clone. In addition, a conserved TCRAV2S1/TCRBV14 combination was expressed in four CTL clones from three patients. None of these V-region genes was found in a group of four HLA-A2-restricted CTL clones recognizing different antigens (e.g., tyrosinase) on the autologous tumor. TCR joining regions were heterogeneous, although conserved structural features were observed in the complementarity-determining region 3 sequences. These results indicate that a selective repertoire of TCR genes is used in anti-melanoma responses when the response is narrowed to major histocompatibility complex-restricted antigen-specific interactions.
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IgM antibodies are secreted as multisubunit polymers that consist of as many as three discrete polypeptides: mu heavy chains, light (L) chains, and joining (J) chains. We wished to determine whether L chains that are required to confer secretory competence on immunoglobulin molecules must be present for IgM to polymerize--that is, for intersubunit disulfide bonds to form between mu chains. Using a L-chain-loss variant of an IgM-secreting hybridoma, we demonstrated that mu chains were efficiently polymerized independent of L chains, in a manner similar to that observed for conventional microL complexes, and that the mu polymers incorporated J chain. These mu polymers were not secreted but remained associated with the endoplasmic reticulum-resident chaperone BiP (GRP78). This finding is consistent with the endoplasmic reticulum being the subcellular site of IgM polymerization. We conclude that mu chain alone has the potential to direct the polymerization of secreted IgM, a process necessary but not sufficient for IgM to attain secretory competence.
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Este estudo teve como objetivos (a) identificar mecanismos pelos quais rearranjos cromossômicos citogeneticamente equilibrados possam estar associados de maneira causal a determinados quadros clínicos e (b) contribuir para a compreensão dos mecanismos de formação desses rearranjos. Para isso, foram estudados 45 rearranjos cromossômicos citogeneticamente equilibrados (29 translocações, 10 inversões e seis rearranjos complexos), detectados em pacientes que apresentavam malformações congênitas, comprometimento do desenvolvimento neuropsicomotor ou déficit intelectual. Foram 31 rearranjos cromossômicos esporádicos, três familiais que segregavam com o quadro clínico e mais 11 rearranjos cromossômicos herdados de genitores fenotipicamente normais. Inicialmente os pontos de quebra desses rearranjos foram mapeados por hibridação in situ fluorescente (FISH). A busca por microdeleções e duplicações genômicas foi realizada por a-CGH. A investigação dos pontos de quebra prosseguiu com a aplicação da técnica de Mate-Pair Sequencing (MPS), que permite localizar as quebras em segmentos de 100 pb - 1 kb, na maioria dos casos. Para obter os segmentos de junção das quebras no nível de pares de bases, os segmentos delimitados por MPS foram sequenciados pelo método de Sanger. A análise por aCGH revelou microdeleções ou microduplicações localizadas nos cromossomos rearranjados, em 12 dos 45 pacientes investigados (27%). A análise de 27 rearranjos por MPS permitiu a caracterização dos pontos de junção das quebras. MPS expandiu o número de pontos de quebra, detectados por análise do cariótipo ou aCGH, de 114 para 156 (em resolução < 2kb, na maioria dos casos). O número de pontos de quebra/rearranjo variou de 2 a 20. Os 156 pontos de quebra resultaram em 86 variantes estruturais equilibradas e outras 32 variantes não equilibradas. Perdas e ganhos de segmentos submiscroscópicos nos cromossomos rearranjados constituíram a principal causa ou, provavelmente, contribuíram para o quadro clínico de 12 dos 45 pacientes. Em cinco desses 12 rearranjos foram detectadas por MPS a interrupção de genes já relacionados à doença, ou provável alteração de sua região reguladora, contribundo para o quadro clínico. Em quatro dos 33 rearranjos não associados a perdas ou ganhos de segmentos, a análise por MPS revelou a interrupção de genes que já foram anteriormente relacionados a doenças, explicando-se, assim, as características clínicas dos portadores; outro rearranjo pode ter levando alteração da expressão gênica de gene sensível a dosagem e ao quadro clínico. Um rearranjo cromossômico familial, identificado na análise após bandamento G como uma translocação equilibrada, t(2;22)(p14;q12), segregava com quadro de atraso do desenvolvimento neuropsicomotor e dificuldade de aprendizado associados a dismorfismos. A combinação das análises por FISH, aCGH e MPS revelou que se tratava, na verdade, de rearranjo complexo entre os cromossomos 2, 5 e 22, incluindo 10 quebras. A segregação de diferentes desequilíbrios submicroscópicos em indivíduos afetados e clinicamente normais permitiu a compreensão da variabilidade clínica observada na família. Rearranjos equilibrados detectados em indivíduos afetados, mas herdados de genitores clinicamente normais, são, em geral, considerados como não tendo relação com o quadro clínico, apesar da possibilidade de desequilíbrios cromossômicos gerados por permuta desigual na meiose do genitor portador do rearranjo. Neste trabalho, a investigação de 11 desses rearranjos por aCGH não revelou perdas ou ganhos de segmentos nos cromossomos rearranjados. No entanto, a análise por aCGH da portadora de um desses rearranjos - inv(12)mat - revelou deleção de 8,7 Mb no cromossomo 8, como causa de seu fenótipo clínico. Essa deleção estava relacionada com outro rearranjo equilibrado também presente em sua mãe, independente da inversão. Para compreender os mecanismos de formação de rearranjos citogeneticamente equilibrados, investigamos os segmentos de junção no nível de pares de base. A análise por MPS que levou, na maioria dos casos, ao mapeamento dos pontos de quebras em segmentos <1kb permitiu o sequenciamento pelo método de Sanger de 51 segmentos de junções de 17 rearranjos. A ocorrência de blunt fusions ou inserções e deleções <10 pb, e a ausência de homologia ou a presença de micro homologia de 2 pb a 4 pb de extensão indicaram o mecanismo de junção de extremidades não homólogas (non-homologous end joinging; NHEJ), na maioria das 51 junções caracterizadas. As características de três dos quatro rearranjos mais complexos, com 17-20 quebras, indicaram sua formação pelo mecanismo de chromothripsis. Este estudo mostra a importância da análise genômica de variações de número de cópias por microarray, juntamente com o mapeamento dos pontos de quebra por MPS, para determinar a estrutura de rearranjos cromossômicos citogeneticamente equilibrados e seu impacto clínico. O mapeamento dos segmentos de junção por MPS, permitindo o sequenciamento pelo método de Sanger, foi essencial para a compreensão de mecanismos de formação desses rearranjos
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Materiais compósitos são projetados e fabricados para várias aplicações de alto desempenho, incluindo componentes para os segmentos automobilístico, aeroespacial, aeronáutico, naval, de defesa, de óleo e gás, energia eólica e até equipamentos esportivos. Porém, a união por soldagem de Compósitos de Matriz Metálica de Alumínio (Al-CMM) ainda é um grande obstáculo para a maior disseminação desta classe de materiais estruturais. As mudanças microestruturais decorrentes do ciclo de soldagem e/ou do tratamento térmico afetam sensivelmente as propriedades mecânicas e físico-químicas finais da junta e do metal base nas proximidades de mesma, daí a importância de se estudar a evolução microestrutural que prospera nestas etapas. O presente trabalho caracterizou a microestrutura do compósito liga-A356/SiCp soldado por laser de fibra de Itérbio, empregando-se nessa tarefa técnicas de microscopia óptica, radiografia e microscopia eletrônica de varredura, assim como difração de raios-X e de elétrons retroespalhados, ensaio instrumentado de dureza e microtomografia computadorizada. O foco das análises realizadas restringiu-se à geometria dos cordões de solda, à expulsão de SiC particulado da zona soldada, à volatilização de elementos químicos da poça de soldagem, à formação de precipitados fragilizantes de Al4SiC4 em formato de agulhas no cordão de solda e à determinação das regiões com concentração de poros, todos estes fenômenos tendo efeitos nocivos, em maior ou menor extensão, no desempenho global da junta do Al-CMM soldada a laser, notadamente em suas propriedades mecânicas e eletroquímicas.
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Esta tese tem por objetivo a aplicação do processamento por atrito linear na liga de titânio Ti-6Al-4V. Derivado da solda por atrito linear, é um processo recente desenvolvido na década de 90 para união de alumínio. Sua aplicação em outros tipos de materiais como aços e ligas de alto desempenho, em especial o titânio, tem interessado a industria. A metodologia utilizada nesta tese para avaliar o processamento por atrito linear, consistiu na execução de ensaios mecânicos de tração em condições mistas em chapas da liga de titânio Ti-6Al-4V. A máquina utilizada para o processamento das chapas foi um centro de usinagem CNC convencional, adaptado com dispositivos especiais. Além dos ensaios de tração em condições mistas, foram executadas medições de microdurezas nas regiões atingidas pelo processo, avaliação das microestruturas resultantes e medições de tensão residual para uma caracterização mais ampla do processo. As microestruturas na região processada são caracterizadas por uma estrutura totalmente transformada. As temperaturas de pico na região processada excederam a temperatura -transus durante o processamento e a transformação da fase + ocorreu durante a fase de resfriamento. A transformação da fase para resultou na formação de agulhas de fase nos contornos e pelo interior dos grãos da fase . Pequenas regiões com estrutura equiaxial de grãos ( globular) foram observados na zona de processamento. A abordagem dos resultados quantitativos foi feita de forma estatística, visando identificar os parâmetros de maior interação com os resultados observados. Foi identificado nesta tese que a rotação da ferramenta apresentou a maior influência nos resultados de tensão residual, microdureza e tensão de escoamento. Uma importante contribuição à modelagem da tensão de escoamento para materiais anisotrópicos é proposta, baseado em um critério de escoamento ortotrópico. Equações complementares baseadas nos testes mistos de tração e cisalhamento são propostas para modificar o modelo ortotrópico. O intuito deste modelo é indicar em que condições o material tem seu regime de escoamento atingido, podendo servir de base para simulações práticas de peças em condições similares.
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A batata-da-serra, Ipomoea serrana Sim.-Bianch. & L.V. Vasconcelos, é uma liana endêmica da Chapada Diamantina, Bahia, cuja raiz tuberosa e consumida por populações humanas ha muitos anos. Apesar da espécie, classificada como vulnerável pela IUCN (União Internacional para a Conservação da Natureza), estar submetida à pressão antrópica devido à exploração de raízes tuberosas, para uso na alimentação, são raros os estudos com a espécie, razão pela qual e de grande importância conhecer a diversidade e estrutura genética da espécie. Estudos sobre diversidade e estrutura genética a partir de marcadores moleculares são importantes por fornecerem dados sobre impactos da exploração antrópica sobre as populações, podendo oferecer subsídio para planos de manejo e conservação de espécie. Cinco populações da Chapada Diamantina, constituindo um total de 142 indivíduos, foram investigados com quatro iniciadores Inter Simple Sequence Repeats (ISSR), resultando em 34 bandas, das quais 25 foram polimórficas. A analise dos parâmetros genéticos mostrou que as populações apresentam variabilidade moderada, com 73,8% de bandas polimórficas, 0,264 de índice de diversidade de Nei e 0,389 de índice de Shannon (valores médios). A maior parte da variação ocorreu dentro das populações (77%), estimado pela analise de variância molecular (AMOVA), enquanto que a variação entre populações foi de 23%, o que corroborou os resultados de estruturação obtidos pelo programa Structure, analise de coordenadas principais (PCoA) e agrupamento estimado pelo método Neighbor-Joining, a partir do coeficiente de dissimilaridade de Jaccard. A analise Bayesiana separou os indivíduos em quatro grupos, sendo que as populações Andaraí e Capão foram alocadas em grupos distintos, enquanto as outras três populações compartilharam indivíduos distribuídos em outros dois grupos. Este estudo, por seu caráter pioneiro com relação aos marcadores moleculares, constituiu o primeiro passo para o conhecimento da diversidade genética da espécie. Estudos futuros poderão ampliar o conhecimento sobre a espécie podendo oferecer subsidio para a elaboração de um plano de manejo para esta espécie que tem sido explorada na região.
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This study analyzes the effect on levels of patient anxiety and depression of a partner joining a cardiac rehabilitation program support group, also taking into account the sex of the patient. The study was undertaken using a two-group comparison design with pre-and post-test measures in non-equivalent groups. The sample comprised patients in the cardiac rehabilitation program (CRP) at the Ramón y Cajal Hospital, Madrid (Spain). Analysis of covariance (ANCOVA) showed direct effects of sex and partner participation in support groups on the anxiety trait. Similarly, interaction effects were observed between the sex variable and partner participation. These results indicate the pertinence of designing separate groups for patients and partners. © 2014 Universidad Complutense de Madrid and Colegio Oficial de Psicólogos de Madrid.
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As recentes descobertas de petróleo e gás na camada do Pré-sal representam um enorme potencial exploratório no Brasil, entretanto, os desafios tecnológicos para a exploração desses recursos minerais são imensos e, consequentemente, têm motivado o desenvolvimento de estudos voltados a métodos e materiais eficientes para suas produções. Os tubos condutores de petróleo e gás são denominados de elevadores catenários ou do inglês \"risers\", e são elementos que necessariamente são soldados e possuem fundamental importância nessa cadeia produtiva, pois transportam petróleo e gás natural do fundo do mar à plataforma, estando sujeitos a carregamentos dinâmicos (fadiga) durante sua operação. Adicionalmente, um dos problemas centrais à produção de óleo e gás das reservas do Pré-Sal está diretamente associado a meios altamente corrosivos, tais como H2S e CO2. Uma forma mais barata de proteção dos tubos é a aplicação de uma camada de um material metálico resistente à corrosão na parte interna desses tubos (clad). Assim, a união entre esses tubos para formação dos \"risers\" deve ser realizada pelo emprego de soldas circunferenciais de ligas igualmente resistentes à corrosão. Nesse contexto, como os elementos soldados são considerados possuir defeitos do tipo trinca, para a garantia de sua integridade estrutural quando submetidos a carregamentos cíclicos, é necessário o conhecimento das taxas de propagação de trinca por fadiga da solda circunferencial. Assim, neste trabalho, foram realizados ensaios de propagação de trinca por fadiga na região da solda circunferencial de Inconel® 625 realizada em tubo de aço API 5L X65 cladeado, utilizando corpos de prova do tipo SEN(B) (Single Edge Notch Bending) com relações entre espessura e largura (B/W) iguais a 0,5, 1 e 2. O propósito central deste trabalho foi de obter a curva da taxa de propagação de trinca por fadiga (da/dN) versus a variação do fator de intensidade de tensão (ΔK) para o metal de solda por meio de ensaios normatizados, utilizando diferentes técnicas de acompanhamento e medição da trinca. A monitoração de crescimento da trinca foi feita por três técnicas: variação da flexibilidade elástica (VFE), queda de potencial elétrico (QPE) e análise de imagem (Ai). Os resultados mostraram que as diferentes relações B/W utilizadas no estudo não alteraram significantemente as taxas de propagação de trinca por fadiga, respeitado que a propagação aconteceu em condições de escoamento em pequena escala na frente da trinca. Os resultados de propagação de trinca por fadiga permitiram a obtenção das regiões I e II da curva da/dN versus ΔK para o metal de solda. O valor de ΔKlim obtido para o mesmo foi em torno de 11,8 MPa.m1/2 e os valores encontrados das constantes experimentais C e m da equação de Paris-Erdogan foram respectivamente iguais a 1,55 x10-10 [(mm/ciclo)/(MPa.m1/2)m] e 4,15. A propagação de trinca no metal de solda deu-se por deformação plástica, com a formação de estrias de fadiga.
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Since the changing of the political and economic system in 1989-1990 in Hungary, volunteer movements have appeared all over the country. Volunteers of different ages and socioeconomic backgrounds are engaged in a wide range of activities, wishing to add values to the lives of others in need, hoping to improve their micro or/and macro environment. Volunteering has also appeared in the field of sport, and the work of a large number of nongovernmental sport organisations is strongly dependent on volunteers’ participation. In the socialist era disability sports were neglected by the state. The new democratic state has been paying increasing attention to disability sports and volunteers have been a great asset in improving the accessibility of spare time sport activities. The present empirical research investigates which factors motivate sighted volunteers to join Hungarian Sports and Leisure Association for the Visually Impaired (Látássérültek Szabadidős Sportegyesülete, LÁSS). Results confirm that joining LÁSS was in few cases (N=3) attributed to having parental or other family relations with blind or partially sighted people. Respondents unanimously admit to have a wish to share the joy of physical activity with their visually impaired peers.
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We report near-infrared radial velocity (RV) measurements of the recently identified donor star in the high mass X-ray binary (HMXB) system OAO 1657−415 obtained in the H band using ISAAC on the Very Large Telescope. Cross-correlation methods were employed to construct a RV curve with a semi-amplitude of 22.1 ± 3.5 km s−1. Combined with other measured parameters of this system it provides a dynamically determined neutron star (NS) mass of 1.42 ± 0.26 M⊙ and a mass of 14.3 ± 0.8 M⊙ for the Ofpe/WN9 highly evolved donor star. OAO 1657−415 is an eclipsing HMXB pulsar with the largest eccentricity and orbital period of any within its class. Of the 10 known eclipsing X-ray binary pulsars OAO 1657−415 becomes the ninth with a dynamically determined NS mass solution and only the second in an eccentric system. Furthermore, the donor star in OAO 1657−415 is much more highly evolved than the majority of the supergiant donors in other HMXBs, joining a small but growing list of HMXBs donors with extensive hydrogen depleted atmospheres. Considering the evolutionary development of OAO 1657−415, we have estimated the binding energy of the envelope of the mass donor and find that there is insufficient energy for the removal of the donor’s envelope via spiral-in, ruling out a common envelope evolutionary scenario. With its non-zero eccentricity and relatively large orbital period the identification of a definitive evolutionary pathway for OAO 1657−415 remains problematic, we conclude by proposing two scenarios which may account for OAO 1657−415 current orbital configuration.
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El reciente hallazgo de los Protocolos Testamentarios Francisco Xavier Balmis (1753-1819), director de la Real Expedición Filantrópica de la Vacuna, constituye una nueva fuente documental para explorar su perfil biográfico. Balmis redactó un total de cinco testamentos que abarcan el periodo de 1803-1818 y coinciden con momentos cruciales de su vida. Su análisis ha permitido establecer interesantes observaciones que certifican su inseguridad personal antes de afrontar la expedición, su desamparo al ser despojado de sus bienes por adherirse a la causa monárquica frente a Napoleón, el consuelo al serle restituidos sus honores y hacienda o la entereza para afrontar sus últimos momentos. Revelan que Balmis supo hacer de la carrera profesional como cirujano militar un instrumento para alcanzar el prestigio social, y desmienten los supuestos sobre un final oscuro. El inventario de sus bienes ratifica su desahogada situación económica y su capacidad para gestionarlos. Las fuentes notariales se acreditan con este caso de Balmis, un funcionario de la Corona, como un ejemplo para el estudio de las oligarquías urbanas del Antiguo Régimen.
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El Tratado histórico y práctico de la vacuna de Moreau de la Sarthe, traducido por Francisco Xavier de Balmis y publicado en 1803, fue uno de los protagonistas de la Real Expedición Filantrópica de la Vacuna, convirtiéndose en el primer Manual de Vacunaciones oficial reconocido así por un gobierno. En 1801, Balmis decide traducirlo, y se suma a la primera hornada de difusores del método de Edward Jenner en España. Analizamos el procedimiento a que fue sometido desde su envío para revisión hasta su edición final, en el que transcurren 16 meses. Tras una remisión incompleta, el revisor señala a Balmis errores en el estilo, en la propia traducción y omisiones a pasajes de la obra original. La decisión final tras las correcciones fue de aceptación, aunque no obtuvo la autorización deseada por Balmis para incluir una dedicatoria a la Reina, hecho que incrementaría su impacto, justificado en la consideración de que no era una obra singular en su género o de un mérito sobresaliente. Finalmente, Balmis lo dedica a las madres de familia. Con una tirada inicial de 500 ejemplares y una inmediata posterior de 2000, tuvo una amplia difusión en la América latina. El estudio destaca la influencia de los evaluadores en la calidad de la producción científica.