Elevated hepatocyte paraffin 1 and neprilysin expression in hepatocellular carcinoma are correlated with longer survival

Résumé de l'article Le carcinome hépatocellulaire reste une tumeur maligne de mauvais pronostic. Le but de cette étude rétrospective est d'étudier l'expression immunohistochimique semi-quantitative d'Hep Par 1 (hepatocyte paraffin 1) et de CD 10 (CALLA ou neprilysin) et leur valeur pronostique sur un collectif de 97 patients avec un carcinome hépatocellulaire traité à visée curative. Hep Par 1 réagit avec un épitope spécifique de l'hépatocyte au niveau de la membrane mitochondriale et se présente sous forme d'un marquage cytoplasmique diffus d'intensité variable, le foie non tumoral exprimant un marquage granulaire servant de contrôle interne positif. Le CD 10 correspond ä une metallopeptidase de la membrane cellulaire participant au processus de sécrétion hormonale et l'immunoréaction colore spécifiquement la portion luminale des canalicules biliaires du foie non tumoral, qui sert ainsi de contrôle interne positif. Le foie tumoral exprime ou non un marquage canaliculaire (CD 10 can), similaire au foie non tumoral, ou cytoplasmique (CD 10 cyt). Le marquage immunohistochimique est quantifié pour les 3 différents marqueurs (Hep Par 1, CD10 can et CD10 cyt) en fonction du pourcentage de cellules tumorales positives (score de 0 à 3 établi pour chaque marqueur immunohistochimique). L'élaboration d'un score combiné immunohistochimique (CIS) est obtenu en additionnant les scores d'Hep Par 1 et de CD10 con et en soustrayant le score de CD10 cyt. Dans l'analyse univariée, la survie globale des patients est prolongée de manière significative en cas de forte expression tumorale par Hep Par 1 (p=0,0005) et CD10 can (p=0,02). Dans l'analyse multivariée, la combinaison du CIS avec les autres paramètres histopathologiques pronostiques classiques du carcinome hépatocellulaire comme la taille tumorale, l'invasion vasculaire, la multifocalité de la tumeur et le grade tumoral montre que le score immunohistochimique combiné (CIS) reste le facteur pronostique le plus important (p=0,001). Les patients avec un CIS bas (<4) avec une survie moyenne de 17 mois ont 3,5 fois plus de risque de décès comparés à ceux avec un CIS élevé (>4) avec une survie moyenne de plus de 80 mois. En conclusion, une expression immunohistochimique élevée d'Hep Par 1 et de CD10 can en l'absence d'expression de CD10 cyt sont des facteurs pronostiques favorables pour les patients présentant un carcinome hépatocellulaire. La combinaison des marqueurs immunohistochimiques dans un score combiné pourrait être utilisé dans la prise en charge des patients avec un hépatocarcinome àvisée curative. Toutefois des études prospectives restent nécessaires pour confirmer l'utilité pronostique du CIS.

Role of forkhead transcription factor FOXC2 in lymphatic vascular developement

Le système vasculaire lymphatique est le second réseau de vaisseaux du corps humain. Sa fonction principale est de retourner le fluide interstitiel excédentaire au système cardiovasculaire. Il est également impliqué dans la défense immunitaire de l'organisme, ainsi que dans le transport initial des graisses alimentaires. De multiples pathologies sont associées au dysfonctionnement du développement vasculaire lymphatique, dont les lymphoedèmes. Un des gènes clés dans le contrôle de l'étape de maturation du système lymphatique est le facteur de transcription FOXC2. De précédentes études utilisant des modèles génétiques mutins déficients en Foxc2 ont montré son rôle dans la régulation du processus de spécification des vaisseaux lymphatiques en capillaires versus vaisseaux collecteurs, ainsi que dans la formation des valves lymphatiques. Chez l'homme, les mutations dans le gène FOXC2 causent le syndrome lymphoedème- distichiasis. Dans ce travail, nous avons étudié les mécanismes moléculaires qui régulent l'expression et l'activité de FOXC2 dans les vaisseaux lymphatiques. Nous avons découvert que la fonction de FOXC2 est régulée par phosphorylation de la protéine, qui détermine son activité transcriptionnelle au niveau génomique, jouant ainsi un rôle important dans le développement vasculaire in vivo. Les vaisseaux lymphatiques sont soumis à des forces de stress générées par le flux de la lymphe (FSS). Nous avons donc testé l'hypothèse que ces forces contribuent à la morphogenèse et à l'organisation des vaisseaux lymphatiques. In vitro, les cellules endothéliales lymphatiques répondent aux forces mécaniques, qui induisent l'expression de FOXC2, activent la voie de signalisation Ca2+/calcineurin/NFATcl et régulent l'expression de la protéine de jonction gap connexin37. Nous avons également montré que le stress de flux mécanique, FOXC2, calcineurin/NFATcl et connexin37 coopèrent dans le contrôle de la maturation des vaisseaux lymphatiques in vivo. En dernier lieu, nous avons cherché à identifier les récepteurs de surface cellulaires permettant le transfert du signal de stress mécanique qui induit l'expression de FOXC2. Nous présentons ici des données préliminaires, qui suggèrent le rôle de la voie de signalisation TGFß ainsi que l'implication des jonctions adhérentes dans ce processus. En conclusion, la présente étude met en lumière les mécanismes de l'activité de FOXC2 dans les cellules endothéliales lymphatiques et l'importance du rôle des forces mécaniques de flux dans le contrôle de son l'expression, ainsi que dans le développement et la fonction du système vasculaire lymphatique. - The lymphatic vascular system is a second vascular system of human body. Its main fonction is to transfer excess interstitial fluid back to cardiovascular system. In addition, it is involved in immune defense and responsible for the uptake of dietary fat. A number of pathologies called lymphedemas are associated with lymphatic vascular system dysfunction. Hereditary lymphedemas are caused by mutations in genes controlling lymphatic vascular development. One of the key genes responsible for lymphatic vascular maturation is forkhead transcription factor FOXC2. Previous studies of Foxc2 knockout mice showed that Foxc2 controls the process of lymphatic capillary versus collecting vessel fate specification and formation of lymphatic valves. Importantly, mutations in FOXC2 cause human lymphedema-distichiasis syndrome. In this work we investigated the molecular mechanisms regulating the expression and activity of FOXC2 in lymphatic vasculature. We discovered that FOXC2 function is regulated by phosphorylation. We describe how phosphorylation controls FOXC2 transcriptional activity on a genome-wide level and show that FOXC2 phosphorylation plays an important role in vascular development in vivo. Lymphatic vessels are subjected to fluid shear stress (FSS). Therefore we investigated whether mechanical forces contribute to lymphatic vascular patterning and morphogenesis. We found that FSS induces the expression of FOXC2, activates Ca2+/calcineurin/NFATcl signaling and induces the expression of gap junction protein connexin37 in lymphatic endothelial cells in vitro. Importantly, we were able to show that shear stress, FOXC2, calcineurin/NFATcl and connexin37, control maturation of lymphatic vessels in vivo. Finally, we searched for cell surface receptors that mediate the induction of FOXC2 by shear stress, and we present some preliminary data, suggesting the role of TGF-beta signaling and adherens junctions in this process. In conclusion, the present study sheds light on the mechanisms of FOXC2 activity and suggests an important role of mechanical forces in controlling FOXC2 expression as well as lymphatic system development and function.

Studying the molecular causes of ageing in ants

RÉSUMÉ DE THÈSE Au cours de ma thèse, je me suis intéressée aux causes physiologiques du vieillissement en utilisant les fourmis comme modèle. Les trois castes de fourmis - les mâles, les ouvrières et les reines - présentent des longévités très différentes, tout en étant génétiquement identiques. Ceci implique que les différences de longévité sont dues à des variations entre castes dans le pattern d'expression de gènes. Mon travail chez la fourmi a consisté d'une part à mettre en place les outils pour identifier de tels gènes à grande échelle, de l'autre à étudier le rôle de gènes et de mécanismes qui affectent la longévité chez d'autres espèces. Pour identifier de nouveaux gènes potentiellement impliqués dans le vieillissement, nous avons développé des puces à ADN. Cette technique permet la comparaison du niveau d'expression de milliers de gènes entre deux échantillons. L'application de cette méthode aux reines et ouvrières adultes nous a jusqu'à présent permis d'identifier neuf gènes surexprimés chez les reines. Trois d'entre eux sont potentiellement impliqués dans le maintien et la réparation du soma, deux processus qui sont supposés avoir un impact crucial sur la longévité. Parmi les mécanismes impliqués dans le vieillissement chez d'autres espèces, nous nous sommes principalement intéressés aux télomères, qui sont les extrémités des chromosomes. Chez les vertébrés, les télomères se raccourcissent à chaque division cellulaire, entre autres parce que l'ADN polymérase ne peut répliquer cette partie des chromosomes en entier. Or des télomères courts entravent la prolifération des cellules et peuvent même induire l'apoptose, ce qui pourrait se répercuter sur la capacité des organismes à régénérer des tissus. J'ai pu montrer que chez les fourmis mâles (la caste qui vit le moins longtemps) les télomères se raccourcissent beaucoup plus vite que chez les reines et les ouvrières. L'explication la plus plausible pour cette différence est que les mâles, étant adapté à une vie très éphémère, n'investissent qu'un minimum d'énergie dans la machinerie de maintenance qui assure le bon fonctionnement des cellules. Ces résultats sont intéressants car ils permettent pour la première fois de faire le lien entre les théories évolutives du vieillissement et la biologie des télomères. THESIS ABSTRACT During my thesis I used ants as a model to study the proximate (i.e., molecular) causes of ageing and lifespan determination. Ant queens, workers and males differ tremendously in lifespan, although all three castes are genetically identical. Importantly, this implies that genes and molecular pathways responsible for modulating lifespan are regulated in a caste-specific manner. To find new genes potentially involved in ageing, we first constructed 371-gene-cDNA microarrays for the ant L. niger. This molecular tool can be used to survey the relative gene expression levels of two samples for thousands of genes simultaneously. By applying this method to adult queens and workers we identified nine genes that are overexpressed in queens. Three of them are putatively involved in somatic maintenance and repair, two processes that have been previously suggested as important for ageing and lifespan determination. We expect to identify many more candidate genes in the near future by using the 9000-gene fire ant microarrays we have recently developed. We also investigated whether factors linked to ageing in other organisms could affect lifespan determination in ants. One project was on telomeres, the ends of linear chromosomes. For various reasons telomeres shorten with every cell division. Since short telomeres can lead to cellular defects such as impaired cell division, telomeres have been hypothesized as playing a role in ageing. We tested whether telomere length in ant somatic tissues correlates with caste-specific lifespan in young adults. The short-lived L. niger mates did indeed have significantly shorter telomeres than the longer-lived queens and workers, probably because telomere attrition is faster in males than in queens and workers. Queens did not, however, have longer telomeres than the shorter-lived workers. These findings are consistent with the idea that telomere length may play a role in ageing under some circumstances, but they also clearly demonstrate that other factors must be involved. We argue that sex-specific telomere length patterns in ants ultimately reflect adaptive differences in the level of somatic maintenance between males and females, and thus create a link between telomere biology and the evolutionary theory of ageing.

The JAK2/STAT3 pathway in the embryonic chick heart submitted to anoxia, reoxygenation and oxidant stress

SUMMARYAim: The embryonic/fetal heart is highly sensitive to oxygenation level and a transient uteroplacental hypoperfusion can lead to oxyradicals overproduction. Information about the molecular mechanisms underlying ischemia-reperfusion (I-R) injury in the developing heart is lacking. The Janus Kinase 2 / Signal Transducer and Activator of Transcription 3 (JAK2/STAT3) pathway, required for cardiogenesis and involved in protection of the adult heart against I-R, could also play a key role in the response of the fetal myocardium to transient oxygen deprivation. The aim of the study was to characterize the involvement of JAK2/STAT3 pathway and its interaction with other signalling pathways in the developing heart transiently submitted to anoxia. Furthermore, the response of the embryonic heart to an exogenous oxidant stress (H2O2) in comparison to reoxygenation-induced endogenous oxyradicals has been investigated.Methods: Hearts isolated from 4-day-old chick embryos were submitted to anoxia (30min) and reoxygenation (80min) with or without the antioxidant MPG, the JAK2/STAT3 inhibitor AG490 or exposed to H202 (50|iM-lmM). The time course of phosphorylation of STAT3atyr0Sine7 and Reperfusion Injury Salvage Kinase (RISK) proteins (PI3K, Akt, GSK3B, Glycogen Synthase and ERK2) was determined in homogenate" and in enriched nuclear and cytoplasmic fractions. The STAT3 DNA-binding was determined by EMSA and the expression of STAT3 specific target genes by RT-PCR. The chrono-, dromo- and inotropic disturbances were also investigated by ECG and mechanical recordings.Results: Phosphorylation of STATSaP (P-Tyr STAT3a) was increased by reoxygenation and reduced by MPG or AG490. STAT3 and GSK36 were detected both in nuclear and cytoplasmic fractions while PI3K, Akt, GS and ERK2 were restricted to cytoplasm. Reoxygenation led to nuclear accumulation of STAT3 but unexpectedly without DNA- binding. AG490 decreased the reoxygenation-induced phosphorylation of STABa^, Akt, GS and ERK2 and phosphorylation/inhibition of GSK3B in the nucleus, exclusively. Inhibition of JAK2/STAT3 delayed recovery of atrial rate, worsened RR. variability and prolonged arrhythmias compared to control hearts. Cardiac activity was altered only at concentrations >500μΜ of H2O2. Moreover, ImM of H2O2 suppressed atrial activity in 45% of the hearts, atrioventricular conduction in 66% and augmented P-Tyr STAT3awhich led to an increase in the DNA-binding but no change in the expression of three STAT3 specific target genes (iNOS, MnSOD, Cox-2).Conclusion: In the developing heart, besides its nuclear translocation without transcriptional activity, ROS-activated STAT3a can rapidly interact with RISK proteins present in nucleus and cytoplasm and reduce the anoxia-reoxygenation-induced arrhythmias. Moreover, the embryonic heart is highly resistant to H2O2 and the atrial region is the less affected. The role of JAK2/STAT3 in the response to reoxygenation-induced oxyradicals is different from the response to strong exogenous oxidant stress where STAT3 DNA-binding activity is increased. Such findings provide a first step in understanding the modulation of signalling cascades in the fetal heart submitted to transient intrauterine oxygen deprivation.RESUMEIntroduction: Le coeur embryonnaire et foetal est très sensible au manque d'oxygène et une hypoperfusion utéroplacentaire transitoire peut conduire à une surproduction d'espèces radicalaires (ROS). Dans le coeur en développement les mécanismes moléculaires impliqués en situation d'ischémie-reperfusion (I-R) ne sont pas connus. La voie de signalisation JAK2/STAT3 (Janus Kinase 2 / Signal Transducer and Activator of Transcription 3), impliquée aussi bien dans la cardiogenèse précoce que dans la protection du coeur adulte contre l'I-R, pourrait jouer un rôle clé dans la réponse du myocarde foetal à un déficit en oxygène. Cette étude a permis d'étudier le rôle de la voie JAK2/STAT3 et son interaction avec d'autres voies de signalisation dans un modèle de coeur embryonnaire soumis à un épisode anoxique. En outre, les effets du stress oxydant endogène provoqué par la réoxygénation ont été comparés à ceux du stress oxydatif exogène induit par du peroxyde d'hydrogène (H2O2).Méthodes: Des coeurs isolés d'embryons de poulet âgés de 4 jours ont été soumis à une anoxie (30min) suivie d'une réoxygénation (80min) en présence ou non de l'antioxydant MPG et de l'inhibiteur de JAK2/STAT3 AG490 ou exposés à de 1Ή202 (50μΜ-1πιΜ). L'évolution temporelle de la phosphorylation de 8ΤΑΤ3α*ΓΟδίη6705 (P-Tyr STAT3a) et celle de la phosphorylation des protéines de la voie RISK (Reperfusion Injury Salvage Kinase: PI3K, Akt, GSK3B, glycogène synthase GS et ERK2) ont été déterminés dans l'homogénat et dans les fractions nucléaire et cytopiasmique du myocarde. La liaison de STAT3 à l'ADN a été déterminée par EMSA et l'expression de gènes cibles de STAT3 (iNOS, MnSOD, Cox2) par RT-PCR. Les effets chrono-, dromo- et inotropes ont été déterminés par les enregistrements de l'ECG et de l'activité contractile ventriculaire.Résultats: STAT3 et GSK3B étaient présents dans les fractions nucléaire et cytopiasmique tandis que PI3K, Akt, GS et ERK2 n'étaient détectées que dans la fraction cytopiasmique. L'augmentation de P-Tyr STAT3a provoquée par la réoxygénation était significativement réduite par le MPG ou PAG490. La réoxygénation entraînait l'accumulation nucléaire de STAT3, mais étonnamment sans liaison avec l'ADN. A la réoxygénation TAG490 diminuait la phosphorylation d'Akt, GS et ERK2 ainsi que celle de GSK36 mais exclusivement dans la fraction nucléaire. L'inhibition de JAK2/STAT3 retardait également la récupération du rythme cardiaque et prolongeait la durée des arythmies. L'activité cardiaque n'était perturbée par de ΓΗ2Ο2 qu'à des concentrations >500μΜ. A ImM, ΓΗ2Ο2 supprimait l'activité auriculaire dans 45% des coeurs et la conduction auriculo-ventriculaire dans 66% et augmentait la formation de P-Tyr STAT3a et sa liaison à l'ADN sans modifier l'expression des gènes cibles.Conclusion: Les ROS produits par l'anoxie-réoxygénation activent STAT3a qui subit une translocation dans le noyau sans se lier à l'ADN et interagit rapidement avec des protéines de la voie RISK dans les compartiments nucléaire et cytopiasmique du coeur embryonnaire. Ce dernier, en particulier au niveau des oreillettes, se révèle très résistant au puissant stress oxydatif de l'H202 qui se différencie du stress lié à la réoxygénation en favorisant la liaison de STAT3 à l'ADN. Ces résultats originaux permettent une meilleure compréhension des mécanismes qui peuvent améliorer la récupération du coeur en développement après un épisode hypoxique intra-utérin.

The DNA damage response to adeno-associated virus : centrosome overduplication and induction of cell death independently of the spindle checkpoint

Summary: Adeno-associated virus type 2 (AAV2) is a small virus containing single-stranded DNA of approximately 4.7kb in size. Both ends of the viral genome are flanked with inverted terminal repeat sequences (ITRs), which serve as primers for viral replication. Previous work in our laboratory has shown that AAV2 DNA with ultraviolet radiation-generated crosslinks (UV-AAV2) provokes a DNA damage response in the host cell by mimicking a stalled replication fork. Infection of cells with UV-AAV2 leads to a p53-and Chk1-mediated cell cycle arrest at the G2/M border of the cell cycle. However, tumour cells lacking the tumour suppressor protein p53 cannot sustain this arrest and enter a prolonged impaired mitosis, the outcome of which is cell death. The aim of my thesis was to investigate how UV-inactivated AAV2 kilts p53-deficient cancer cells. I found that the UV-AAV2-induced DNA damage signalling induces centriole overduplication in infected cells. The virus is able to uncouple the centriole duplication cycle from the cell cycle, leading to amplified centrosome numbers. Chk1 colocalises with centrosomes in the infected cells and the centrosome overduplication is dependent on the presence of Chk1, as well as on the activities of ATR and Cdk kinases and on the G2 arrest. The UV-AAV2-induced DNA damage signalling inhibits the degradation of cyclin B 1 and securin by the anaphase promoting complex, suggesting that the spindle checkpoint is activated in these mitotic cells. Interference with the spindle checkpoint components Mad2 and BubR1 revealed that the UV-AAV2-provoked mitotic catastrophe occurs independently of spindle checkpoint function, This work shows that, in the p53 deficient cells, UV-AAV2 triggers mitotic catastrophe associated with a dramatic Chk1-dependent overduplication of centrioles and the consequent formation of multiple spindle poles in mitosis. Résumé Le virus associé à l'adénovirus type 2 (AAV2) est un petit virus contenant un simple brin d'ADN d'environ 4.7kb. Des expériences antérieures dans notre laboratoire ont montré que les liens intramoléculaires sur l'ADN de AAV2 provoqués paz l'irradiation aux ultraviolets (UV) ressemblent à une fourche de réplication bloquée, ce qui provoque une réponse aux dommages à l'ADN dans la cellule hôte. L'infection des cellules avec UV-AAV2 résulte en un arrêt du cycle cellulaire à la transition G2/M entraîné par les protéines ATR et Chk1. Cependant, les cellules tumorales auxquelles il manque le suppresseur de tumeur p53 ne peuvent pas tenir cet arrêt et entrent dans une mitose anormale et prolongée qui se terminera par la mort cellulaire. Le but de ma thèse était d'étudier comment l'AAV2 inactivé par l'irradiation UV tue les cellules cancéreuses n'ayant pas p53. Je montre ici que le signal de dommages à l'ADN induit par UV-AAV2 génère une surduplication des centrioles dans les cellules infectées. Le virus est capable de dissocier le cycle de duplication du centriole du cycle cellulaire ce qui crée un nombre amplifié de centrosomes. Chk1 est co-localisé avec le centrosome dans les cellules infectées et la swduplication du centrosome est dépendante de la présence de Chk1, de l'activité des kinases ATR et Cdk et de l'arrêt en G2 de la cellule. Le signal d'ADN endommagé induit par UV-AAV2 réprime la dégradation des protéines cycline B1 et securine par le complexe promoteur de l'anaphase (APC), ce qui suggère que le point de contrôle du fuseau mitotique est activé dans ces cellules en mitose. L'étude d'interférence avec des éléments du point de contrôle du fuseau mitotique, Mad2 et BubR1, a révélé que la catastrophe mitotique provoquée paz UV-AAV2 survient indépendamment du point de contrôle du fuseau mitotique. Ce travail montre que dans les cellules déficientes en p53, UV-AAV2 induit une catastrophe mitotique associée à une surduplication des centrioles dépendant de Chk1 et ayant pour conséquence dramatique la formation de multiples fuseaux mitotiques dans la cellule en mitose.

De novo T cell generation and cell cycle analysis of CD4 and CD8 T cells during HIV-disease

RESUME POUR UN LARGE PUBLIC Parmi les globules blancs, les lymphocytes T 004 jouent un rôle primordial dans la coordination de la réponse immunitaire contre les pathogènes et les lymphocytes T CD8 dans leur élimination. Lors d'une infection par le virus de l'immunodéficience humaine (VIH-1), non seulement les cellules T CD4 sont les principales cibles d'infections, mais aussi elles disparaissent progressivement tout au long de la maladie. Ce phénomène, appelé aussi épuisement des lymphocytes T CD4, est la principale cause provoquant le Syndrome d'Immunodéficience Acquise (SIDA). Malgré de grands efforts de recherche, nous ne sommes toujours pas en mesure de dire si ce phénomène est dû à un défaut dans la production de nouvelles cellules ou à une destruction massive de cellules en circulation. Dans cette étude, nous nous proposions, dans un premier temps, de comparer la production de nouvelles cellules T CD4 et CD8 chez des individus VIH-négatifs et positifs. Les cellules nouvellement produites portent un marqueur commun que l'on appelle TREC et qui est facilement mesurable. En considérant des paramètres cliniques, nous étions en mesure de déterminer le niveau de TRECs de cellules T CD4 et CD8 dans différentes phases de la maladie. De là, nous avons pu déterminer que le niveau de TREC est toujours plus bas dans les cellules T CD8 de patients VIH-positifs comparativement à notre groupe contrôle. Nous avons pu déterminer par une analyse ultérieure que cette différence est due à une forte prolifération de ces cellules chez les patients VIH-positifs, ce qui a pour effet de diluer ce marqueur. En revanche, la production de nouvelles cellules T CD4 chez des patients VIH-positifs est accentuée lors de la phase précoce de la maladie et largement réprimée lors de la phase tardive. Dans un second temps, nous avons effectué une analyse à grande échelle de l'expression de gènes associés à la division cellulaire sur des lymphocytes T CD4 et CD8 d'individus VIH-¬positifs et négatifs, avec comme contrôle des cellules proliférant in vitro. De cette étude, nous avons pu conclure que les cellules T CD8 de patients VIH-positifs étaient en état de prolifération, alors que les lymphocytes T CD4 présentaient des défauts majeurs conduisant à un arrêt de la division cellulaire. Nos résultats montrent que la capacité à produire de nouvelles cellules chez des patients VIH¬positifs reste active longtemps pendant la maladie, mais que l'incapacité des cellules T CD4 à proliférer peut enrayer la reconstitution immunitaire chez ces individus. ABSTRACT The hallmark of HIV-1 infection is the depletion of CD4 T cells. Despite extensive investigation, the mechanisms responsible for the loss of CD4 T cells have been elucidated only partially. In particular, it remains controversial whether CD4 T cell depletion results from a defect in T cell production or from a massive peripheral destruction. In this study, de novo T cell generation has been investigated by measuring T cell receptor rearrangement excision circles (TRECs) on large cohorts of HIV-negative (N=120) and HIV-1 infected (N=298) individuals. Analysis of TREC levels was performed in HIV-infected subjects stratified by the stage of HIV disease based on CD4 T cell counts (early: >500 CD4 T cells/µl; intermediate: <500>200; late: <200) and by age (20 to 60 years, n = 259). Our data show that TREC levels in CD8 T cells were significantly lower in HIV-infected subjects at any stage of disease compared to the control group. In contrast, TREC levels in CD4 T cells were significantly higher in HIV-infected subjects at early stages disease while no significant differences were observed at intermediate stages of the disease and were severely reduced only at late stages of disease. To investigate further the status of cell cycle in peripheral CD4 and CD8 T cells in HIV-1 infections, we determined the pattern of gene expression with the microarray technology. In particular, CD4 and CD8 T cells of HIV-1 infected and HIV-negative subjects were analysed by Cell Cycle cDNA expression array. The patterns of gene expression were compared to in vitro stimulated CD4 and CD8 T cells and this analysis showed that CD8 T cells of HIV-1 infected subjects had a pattern of gene expression very similar to that of in vitro stimulated CD8 T cells thus indicating ongoing cell cycling. In contrast, CD4 T cells of HIV-1 infected subjects displayed a complex pattern of gene expression. In fact, CD4 T cells expressed high levels of genes typically associated with cell activation, but low levels of cell cycle genes. Therefore, these results indicated that activated CD4 T cells of HIV-1 infected subjects were in cell cycle arrest. Taking together these results indicate that thymus function is preserved for long time during HIV- 1 infection and the increase observed in early stage disease may represent a compensatory mechanism to the depletion of CD4 T cells. However, we provide evidence for a cell cycle arrest of peripheral CD4 T cells that may prevent potentially the replenishment of CD4 T cells. RESUME Les mécanismes responsables de la perte des lymphocytes T CD4 lors de l'infection pas VIH n'ont été élucidés que partiellement. Nous ne savons toujours pas si l'épuisement des lymphocytes T CD4 résulte d'un défaut dans la production de cellules ou d'une destruction périphérique massive. Dans cette étude, la production de cellules T a été étudiée en mesurant les cercles d'excision générés lors du réarrangement du récepteur au cellules T (TRECs) chez des individus VIH-négatifs (N=120) et VIH-1 positifs (N=298). L'analyse des niveaux de TREC a été faite chez sujets HIV-infectés en considérant les phases de la maladie sur la base des comptes CD4 (phase précoce: > 500 cellules CD4/µl; intermédiaire: < 500>200; tardive: < 200) et par âge. Nos données démontrent que les niveaux de TRECs des cellules T CD8 étaient significativement plus bas chez les sujets VIH-1 infectés, à tous les stades de la maladie comparativement au groupe contrôle. En revanche, les niveaux de TRECs des cellules T CD4 étaient significativement plus élevés chez les sujets VIH-1 infectés durant la phase précoce de la maladie, tandis qu'aucune différence significative n'était observée durant la phase intermédiaire et étaient très réduits dans la phase tardive. Dans une deuxième partie, nous avons utilisé la technique des biopuces à d'ADN complémentaire pour analyser la régulation du cycle cellulaire chez les lymphocytes T CD4 et CD8 périphériques lors d'une infection au VIH-1. Des profils d'expression ont été déterminés et comparés à ceux de cellules T CD4 et CD8 stimulées in vitro, démontrant que les cellules T CD8 des sujets VIH-positifs avaient un profil d'expression très semblable à celui des cellules stimulées in vitro en prolifération. En revanche, les lymphocytes T CD4 des sujets VIH-1 positifs avaient un profil d'expression de gène plus complexe. En fait, leur profil montrait une sur- expression de gènes associés à une activation cellulaire, mais une sous-expression de ceux induisant une division. Ainsi, ces résultats indiquent que les lymphocytes T CD4 d'individus VIH-positifs présentent des dérégulations qui conduisent à un arrêt du cycle cellulaire. Ces résultats montrent que la fonction thymique est préservée longtemps pendant l'infection au VIH-1 et que l'augmentation de la quantité de TRECs dans la phase précoce de la maladie peut représenter un mécanisme compensatoire à l'épuisement des cellules T CD4. Cependant, nous démontrons aussi un clair dysfonctionnement du cycle cellulaire chez les cellules T CD4 d'individus infectés par VIH-1 ce qui peut enrayer la reconstitution du système immunitaire.

Clic4, a novel protein that sensitizes ß-cells to apoptosis.

Introduction: La préservation et/ou l'expansion de la masse des cellules ß pourraient constituer des approches prometteuses dans le traitement du diabète. L'une des stratégies clés serait de réduire l'apoptose des cellules ß. Le chloride intracellular channel protein 4 (Clic4) est une protéine exprimée de manière ubiquitaire et supposée agir dans de nombreux processus cellulaires tels que le contrôle du cycle cellulaire, la différenciation cellulaire et l'apoptose. Ici, nous avons étudié le rôle de Clic4 dans l'apoptose des cellules ß pancréatiques en utilisant des cellules ßTC-tet et des îlots de Langerhans issus de souris knockout pour Clic4 (ßClic4KO). Résultats: L'expression de l'ARNm et de la protéine Clic4 était augmentée par un traitement aux cytokines dans les cellules ßTC-tet et encore plus fortement dans des îlots isolés de souris. De plus, la sous-expression de Clic4 dans les cellules ßTC-tet diminuait leur sensibilité à l'apoptose induite par les cytokines. La sous-expression de Clic4 dans les cellules ßTC-tet n'affectait pas l'expression des ARNm de Bcl-2 et Bad, mais augmentait leur expression protéique ainsi que la forme phosphorylée de Bad. Les mêmes résultats ont été obtenus sur des îlots isolés de souris contrôles et ßClic4KO. De plus, les îlots issus de souris ßClic4KO présentaient une augmentation de l'expression de la protéine Bcl-xL. Dans le but de déterminer si Clic4 augmentait l'expression de Bcl-2 et Bad via une interaction protéique directe, nous avons immunoprécipité Clic4 à partir de cellules ßTC-tet à l'aide d'anticorps dirigés contre la partie C- ou N-terminale de la protéine, puis nous avons soumis les immunoprécipités à une analyse de spectrométrie de masse. Aucune co- immunoprécipitation avec Bcl-2 ou d'autres protéines de la famille Bcl-2 n'a été détectée. Cependant, de manière intéressante, Clic4 était co-purifié avec plusieurs protéines du protéasome suggérant un rôle de Clic4 dans la dégradation des protéines. Par conséquent, nous avons étudié la demi-vie de Bcl-2 et Bad, et avons observé que la sous-expression de Clic4 dans les cellules ßTC-tet augmentait la demi-vie de ces protéines. De plus, l'expression de l'ARNm et de la protéine Clic4 était également augmentée lors d'un stress du réticulum endoplasmique induit par la thapsigargine dans les cellules ßTC-tet. La sous-expression de Clic4 dans les cellules ßTC-tet ou chez les KO diminuait la sensibilité des cellules ß à l'apoptose induite par la thapsigargine ou l'acide palmitique, respectivement. Conclusion: Ces résultats suggèrent que Clic4 sensibilise les cellules ß à l'apoptose induite par les cytokines ou l'acide palmitique/thapsigargine (stress du réticulum endoplasmique). De plus, la sous-expression de Clic4 améliore la survie des cellules ß en diminuant la dégradation de Bcl-2 et Bcl-xL, et en augmentant le niveau total de Bad phosphorylé, peut-être suite à une interaction de Clic4 avec le protéasome.

On the transcriptional role of NLRC5 and the function of NLRC5-driven MHC class I expression in the immune system

Major histocompatibility complex (MHC) molecules are of crucial importance for the immune system to recognize and defend the body against external attacks. Foreign antigens are presented by specialized cells, called antigen presenting cells, to T lymphocytes in the context of MHC molecules, thereby inducing T cell activation. In addition, MHC molecules are essential for Natural Killer (NK) cell biology, playing a role in NK cell education and activation. Recently, the NOD-like receptor (NLR) family member NLRC5 (NLR caspase recruitment domain containing protein 5) was found to act as transcriptional regulator of MHC class I, in particular in T and NK cells. Its role in MHC class I expression is however minor in dendritic cells (DCs). This raised the question of whether inflammatory conditions, which augment the levels of NLRC5 in DCs, could increase its contribution to MHC class I expression. Our work shows that MHC class I transcript and intracellular levels depend on NLRC5, while its role in MHC class I surface expression is instead negligible. We describe however a general salvage mechanism that enables cells with low intracellular MHC class I levels to nevertheless maintain relatively high MHC class I on the cell surface. In addition, we lack a thorough understanding of NLRC5 target gene specificity and mechanism of action. Our work delineates the unique consensus sequence in MHC class I promoters required for NLRC5 recruitment and pinpoints conserved features conferring its specificity. Furthermore, through genome-wide analyses, we confirm that NLRC5 regulates classical MHC class I genes and identify novel target genes all encoding non-classical MHC class I molecules exerting an array of functions in immunity and tolerance. We finally asked why a dedicated factor co-regulates MHC class I expression specifically in T and NK lymphocytes. We show that deregulated NLRC5 expression affects the education of NK cells and alters the crosstalk between T and NK cells, leading to NK cell-mediated killing of T lymphocytes. Altogether this thesis work brings insights into molecular and physiological aspects of NLRC5 function, which might help understand certain aspects of immune responses and disorders. -- Les molécules du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) sont essentielles au système immunitaire pour l'initiation de la réponse immunitaire. En effet, l'activation des lymphocytes T nécessite la reconnaissance d'un antigène étranger présenté par les cellules présentatrices d'antigènes sur une molécule du CMH. Les molécules du CMH ont également un rôle fondamental pour la fonction des cellules Natural Killer (NK) puisqu'elles sont nécessaires à leur processus d'éducation et d'activation. Récemment, NLRC5 (NLR caspase recruitment domain containing protein 5), un membre de la famille des récepteurs de type NOD (NLRs), a été décrit comme un facteur de transactivation de l'expression des gènes du CMH de classe I. A l'état basai, cette fonction transcriptionnelle est essentielle dans les lymphocytes T et NK, alors que ce rôle reste mineur pour l'expression des molécules du CMH de classe I dans les cellules dendritiques (DCs). Dans des conditions inflammatoires, l'expression de NLRC5 augmente dans les DCs. Notre travail démontre que, dans ces conditions, les transcrits et les niveaux intracellulaires des molécules du CMH de classe I augmentent aussi d'une façon dépendante de NLRC5. A contrario, le rôle de NLRC5 sur les niveaux de molécules de surface reste minoritaire. Cette observation nous a conduits à l'identification d'un mécanisme général de compensation qui permet aux cellules de maintenir des niveaux relativement élevés de molécules de CMH de class I à leur surface malgré de faibles niveaux intracellulaires. De plus, il semblait nécessaire de s'orienter vers une approche plus globale afin de déterminer l'étendue de la fonction transcriptionnelle de NLRC5. Par une approche du génome entier, nous avons pu décrire une séquence consensus conservée présente dans les promoteurs des gènes du CMH de classe I, sur laquelle NLRC5 est spécifiquement recruté. Nous avons pu également identifier de nouveaux gènes cibles codant pour des molécules de CMH de classe I non classiques impliqués dans l'immunité et la tolérance. Finalement, nous nous sommes demandé quel est l'intérêt d'avoir un facteur transcriptionnel, en l'occurrence NLRC5, qui orchestre l'expression du CMH de classe I dans les lymphocytes T et NK. Nous montrons que la dérégulation de l'expression de NLRC5 affecte l'éducation des cellules NK et conduit à la mort cellulaire des lymphocytes T médiée par les cellules NK. Dans l'ensemble ce travail de thèse contribue à la caractérisation du rôle de NLRC5, tant au niveau moléculaire que physiologique, ce qui présente un intérêt dans le cadre de la compréhension de certains aspects physiopathologique de la réponse immunitaire.

Control of gene expression in melanocytes and RPE by conserved distal regulatory elements

Résumé Durant le développement embryonnaire, les cellules pigmentaires des mammifères se développent à partir de deux origines différentes : les melanocytes se développent à partir de la crête neurale alors que les cellules de la rétine pigmentaire (RP) ont une origine neuronale. Un grand nombre de gènes sont impliqués dans la pigmentation dont les gènes de la famille tyrosinase à savoir Tyr, Tyrp1 et Dct. Certaines études ont suggéré que les gènes de la pigmentation sont régulés de manière différentielle dans les mélanocytes et dans la RP. Dans ce travail, les gènes de la famille tyrosinase ont été étudiés comme modèle de la régulation des gènes de la pigmentation par des éléments régulateurs agissant à distance. II a été montré que le promoteur du gène Tyrp1pouvait induire l'expression d'un transgène uniquement dans la RP alors que ce gène est aussi exprimé dans les mélanocytes comme le montre le phénotype des souris mutantes pour Tyrp1. Ce résultat suggère que les éléments régulateurs du promoteur sont suffisants pour l'expression dans la RP mais pas pour l'expression dans les mélanocytes. J'ai donc cherché à identifier la séquence qui régule l'expression dans les mélanocytes. Un chromosome artificiel bactérien (CAB) contenant le gène Tyrp1 s'est avéré suffisant pour induire l'expression dans les mélanocytes, comme démontré par la correction du phénotype mutant. La séquence de ce CAB contient plusieurs régions très conservées qui pourraient représenter de nouveaux éléments régulateurs. Par la suite, j'ai focalisé mon analyse sur une séquence située à -I5 kb qui s'est révélée être un amplificateur spécifique aux mélanocytes comme démontré par des expériences de cultures cellulaire et de transgenèse. De plus, une analyse poussée de cet élément a révélé que le facteur de transcription Sox 10 représentait un transactivateur de cet amplificateur. Comme pour Tyrp1, la régulation du gène tyrosinase est contrôlée par différents éléments régulateurs dans les mélanocytes et la RP. Il a été montré que le promoteur de tyrosinase n'était pas suffisant pour une forte expression dans les mélanocytes et la RP. De plus, l'analyse de la région située en amont a révélé la présence d'un amplificateur nécessaire à l'expression dans les mélanocytes à la position -15 kb. Cet amplificateur n'est toutefois pas actif dans la RP mais agit comme un répresseur dans ces cellules. Ces résultats indiquent que certains éléments nécessaires à l'expression dans les deux types de cellules pigmentaires sont absents de ces constructions. Comme pour Tyrp1, j'ai en premier lieu démontré qu'un CAB était capable de corriger le phénotype albinique, puis ai inséré un gène reporter (lacZ) dans le CAB par recombinaison homologue et ai finalement analysé l'expression du reporter en transgenèse. Ces souris ont montré une expression forte du lacZ dans les mélanocytes et la RP, ce qui indique que le CAB contient les séquences régulatrices nécessaires à l'expression correcte de tyrosinase. Afin de localiser plus précisément les éléments régulateurs, j'ai ensuite généré des délétions dans le CAB et analysé l'expression du lacZ en transgenèse. La comparaison de séquences génomiques provenant de différentes espèces a permis par la suite d'identifier des régions représentant de nouveaux éléments régulateurs potentiels. En utilisant cette approche, j'ai identifié une région qui se comporte comme un amplificateur dans la RP et qui est nécessaire à l'expression de tyrosinase dans ce tissu. De plus, j'ai identifié les facteurs de transcription Mitf et Sox10 comme transactivateurs de l'amplificateur spécifique aux mélanocytes situé à -15 kb. L'identification et la caractérisation des ces éléments régulateurs des gènes tyrosinase et Tyrp1confirme donc que la régulation différentielle des gènes dans les mélanocytes et la RP est liée à des éléments régulateurs séparés. Summary Pigment cells of mammals originate from two different lineages: melanocytes arise from the neural crest, whereas cells of the retinal pigment epithelium (RPE) originate from the optic cup of the developing forebrain. A large set of genes are involved in pigmentation, including the members of the tyrosinase gene family, namely tyrosinase, Tyrp1 and Dct. Previous studies have suggested that pigmentation genes are differentially regulated in melanocytes and RPE. In this work, the tyrosinase gene family was used as a model for studying the involvement of distal regulatory elements in pigment cell-specific gene expression. The promoter of the Tyrp1 gene has been shown to drive detectable transgene expression only to the RPE, even though the gene is also expressed in melanocytes as evident from Tyrp1-mutant mice. This indicates that the regulatory elements responsible for Tyrp1 gene expression in the RPE are not sufficient for expression in melanocytes. I thus searched for a putative melanocyte-specific regulatory sequence and demonstrate that a bacterial artificial chromosome (BAC) containing the Tyrp1 gene and surrounding sequences is able to target transgenic expression to melanocytes and to rescue the Tyrp1 b (brown) phenotype. This BAC contains several highly conserved non-coding sequences that might represent novel regulatory elements. I further focused on a sequence located at -15 kb which I identified as amelanocyte-specific enhancer as shown by cell culture and transgenic mice. In addition, further functional analysis identified the transcription factor Sox10 as being able to bind and transactivate this enhancer. As for Tyrp1, tyrosinase gene regulation is mediated by different cis-regulatory elements in melanocytes and RPE. It was shown that the tyrosinase promoter was not sufficient to confer strong and specific expression in melanocytes and RPE. Moreover, analysis of tyrosinase upstream sequence, revealed the presence of a specific enhancer at position -15 kb which was necessary to confer strong expression in melanocytes. This enhancer element however failed to act as an enhancer in the RPE, but rather repressed expression. This indicates that some regulatory elements required for tyrosinase expression in both RPE and melanocytes are still missing from these constructs. As for Tyrp1, I first demonstrated that a BAC containing the Tyr gene is able to rescue the Tyr c (albino) phenotype in mice, then I inserted a lacZ reporter gene in the BAC by homologous recombination, and finally analysed the pattern of lacZ expression in transgenic mice. These mice showed strong lacZ expression in both RPE and melanocytes, indicating that the BAC contains the regulatory sequences required for proper tyrosinase expression. In order to localize more precisely these regulatory elements, I have then generated several deletions in the BAC and analysed lacZ expression in transgenic mice. Multi-species comparative genomic analysis then allowed identifying conserved sequences that potentially represent novel regulatory elements. Using this experimental approach, I identified a region that behaves as a RPE-specific enhancer and that is required for tyrosinase expression in the retina] pigment epithelium. In addition, I identified the transcription factors Mitf and Sox l0 as being transactivators of the melanocyte-specific enhancer located at -l5 kb. The identification and characterization of these tyrosinase and Tyrp1 distal regulatory element supports the idea that separate regulatory sequences mediate differential gene expression in melanocytes and RPE.

Role of amphiregulin in mammary gland development

Abstract Ovarian hormones are key regulators of postnatal mammary gland development and are linked to breast carcinogenesis. In particular, estrogens induce mammary epithelial cells to proliferate at the onset of puberty, leading to the elongation of the rudimental ductal tree into the fatty stromal tissue. Elucidating the molecular events underlying estrogen mitogenic activity in the mammary gland is of value in understanding how the deregulation of this signalling pathway can lead to breast tumorigenesis. Our lab has recently shown that estrogen induces mammary proliferation via epithelial estrogen receptor alpha (ERα) by a paracrine mechanism. Based on the finding that several EGF receptor (EGFR) ligands are able to substitute for estrogens and that amphiregulin (Areg), one of these ligands, is required during mammary development, we have hypothesized that Areg is a key mediator of estrogen induced paracrine signalling during ductal morphogenesis. Our analysis of the Areg -/- mice mammary phenotype reveals that epithelial Areg is required at the onset of puberty for epithelial proliferation, terminal end bud (TEB) formation and, subsequently, ductal elongation. Hormonal stimulation experiments show that among the EGFR ligands, only Arég is specifically controlled by estrogen at the transcriptional level, via ERα, in the mammary gland. Moreover, Areg is required for the estrogen-induced mammotrophic effects of epithelial proliferation and ductal elongation. We have shown that ectopic Areg expression in ERα -/- mammary epithelial cells is sufficient to induce ductal morphogenesis. Our transplantations experiment show that when Areg -/- cells are in the presence of wt cells they contribute to all aspects of ductal development, suggesting that this growth factor acts in a paracrine fashion. Moreover, this result shows that Areg -/- epithelial cells are not intrinsically impaired in proliferation. Our transplantation experiment carried out under physiological conditions confirmed previous reports showing that stromal EGFR is needed for ductal morphogenesis. This suggests that estrogen-driven Areg signalling involves an epithelium-stroma crosstalk. Thus, these data confirmed our hypothesis of Areg being an important estrogen mediator during ductal morphogenesis. Résumé Les hormones ovariennes, régulatrices clés du développement post-natal de la glande mammaire, sont également liées à la carcinogénèse du sein. En particulier, l'oestrogène induit la division des cellules épithéliales au début de la puberté. Cette prolifération amène à l'élongation du réseau canalaire rudimentaire et permet l'invasion du compartiment stromal. L'élucidation des mécanismes moléculaires responsables de l'activité mitogénique de l'oestrogène dans la glande mammaire est précieuse pour une meilleure compréhension du développement du cancer du sein. Notre laboratoire a récemment démontré que l'cestrogène induit la prolifération des cellules épithéliales par un signal paracrine, grâce au récepteur à l'oestrogène alpha (ERα). En se basant sur le fait que plusieurs ligands du récepteur à l'EGF (EGFR) sont capables de se substituer à l'cestrogène et d'induire la prolifération épithéliale et qu'amphiregulin (Areg), un de ces ligands, est essentielle au développement de la glande mammaire, nous avons émi l'hypothèse que Areg est un médiateur essentiel du signal paracrine induit par l'oestrogène pendant la croissance du système canalaire. Nos analyses phénotypiques des glandes mammaires issues de souris transgéniques Areg -/- démontrent que cette protéine est indispensable à la prolifération des cellules épithéliales mammaires au début de la puberté et à la formation des bourgeons terminaux qui conduisent à l'élongation des canaux. Nos expériences de stimulations hormonales démontrent que, parmi l'ensemble des ligands du EGFR, seule Areg est contrôlée au niveau transcriptionnel par l'cestrogène dans la glande mammaire, ceci via le récepteur ERα. De plus, Areg est essentielle pour le effets mammotrophique induit par l'cestrogène, à savoir la prolifération épithéliál et la croissance du système canalaire. Par ailleurs, l'expression ectopique d'Areg dans des cellules epithéliales mammaires de souris transgéniques ERα -/- est suffisante pour permettre la formation du réseau canalaire. En présence de cellules normales, les cellules dépourvues du gène d'Areg contribuent à la formation des canaux. Cette expérience suggère que ce facteur de croissance agit de manière paracrine. De plus, ce résultat montre que les cellules épithéliales Areg -/- conservent leur potentiel prolifératif. Nos expériences de transplantation, réalisées dans des conditions physiologiques, ont confirmé des précédentes études qui montraient que le récepteur stromal à l'EGF est nécessaire pour la morphogénèse du système canalaire. Ceci suggère que la voie de signalisation activée par l'oestrogène et dépendante d' implique une communication entre l'épithélium et le stroma. Ainsi, ces résultats valident notre hypothèse puisqu'ils confirment Areg en tant que médiateur majeur de l'oestrogène dans la morphogénèse du système canalaire.

Study of the incorporation and the anti-tumour efficacy of radio-iododeoxyuridine according to the cellular cycle and in presence of synthesis inhibitor of thymidine

Résumé La iododeoxyuridine (IdUrd), une fois marqué au 123I ou au 125I, est un agent potentiel pour des thérapies par rayonnements Auger. Cependant, des limitations restreignent son incorporation dans l'ADN. Afin d'augmenter celle-ci, différents groupes ont étudié la fluorodeoxyuridine (FdUrd), qui favorise l'incorporation d'analogue de la thymidine, sans toutefois parvenir à une toxicité associé plus importante. Dans notre approche, 3 lignées cellulaires de glioblastomes humains et une lignée de cancer ovarien ont été utilisées. Nous avons observé, 16 à 24 h après un court pré-traitement à la FdUrd, un fort pourcentage de cellules s'accumulant en phase S. Plus qu'une accumulation, c'était une synchronisation des cellules, celles-ci restant capables d'incorporer la radio-IdIrd et repartant dans le cycle cellulaire. De plus, ces cellules accumulées après un pré-traitement à la FdUrd étaient plus radio-sensibles. Après le même intervalle de 16 à 24 h suivant la FdUrd, les 4 lignées cellulaires ont incorporé des taux plus élevés de radio-IdUrd que sans ce prétraitement. Une corrélation temporelle entre l'accumulation des cellules en phase S et la forte incorporation de radio-IdUrd a ainsi été révélée 16 à 24 h après pré-traitement à la FdUrd. Les expériences de traitement par rayonnements Auger sur les cellules accumulées en phase S ont montré une augmentation significative de l'efficacité thérapeutique de 125I-IdUrd comparé aux cellules non prétraitées à la FdUrd. Une première estimation a permis de déterminer que 100 désintégrations de 125I par cellules étant nécessaires afin d'atteindre l'efficacité thérapeutique. De plus, p53 semble jouer un rôle dans l'induction directe de mort cellulaire après des traitements par rayonnements Auger, comme indiqué par les mesures par FACS d'apoptose et de nécrose 24 et 48 h après le traitement. Concernant les expériences in vivo, nous avons observé une incorporation marquée de la radio-IdUrd dans l'ADN après un pré-traitement à la FdUrd dans un model de carcinomatose ovarienne péritonéale. Une augmentation encore plus importante a été observée après injection intra-tumorale dans des transplants sous-cutanés de glioblastomes sur des souris nues. Ces modèles pourraient être utilisés pour de plus amples études de diffusion de radio-IdUrd et de thérapie par rayonnement Auger. En conclusion, ce travail montre une première application réussie de la FdUrd afin d'accroître l'efficacité de la radio-IdUrd par traitements aux rayonnements Auger. La synchronisation des cellules en phase S combinée avec la forte incorporation de radio-IdUrd dans l'ADN différées après un pré-traitement à la FdUrd ont montré le gain thérapeutique attendu in vitro. De plus, des études in vivo sont tout indiquées après les observations encourageantes d'incorporation de radio-IdUrd dans les models de transplants sous-cutanés de glioblastomes et de tumeurs péritonéales ovariennes. Summary Iododeoxyuridine (IdUrd), labelled with 123I or 125I, could be a potential Auger radiation therapy agent. However, limitations restrict its DNA incorporation in proliferating cells. Therefore, fluorodeoxyuridine (FdUrd), which favours incorporation of thymidine analogues, has been studied by different groups in order to increase radio-IdUrd DNA incorporation, however therapeutic efficacy increase could not be reached. In our approach, 3 human glioblastoma cell lines with different p53 expression and one ovarian cancer line were pre-treated with various FdUrd conditions. We observed a high percentage of cells accumulating in early S phase 16 to 24 h after a short and non-toxic FdUrd pre-treatment. More than an accumulation, this was a synchronization, cells remaining able to incorporate radio-IdUrd and re-entering the cell cycle. Furthermore, the S phase accumulated cells post FdUrd pre-treatment were more radiosensitive. After the same delay of 16 to 24 h post FdUrd pre-treatment, the 4 cell lines were incorporating higher rates of radio-IdUrd compared with untreated cells. A time correlation between S phase accumulation and high radio-IdUrd incorporation was therefore revealed 16 to 24 h post FdUrd pre-treatment. Auger radiation treatment experiments performed on S phase enriched cells showed a significant increase of killing efficacy of 125I-IdUrd compared with cells not pre-treated with FdUrd. A first estimation indicates further that about 100 125I decays were required to reach killing in the targeted cells. Moreover, p53 might play a role on the direct induction of cell death pathways after Auger radiation treatments, as indicated by differential apoptosis and necrosis induction measured by FACS 24 and 48 h after treatment initiation. Concerning in vivo results, we observed a marked DNA incorporation increase of radio-IdUrd after FdUrd pre-treatment in peritoneal carcinomatosis in SCID mice. Even higher incorporation increase was observed after intra-tumoural injection of radio-IdUrd in subcutaneous glioblastoma transplants in nude mice. These tumour models might be further useful for diffusion of radio-IdUrd and Auger radiation therapy studies. In conclusion, these data show a first successful application of thymidine synthesis inhibition able to increase the efficacy of radio-IdUrd Auger radiation treatment. The S phase synchronization combined with a high percentage DNA incorporation of radio-IdUrd delayed post FdUrd pre-treatment provided the expected therapeutic gain in vitro. Further in vivo studies are indicated after the observations of encouraging radio-IdUrd uptake experiments in glioblastoma subcutaneous xenografts and in an ovarian peritoneal carcinomatosis model.

Profiling of signal transduction in human memory T cells

Résumé pour un large public: La vaccination a eu un impact énorme sur la santé mondiale. Mais, quel est le principe d'un vaccin? Il est basé sur la 'mémoire immunologique', qui est une particularité exclusive des systèmes immunitaires des organismes évolués. Suite à une infection par un pathogène, des cellules spécialisées de notre système immunitaire (les lymphocytes) le reconnaissent et initient une réaction immunitaire qui a pour but son élimination. Pendant cette réaction se développent aussi des cellules, appelées cellules lymphocytaires mémoire, qui persistent pour longue durée et qui ont la capacité de stimuler une réaction immunitaire très efficace immédiatement après une seconde exposition à ce même pathogène. Ce sont ces cellules mémoires (lymphocytes B et T) qui sont à la base de la 'mémoire immunologique' et qui sont stimulées lors de la vaccination. Chez l'homme, deux populations distinctes des lymphocytes T mémoires ont été identifiées: les cellules centrales (CM) et effectrices (EM) mémoires. Ces populations sont fonctionnellement hétérogènes et exercent des rôles distincts et essentiels dans l'immunité protectrice. Typiquement, les cellules effectrices mémoires sont capables de tuer immédiatement le pathogène tandis que les cellules centrales mémoires sont responsables d'initier une réponse immunitaire complète. Pourtant, les mécanismes biochimiques qui contrôlent les fonctions de ces cellules ont été jusqu'à présent peu étudiés à cause de la faible fréquence de ces cellules et de la quantité limitée de tissus humains disponibles pour les analyses. La compréhension de ces mécanismes est cruciale pour la réalisation de vaccins efficaces et pour le développement de nouveaux médicaments capables de moduler la réponse immunitaire lymphocytaire. Dans cette thèse, nous avons d'abord développé et amélioré une technologie appelée 'protéine array en phase inverse' qui possède un niveau de sensibilité beaucoup plus élevé par rapport aux technologies classiquement utilisées dans l'étude des protéines. Grâce à cette technique, nous avons pu comparer la composition protéique du système de transmission des signaux d'activation des cellules CM et EM humaines. L'analyse de 8 à 13 sujets sains a montré que ces populations des cellules mémoires possèdent un système de signalisation protéique différent. En effet, les cellules EM possèdent, par rapport aux cellules CM, des niveaux réduits d'une protéine régulatrice (appelée c-Cbl) que nous avons démontré comme étant responsable des fonctions spécifiques de ces cellules. En effet, en augmentant artificiellement l'expression de cette protéine régulatrice dans les cellules EM jusqu'au niveau de celui des cellules CM, nous avons induit dans les cellules EM des capacités fonctionnelles caractéristiques des cellules CM. En conclusion, notre étude a identifié, pour la première fois chez l'homme, un mécanisme biochimique qui contrôle les fonctions des populations des cellules mémoires. Résumé en Français: Les cellules mémoires persistent inertes dans l'organisme et produisent des réactions immunitaires rapides et robustes contre les pathogènes précédemment rencontrés. Deux populations distinctes des cellules mémoires ont été identifiées chez l'homme: les cellules centrales (CM) et effectrices (EM) mémoires. Ces populations sont fonctionnellement hétérogènes et exercent des rôles distincts et critiques dans l'immunité protectrice. Les mécanismes biochimiques qui contrôlent leurs fonctions ont été jusqu'à présent peu étudiés, bien que leur compréhension soit cruciale pour le développement des vaccins et des nouveaux traitements/médicaments. Les limites majeures à ces études sont la faible fréquence de ces populations et la quantité limitée de tissus humains disponibles. Dans cette thèse nous avons d'abord développé et amélioré la technologie de 'protéine array en phase inverse' afin d'analyser les molécules de signalisation des cellules mémoires CD4 et CD8 humaines isolées ex vivo. L'excellente sensibilité, la reproductibilité et la linéarité de la détection, ont permis de quantifier des variations d'expression protéiques supérieures à 20% dans un lysat équivalent à 20 cellules. Ensuite, grâce à l'analyse de 8 à 13 sujets sains, nous avons prouvé que les cellules mémoires CD8 ont une composition homogène de leur système de signalisation tandis que les cellules CD4 EM expriment significativement de plus grandes quantités de SLP-76 et des niveaux réduits de c-Cbl, Syk, Fyn et LAT par rapport aux cellules CM. En outre, l'expression réduite du régulateur négatif c-Cbl est corrélée avec l'expression des SLP-76, PI3K et LAT uniquement dans les cellules EM. L'évaluation des propriétés fonctionnelles des cellules mémoires a permis de démontrer que l'expression réduite du c-Cbl dans les cellules EM est associé à une diminution de leur seuil d'activation. En effet, grâce a la technique de transduction cytosolique, nous avons augmenté la quantité de c-Cbl des cellules EM à un niveau comparable à celui des cellules CM et constaté une réduction de la capacité des cellules EM à proliférer et sécréter des cytokines. Ce mécanisme de régulation dépend principalement de l'activité d'ubiquitine ligase de c-Cbl comme démontré par l'impact réduit du mutant enzymatiquement déficient de c-Cbl sur les fonctions de cellules EM. En conclusion, cette thèse identifie c-Cbl comme un régulateur critique des réponses fonctionnelles des populations de cellules T mémoires et fournit, pour la première fois chez l'homme, un mécanisme contrôlant l'hétérogénéité fonctionnelle des ces cellules. De plus, elle valide l'utilisation combinée des 'RPP arrays' et de la transduction cytosolique comme outil puissant d'analyse quantitative et fonctionnel des protéines de signalisation. Summary : Memory cells persist in a quiescent state in the body and mediate rapid and vigorous immune responses toward pathogens previously encountered. Two subsets of memory cells, namely central (CM) and effector (EM) memory cells, have been identified in humans. These subsets display high functional heterogeneity and assert critical and distinct roles in the control of protective immunity. The biochemical mechanisms controlling their functional properties remain so far poorly investigated, although their clarification is crucial for design of effective T-cell vaccine and drug development. Major limitations to these studies lie in the low frequency of memory T cell subsets and the limited amount of human specimen available. In this thesis we first implemented the innovative reverse phase protein array approach to profile 15 signalling components in human CD8 and CD4 memory T cells isolated ex vivo. The high degree of sensitivity, reproducibility and linearity achieved, allowed an excellent quantification of variations in protein expression higher than 20% in as few as 20-cell equivalent per spot. Based on the analysis of 8 to 13 healthy subjects, we showed that CD8 memory cells have a homogeneous composition of their signaling machinery while CD4 EM cells express statistically significant increased amounts of SLP-76 and reduced levels of c- Cbl, Syk, Fyn and LAT as compared to CM cells. Moreover, in EM but not CM cells, reduced expression of negative regulator c-Cbl correlated with the expression of SLP-76, PI3K and LAT. Subsequently, we demonstrated that the higher functional properties and the lower functional threshold of EM cells is associated with reduced expression of c-Cbl. Indeed, by increasing c-Cbl content of EM cells to the same level of CM cells using cytosolic transduction, we impaired their proliferation and cytokine production. This regulatory mechanism was primarily dependent on c-Cbl E3 ubiquitin ligase activity as evidenced by the weaker impact of enzymatically deficient c-Cbl C381A mutant on EM cell functions. Together, these results identify c-Cbl as a critical regulator of the functional responses of memory T cell subsets and provides, for the first time in humans, a mechanism controlling the functional heterogeneity of memory CD4 cells. Moreover it validates the combined use of RPP arrays and cytosolic transduction approaches as a powerful tool to quantitatively analyze signalling proteins and functionally assess their roles.

Replicating adenoviruses targeting tumours with constitutive activation of the Wnt signalling pathway

Abstract Activation of the Wnt pathway through mutation of the adenomatous polyposis coli and 13-catenin genes is a hallmark of colon cancer. These mutations lead to constitutive activation of transcription from promoters containing binding sites for Tcf/LEF transcription factors. Tumour-selective replicating oncolytic viruses are promising agents for cancer therapy. They can in principle spread throughout a tumour mass until all the cancerous cells are killed, and clinical trials have shown that they are safe except at very high doses. Adenoviruses are interesting candidates for virotherapy because their biology is well understood and their small genome can be rapidly mutated. Adenoviruses with Tcf binding sites in the E2 early promoter replicate selectively in cells with an active Wnt pathway. Although these viruses can replicate in a broad panel of colon cancer cell lines, some colorectal cancer cells are only semi-permissive for Tcf-virus replication. The aim of my thesis was to increase the safety and the efficacy of Tcf-viruses for colon cancer virotherapy. I replaced the endogenous ElA viral promoter by four Tcf binding sites and showed that transcription from the mutant promoter was specifically activated by the Wnt pathway. A virus with Tcf binding sites in the ElA and E4 promoters was more selective for the Wnt pathway than the former Tcf-E2 viruses. Moreover, insertion of Tcf binding sites into all early promoters further increased viral selectivity, but reduced viral activity. I showed that Tcf-dependent transcription was inhibited by the interaction between ElA and p300, but deletion of the p300-binding site of ElA generally led to viral attenuation. In the semi-permissive cell lines, replication of Tcf-viruses remained lower than that of the wild-type virus. The E2 promoter was the most sensitive to the cell type, but I was unable to improve its activity by targeted mutagenesis. To increase the toxicity of the Tcf-E1A/E4 virus, I decided to express a suicide gene, yeast cytosine deaminase (yCD), late during infection. This enzyme converts the prodrug 5-FC to the cytotoxic agent 5-FU. yCD was expressed in a DNA replication-dependent manner and increased viral toxicity in presence of 5-FC. Tcf-ElA and yCD adenoviruses are potentially useful vectors for the treatment of liver metastases from colorectal tumours. Résumé Dans la quasi-totalité des cancers du côlon, la voie Wnt est activée par des mutations dans les gènes codant pour APC ou pour la (3-caténine. Ces mutations activent de façon constitutive la transcription de promoteurs contenant des sites de liaison pour les facteurs de transcription Tcf/LEF. Les virus réplicatifs spécifiques aux tumeurs sont des agents prometteurs pour la thérapie cancéreuse. En principe, ces vecteurs peuvent se propager dans une masse tumorale jusqu'à destruction de toutes les cellules cancéreuses, et des études cliniques ont démontré que de tels vecteurs n'étaient pas toxiques, sauf à de très hautes doses. Les adénovirus sont des candidats intéressants pour la thérapie virale car leur biologie est bien définie et leur petit génome peut être rapidement modifié. Des adénovirus comportant des sites de liaison à Tcf dans leur promoteur précoce E2 se répliquent sélectivement dans les cellules qui possèdent une voie Wnt active. Ces virus sont capables de se répliquer dans un grand nombre de cellules cancéreuses du côlon, bien que certaines de ces cellules ne soient que semi-permissives pour la réplication des virus Tcf. Le but de ma thèse était d'augmenter la sécurité et l'efficacité des virus Tcf. Le promoteur viral endogène ElA a été remplacé par quatre sites de liaison à Tcf, ce qui a rendu son activation dépendante de la voie Wnt. Un virus comportant des sites de liaison pour Tcf dans les promoteurs ElA et E4 était plus sélectif pour la voie Wnt que les précédents virus Tcf-E2, et un virus comportant des sites Tcf dans tous les promoteurs précoces était encore plus sélectif, mais moins actif. J'ai montré que l'interaction entre ElA et p300 inhibait la transcription dépendante de Tcf, mais la délétion du domaine concerné dans ElA a eu pour effet d'atténuer les virus. Dans les cellules semi-permissives, la réplication des virus Tcf était toujours plus basse que celle du virus sauvage. J'ai identifié le promoteur E2 comme étant le plus sensible au type cellulaire, mais n'ai pas pu augmenter son activité par mutagenèse. Pour augmenter la toxicité du virus Tcf-E1A/E4, j'ai décidé d'exprimer un gène suicide, la cytosine déaminase (yCD), pendant la phase tardive de l'infection. Cette enzyme transforme la procirogue 5-FC en l'agent cytotoxique 5-FU. yCD était exprimée après réplication de l'ADN viral et augmentait la toxicité virale en présence de 5-FC. Les virus Tcf-ElA et yCD sont des vecteurs potentiellement utiles pour le traitement des métastases hépatiques de cancers colorectaux.

Cryo-electron microscopy of vitreous sections of native biological cells and tissues : methodology and applications

Résumé L'eau est souvent considérée comme une substance ordinaire puisque elle est très commune dans la nature. En fait elle est la plus remarquable de toutes les substances. Sans l'eau la vie sur la terre n'existerait pas. L'eau représente le composant majeur de la cellule vivante, formant typiquement 70 à 95% de la masse cellulaire et elle fournit un environnement à d'innombrables organismes puisque elle couvre 75% de la surface de terre. L'eau est une molécule simple faite de deux atomes d'hydrogène et un atome d'oxygène. Sa petite taille semble en contradiction avec la subtilité de ses propriétés physiques et chimiques. Parmi celles-là, le fait que, au point triple, l'eau liquide est plus dense que la glace est particulièrement remarquable. Malgré son importance particulière dans les sciences de la vie, l'eau est systématiquement éliminée des spécimens biologiques examinés par la microscopie électronique. La raison en est que le haut vide du microscope électronique exige que le spécimen biologique soit solide. Pendant 50 ans la science de la microscopie électronique a adressé ce problème résultant en ce moment en des nombreuses techniques de préparation dont l'usage est courrant. Typiquement ces techniques consistent à fixer l'échantillon (chimiquement ou par congélation), remplacer son contenu d'eau par un plastique doux qui est transformé à un bloc rigide par polymérisation. Le bloc du spécimen est coupé en sections minces (d’environ 50 nm) avec un ultramicrotome à température ambiante. En général, ces techniques introduisent plusieurs artefacts, principalement dû à l'enlèvement d'eau. Afin d'éviter ces artefacts, le spécimen peut être congelé, coupé et observé à basse température. Cependant, l'eau liquide cristallise lors de la congélation, résultant en une importante détérioration. Idéalement, l'eau liquide est solidifiée dans un état vitreux. La vitrification consiste à refroidir l'eau si rapidement que les cristaux de glace n'ont pas de temps de se former. Une percée a eu lieu quand la vitrification d'eau pure a été découverte expérimentalement. Cette découverte a ouvert la voie à la cryo-microscopie des suspensions biologiques en film mince vitrifié. Nous avons travaillé pour étendre la technique aux spécimens épais. Pour ce faire les échantillons biologiques doivent être vitrifiés, cryo-coupées en sections vitreuse et observées dans une cryo-microscope électronique. Cette technique, appelée la cryo- microscopie électronique des sections vitrifiées (CEMOVIS), est maintenant considérée comme étant la meilleure façon de conserver l'ultrastructure de tissus et cellules biologiques dans un état très proche de l'état natif. Récemment, cette technique est devenue une méthode pratique fournissant des résultats excellents. Elle a cependant, des limitations importantes, la plus importante d'entre elles est certainement dû aux artefacts de la coupe. Ces artefacts sont la conséquence de la nature du matériel vitreux et le fait que les sections vitreuses ne peuvent pas flotter sur un liquide comme c'est le cas pour les sections en plastique coupées à température ambiante. Le but de ce travail a été d'améliorer notre compréhension du processus de la coupe et des artefacts de la coupe. Nous avons ainsi trouvé des conditions optimales pour minimiser ou empêcher ces artefacts. Un modèle amélioré du processus de coupe et une redéfinitions des artefacts de coupe sont proposés. Les résultats obtenus sous ces conditions sont présentés et comparés aux résultats obtenus avec les méthodes conventionnelles. Abstract Water is often considered to be an ordinary substance since it is transparent, odourless, tasteless and it is very common in nature. As a matter of fact it can be argued that it is the most remarkable of all substances. Without water life on Earth would not exist. Water is the major component of cells, typically forming 70 to 95% of cellular mass and it provides an environment for innumerable organisms to live in, since it covers 75% of Earth surface. Water is a simple molecule made of two hydrogen atoms and one oxygen atom, H2O. The small size of the molecule stands in contrast with its unique physical and chemical properties. Among those the fact that, at the triple point, liquid water is denser than ice is especially remarkable. Despite its special importance in life science, water is systematically removed from biological specimens investigated by electron microscopy. This is because the high vacuum of the electron microscope requires that the biological specimen is observed in dry conditions. For 50 years the science of electron microscopy has addressed this problem resulting in numerous preparation techniques, presently in routine use. Typically these techniques consist in fixing the sample (chemically or by freezing), replacing its water by plastic which is transformed into rigid block by polymerisation. The block is then cut into thin sections (c. 50 nm) with an ultra-microtome at room temperature. Usually, these techniques introduce several artefacts, most of them due to water removal. In order to avoid these artefacts, the specimen can be frozen, cut and observed at low temperature. However, liquid water crystallizes into ice upon freezing, thus causing severe damage. Ideally, liquid water is solidified into a vitreous state. Vitrification consists in solidifying water so rapidly that ice crystals have no time to form. A breakthrough took place when vitrification of pure water was discovered. Since this discovery, the thin film vitrification method is used with success for the observation of biological suspensions of. small particles. Our work was to extend the method to bulk biological samples that have to be vitrified, cryosectioned into vitreous sections and observed in cryo-electron microscope. This technique is called cryo-electron microscopy of vitreous sections (CEMOVIS). It is now believed to be the best way to preserve the ultrastructure of biological tissues and cells very close to the native state for electron microscopic observation. Since recently, CEMOVIS has become a practical method achieving excellent results. It has, however, some sever limitations, the most important of them certainly being due to cutting artefacts. They are the consequence of the nature of vitreous material and the fact that vitreous sections cannot be floated on a liquid as is the case for plastic sections cut at room temperature. The aim of the present work has been to improve our understanding of the cutting process and of cutting artefacts, thus finding optimal conditions to minimise or prevent these artefacts. An improved model of the cutting process and redefinitions of cutting artefacts are proposed. Results obtained with CEMOVIS under these conditions are presented and compared with results obtained with conventional methods.

Translation of polarity cues into asymmetric spindle positioning in "Caenorhabditis elegans"

Abstract: Asymmetric cell division is important to generate tissue diversity. The Caenorhabditis elegans embryo is well suited to study the mechanisms of asymmetric cell division. In wild type one-cell stage embryos, the spindle sets up along the anterior-posterior axis (AP). During anaphase, the spindle elongates. While the anterior spindle pole is relatively immobile, the posterior spindle pole moves towards the posterior cortex during anaphase leading to an asymmetric spindle position. As a result, the first cleavage gives rise to a large anterior blastomere and a smaller posterior one, which differs also in cell fate determinants. This posterior spindle displacement occurs in response to polarity cues set up along the AP axis by the PAR proteins and is due to imbalanced pulling forces acting on the two spindle poles, with net forces acting on the posterior spindle pole being more extensive than those at the anterior one. The project of my thesis was to characterize the involvement of two new components, gpr-1 and gpr-2, in spindle positioning. These genes encode essentially identical proteins containing a GoLoco motif characteristic of proteins interacting with α subunits of heterotrimeric G protein (Gα). In gpr-1/2(RNAi) embryos and in embryos lacking simultaneously two α subunits, goa-1 and gpa-16, (Ga(RNAi) embryos), there is a minimal posterior displacement of the spindle during anaphase, and the first division is equal. I found that the pulling forces acting on the two spindle poles is weak and equal in gpr-1/2(RNAi) and Gα (RNAi) embryos. I found that GPR-1/2 acts downstream of polarity cues for generation of pulling forces. Furthermore, I showed that GPR-1/2 distribution was enriched at the posterior cortex during metaphase whereas GOA-1 and GPA-16 were uniformly distributed at the cell cortex throughout the cell cycle. Gα subunits oscillate between GDP- and GTP-bound forms. Gα signaling is turned on by GDP/GTP exchange catalyzed by guanine nucleotide exchange factors (GEFs) and turned off by hydrolysis of GTP catalyzed by GTPase activating proteins (GAPs). A third class of proteins, the guanine dissociation inhibitors (GDIs), binds the GDP-bound form of Gα subunits and inhibits nucleotide exchange. I found that GPR-1/2 acts as a GDI for GOA-1. Taken together, my findings suggest a model in which differential activation of Gα subunits along the AP axis may translate into generation of differential pulling forces on the anterior and posterior spindle poles, and, thus, asymmetric cell division. Résumé L'embryon du nématode Caenorhabditis elegans est un modèle approprié pour étudier les mécanismes de la division asymétrique. Chez l'embryon précoce, le fuseau mitotique se forme le long de l'axe antéro-postérieur (A/P) et au centre de l'embryon, le pôle antérieur restant relativement immobile alors que le pôle postérieur du fuseau se déplace vers le cortex postérieur au cours de l'anaphase conduisant à une position excentrée du fuseau. 11 en résulte une première division qui génère un blastomère antérieur et postérieur de grande et petite taille respectivement et qui diffèrent en facteurs développementaux. Ce déplacement postérieur se produit en réponse de la polarité établie par la distribution polarisée des protéines PAR et est le résultat de la génération de forces inégales tirant sur les deux pôles du fuseau, les forces agissant sur le pôle postérieur du fuseau étant plus grandes. Le projet de ma thèse était d'identifier la fonction de deux nouveaux constituants, gpr-1 et gpr-2 dans le positionnement asymétrique du fuseau. Ces gènes codent essentiellement pour la même protéine qui contient un motif GoLoco, caractéristique des protéines interagissant avec la sous-unité alpha des protéines G hétérotrimériques. Chez l'embryon gpr-1/2(RNAi) et chez les embryons dépourvus d'activité de deux sous-unités alpha, goa-1 et gpa-16, (Gα(RNAi)), j'ai montré qu'il y avait un déplacement minimal du fuseau vers le pôle postérieur au cours de l'anaphase et la première division est symétrique en raison de forces faibles et égales agissant sur les deux pôles du fuseau. J'ai également montré que gpr-1/2 était requis en aval des signaux établissant la polarité pour générer les forces responsables du positionnement asymétrique du fuseau. De plus, j'ai montré que GPR-1/2 était enrichi au pôle postérieur lors de la métaphase alors que GOA-1 et GPA-16 étaient localisés de façon uniforme au cortex de l'embryon précoce. Gas oscillent entre une forme liée au GDP et une forme liée au GTP. La signalisation des Gas est activée par l'échange GDP/GTP qui est catalysé par des protéines GEFs. La signalisation des Gas est désactivée par l'hydrolyse du GTP qui est catalysée par des protéines GAPs. Une troisième classe de protéines, GDIs lie la forme GDP et inhibe l'échange de nucléotides. J'ai montré que GPR-1/2 agissait comme un GDI pour GOA-1. Mes résultats suggèrent un modèle dans lequel une activation différentielle des Gα le long de l'axe A/P pourrait générer des forces différentielles sur le pôle antérieur et postérieur du fuseau.