Fonction de la protéine Ceroid lipofuscinosis neuronal 5 (CLN5) dans le tri et le recyclage à l’endosome

Le tri et le transport efficace des hydrolases acides vers le lysosome jouent un rôle critique pour la fonction des cellules. Plus de 50 maladies humaines sont dues à des mutations des enzymes lysosomales, des protéines régulant des processus-clés du transport vers le lysosome ou des enzymes effectuant des modifications posttraductionnelles importantes pour la fonction du lysosome. L’objectif de cette thèse est d’identifier des protéines et des mécanismes permettant à la cellule de réguler le transport des enzymes vers le lysosome. Nous avons formulé l’hypothèse que des protéines mutées dans des maladies lysosomales et dont les fonctions étaient inconnues pouvaient jouer un rôle dans le transport vers le lysosome. Les céroïdes-lipofuscinoses neuronales forment une famille de maladies lysosomales rares mais sont aussi les maladies neurodégénératives infantiles les plus fréquentes. Plusieurs gènes impliqués dans les NCL encodent des protéines aux fonctions inconnues. Les travaux présentés dans cette thèse ont identifié la protéine « ceroid lipofuscinosis neuronal-5 » (CLN5) qui est localisée à l’endosome et au lysosome comme élément nécessaire au recrutement et à l’activation de rab7. Rab7 est une protéine Rab-clé qui contrôle le trafic à l’endosome tardif. Cette petite GTPase est impliquée dans le recrutement de retromer, un complexe protéique qui régule le trafic de l’endosome vers l’appareil de Golgi des récepteurs de tri lysosomal comme sortilin et le récepteur du mannose-6-phosphate. Dans les cellules où CLN5 est déplété, les récepteurs de tri lysosomal sont moins recyclés plus rapidement dégradés. En utilisant des expériences de photomarquage nous avons aussi pu démontrer que Rab7 est moins activées en l’absence de CLN5. Pour exécuter leur fonction les protéines rabs doivent être recrutée à la membrane et activées par l’échange d’une molécule de GDP pour une molécule de GTP. Le recrutement des Rabs à la membrane nécessite une modification posttraductionnelle lipidique pour être facilités. En utilisant un modèle de levures nous avons démontré que l’homologue de Rab7, Ypt7 est palmitoylée. Nous avons aussi démontré que la palmitoyltransférase Swif1 est nécessaire au recrutement de Ypt7 à la membrane. Nous avons aussi remarqué que les sous- unités de retromer chez la levure sont moins recrutées lorsque les palmitoyltransférases sont déplétées. Dans les cellules de mammifères nous avons démontré que Rab7 est également palmitoylé et que cette palmitoylation est possiblement effectuée par les palmitoyltransférases DHHC1 et DHHC8. La palmitoylation de Rab7 a lieu sur les cystéines en C-terminal qui sont nécessaires au recrutement membranaire et qui auparavant étaient uniquement décrites comme prénylées. En utilisant la méthode de « click chemistry » nous avons découvert que lorsque la prénylation de Rab7 est bloquée le niveau de palmitoylation augmente. Pour caractériser l’interaction entre CLN5 et Rab7 nous avons performé des expériences afin d’établir définitivement la topologie de cette protéine. Nous avons ainsi démontré que CLN5 est une protéine hautement glycosylée qui est initialement traduite en protéine transmembranaire et subséquemment clivée par un membre de la famille des peptidase de peptide signal (SPP). Cette protéine soluble peut alors possiblement interagir avec CLN3 qui est aussi palmitoylée pour recruter et activer Rab7. Nos études suggèrent pour la première fois que CLN5 pourrait être un recruteur et un activateur de Rab7 qui agirait avec la protéine CLN3 pour séquestrer Rab7 avec les autres récepteurs palmitoylés et permettre leur recyclage vers l’appareil de Golgi.

Le maintien de la stabilité génomique du plastide : un petit génome d’une grande importance

Chez les plantes, le génome plastidique est continuellement exposé à divers stress mutagènes, tels l’oxydation des bases et le blocage des fourches de réplication. Étonnamment, malgré ces menaces, le génome du plastide est reconnu pour être très stable, sa stabilité dépassant même celle du génome nucléaire. Néanmoins, les mécanismes de réparation de l’ADN et du maintien de la stabilité du génome plastidique sont encore peu connus. Afin de mieux comprendre ces processus, nous avons développé une approche, basée sur l’emploi de la ciprofloxacine, qui nous permet d’induire des bris d’ADN double-brins (DSBs) spécifiquement dans le génome des organelles. En criblant, à l’aide de ce composé, une collection de mutants d’Arabidopsis thaliana déficients pour des protéines du nucléoïde du plastide, nous avons identifié 16 gènes vraisemblablement impliqués dans le maintien de la stabilité génomique de cette organelle. Parmi ces gènes, ceux de la famille Whirly jouent un rôle primordial dans la protection du génome plastidique face aux réarrangements dépendants de séquences de microhomologie. Deux autres familles de gènes codant pour des protéines plastidiques, soit celle des polymérases de types-I et celle des recombinases, semblent davantage impliquées dans les mécanismes conservateurs de réparation des DSBs. Les relations épistatiques entre ces gènes et ceux des Whirly ont permis de définir les bases moléculaires des mécanismes de la réparation dépendante de microhomologies (MHMR) dans le plastide. Nous proposons également que ce type de mécanismes servirait en quelque sorte de roue de secours pour les mécanismes conservateurs de réparation. Finalement, un criblage non-biaisé, utilisant une collection de plus de 50,000 lignées mutantes d’Arabidopsis, a été réalisé. Ce criblage a permis d’établir un lien entre la stabilité génomique et le métabolisme des espèces réactives oxygénées (ROS). En effet, la plupart des gènes identifiés lors de ce criblage sont impliqués dans la photosynthèse et la détoxification des ROS. Globalement, notre étude a permis d’élargir notre compréhension des mécanismes du maintien de la stabilité génomique dans le plastide et de mieux comprendre l’importance de ces processus.

Effet du stress prolifératif sur la fonction des cellules souches hématopoïétiques : rôles des gènes Scl, E2A et Heb

Le système hématopoïétique est un tissu en constant renouvellement et les cellules souches hématopoïétiques (CSHs) sont indispensables pour soutenir la production des cellules matures du sang. Deux fonctions définissent les CSHs; la propriété d’auto-renouvellement, soit la capacité de préserver l’identité cellulaire suivant une division, et la multipotence, le potentiel de différenciation permettant de générer toutes les lignées hématopoïétiques. Chez l’adulte, la majorité des CSHs sont quiescentes et l’altération de cet état corrèle avec une diminution du potentiel de reconstitution des CSHs, suggérant que la quiescence protège les fonctions des CSHs. La quiescence est un état réversible et dynamique et les réseaux génétiques le contrôlant restent peu connus. Un nombre croissant d’évidences suggère que si à l’état d’homéostasie il y a une certaine redondance entre les gènes impliqués dans ces réseaux de contrôle, leurs rôles spécifiques sont révélés en situation de stress. La famille des bHLHs (basic helix-loop-helix) inclue différentes classes des protéines dont ceux qui sont tissu-spécifiques comme SCL, et les protéines E, comme E12/E47 et HEB. Certains bHLHs sont proposés êtres important pour la fonction des cellules souches, mais cela ne fait pas l’unanimité, car selon le contexte cellulaire, il y a redondance entre ces facteurs. La question reste donc entière, y a-t-il un rôle redondant entre les bHLHs d’une même classe pour la fonction à long-terme des CSHs? Les travaux présentés dans cette thèse visaient dans un premier temps à explorer le lien encore mal compris entre la quiescence et la fonction des CSHs en mesurant leurs facultés suite à un stress prolifératif intense et dans un deuxième temps, investiguer l’importance et la spécificité de trois gènes pour la fonction des CSHs adultes, soit Scl/Tal1, E2a/Tcf3 et Heb/Tcf12. Pour répondre à ces questions, une approche cellulaire (stress prolifératif) a été combinée avec une approche génétique (invalidation génique). Plus précisément, la résistance des CSHs au stress prolifératif a été étudiée en utilisant deux tests fonctionnels quantitatifs optimisés, soit un traitement basé sur le 5-fluorouracil, une drogue de chimiothérapie, et la transplantation sérielle en nombre limite. Dans la mesure où la fonction d’un réseau génique ne peut être révélée que par une perturbation intrinsèque, trois modèles de souris, i.e. Scl+/-, E2a+/- et Heb+/- ont été utilisés. Ceci a permis de révéler que l’adaptation des CSHs au stress prolifératif et le retour à l’équilibre est strictement contrôlé par les niveaux de Scl, lesquels règlent le métabolisme cellulaire des CSHs en maintenant l’expression de gènes ribosomaux à un niveau basal. D’autre part, bien que les composantes du réseau puissent paraître redondants à l’équilibre, mes travaux montrent qu’en situation de stress prolifératif, les niveaux de Heb restreignent la prolifération excessive des CSHs en induisant la sénescence et que cette fonction ne peut pas être compensée par E2a. En conclusion, les résultats présentés dans cette thèse montrent que les CSHs peuvent tolérer un stress prolifératif intense ainsi que des dommages à l’ADN non-réparés, tout en maintenant leur capacité de reconstituer l’hématopoïèse à long-terme. Cela implique cependant que leur métabolisme revienne au niveau de base, soit celui trouvé à l’état d’homéostasie. Par contre, avec l’augmentation du nombre de division cellulaire les CSHs atteignent éventuellement une limite d’expansion et entrent en sénescence.

La petite GTPase Rab11 et ses interacteurs orchestrent la migration cellulaire collective et la cytocinèse chez la Drosophile

Le trafic vésiculaire permet un échange coordonné de molécules entre les différents organites de la cellule et dépend largement des petites GTPases de la famille des Rabs dont le nombre varie entre 27 chez la Drosophile et 70 chez l’Homme. Un des prochains défis consiste donc à élucider les mécanismes cellulaires qui coordonnent l’activité de ces Rabs, laquelle garantit un transport vésiculaire ordonné au sein de la cellule. Les Rabs agissent comme des interrupteurs moléculaires grâce à leur capacité à cycler entre un état actif et inactif. L’activité des Rabs est contrôlée par des protéines régulatrices puis des effecteurs en aval coordonnent leurs différentes fonctions. La petite GTPase Rab11 est essentielle au développement de plusieurs organismes incluant la Drosophile, C. elegans et la souris puisqu’elle se retrouve au cœur de différentes voies de transport. D’ailleurs, le trafic de molécules dépendant de Rab11 est perturbé dans plusieurs pathologies. Malgré son rôle central dans le trafic vésiculaire, la régulation de Rab11 reste peu comprise in vivo. Cette thèse se penche sur les mécanismes moléculaires contrôlant les fonctions de Rab11 et de ses effecteurs lors de la migration cellulaire collective et lors de la cytocinèse. Nous avons identifié Evi5 comme un nouvel acteur clé de la migration cellulaire collective, et nous montrons qu’elle possède une activité Rab11-GAP essentielle pour maintenir les récepteurs de guidance actifs de façon polarisée au front de migration. Nous avons ensuite déterminé que Rab11 régule la communication cellulaire lors de la migration collective par l’entremise de son interaction avec la Moésine. Une question reste toutefois en suspens : sachant que Rab11 compte plus de 13 effecteurs, quels sont les mécanismes assurant la spécificité de l’interaction entre cette GTPase et un effecteur particulier? Une partie de la réponse provient peut-être de nos observations que les membres des Rab11-FIPs de classe I, une famille d’effecteurs de Rab11, interagissent avec les protéines d’échafaudage 14-3-3. Chez la Drosophile, Rip11 est le seul représentant des Rab11-FIPs de classe I et nous montrons que Rip11 aurait des fonctions inattendues durant la cytocinèse qui seraient coordonnées par 14-3-3. Nos recherches permettent de dresser un portrait plus authentique des mécanismes moléculaires régulant les différentes fonctions de Rab11 et de ses effecteurs in vivo.

Rôle des cellules dendritiques dans la modulation de la réponse immunitaire de l'hôte contre Streptococcus suis

Streptococcus suis est un important pathogène porcin et agent zoonotique responsable de méningites et de septicémies. À ce jour, les mécanismes impliqués dans la réponse immunitaire de l’hôte lors de l’infection par S. suis sont peu connus; et il en est de même pour les stratégies utilisées par S. suis afin de déjouer cette réponse. L’augmentation de l’incidence et de la sévérité des cas humains souligne le besoin d’une meilleure compréhension des interactions entre S. suis et le système immunitaire afin de générer une réponse immunitaire efficace contre ce pathogène. Les cellules dendritiques (DCs) sont de puissantes cellules présentatrices d’antigènes qui stimulent les lymphocytes T et B, assurant la liaison entre l’immunité innée et l’immunité adaptative. L’objectif principal de ce projet était d’évaluer le rôle joué par différents facteurs de virulence de S. suis sur la modulation de la fonction des DCs et de la réponse T-dépendante. Nous avons examiné l’effet des facteurs clés pour la virulence de S. suis, dont la capsule polysaccharidique (CPS), les modifications de la paroi cellulaire (D-alanylation de l’acide lipotéichoïque et N-déacétylation du peptidoglycane) et la toxine suilysine, sur l’activation et la maturation de DCs murines dérivées de la moelle osseuse (bmDCs). Suite à l’infection par S. suis, les bmDCs sont activées et subissent un processus de maturation caractérisé par l’augmentation de l’expression de molécules de co-stimulation et la production de cytokines pro-inflammatoires. La CPS est le principal facteur interférant avec la production de cytokines, même si les modifications de la paroi cellulaire et la suilysine peuvent également moduler la production de certaines cytokines. Enfin, la CPS, les modifications de la paroi cellulaire et la suilysine interfèrent avec la déposition du complément à la surface des bactéries et, en conséquence, avec le « killing » dépendant du complément. Les résultats ont été confirmés à l’aide de bmDCs porcines. Nous avons aussi voulu identifier les récepteurs cellulaires impliqués dans la reconnaissance de S. suis par les DCs. Nous avons démontré que la production de cytokines et l’expression des molécules de co-stimulation par les DCs sont fortement dépendantes de la signalisation par MyD88, suggérant que les DCs reconnaissent S. suis et deviennent activées majoritairement via la signalisation par les récepteurs de type Toll (TLRs). En effet, on remarque une diminution de la production de plusieurs cytokines ainsi que de l’expression de certaines molécules de co-stimulation chez les DCs TLR2-/- ou TLR2-/- et TLR9-/- double négatives. Finalement, le récepteur NOD2 semblait jouer un rôle partiel dans l’activation des DCs suite à une infection par S. suis.Enfin, nous avons évalué les conséquences de la modulation des fonctions des DCs sur le développement de la réponse T-dépendante. Les splénocytes totaux produisent plusieurs cytokines en réponse à S. suis. Des analyses in vivo et ex vivo ont permis d’observer l’implication des cellules T CD4+ et le développement d’une réponse de type « T helper » 1 (TH1) bien que la quantité de cytokines TH1 produites lors de l’infection in vivo par S. suis demeure assez basse. La CPS de S. suis interfère avec la production de plusieurs cytokines par les cellules T in vitro. Expérimentalement, l’infection induite par S. suis résulte en de faibles niveaux de production d’anticorps anti-S. suis, mais aussi d’anticorps dirigés contre l’ovalbumine utilisée comme antigène rapporteur. Cette interférence est corrélée avec la sévérité des signes cliniques, suggérant que S. suis interfère avec le développement d’une réponse immunitaire adaptative appropriée qui serait requise pour contrôler la progression de l’infection. Les résultats de cette étude mèneront à une meilleure compréhension de la réponse immunitaire de l’hôte lors de l’infection par S. suis.

Les azasulfurylpeptides : synthèse, analyse conformationnelle et applications biologiques

Les azasulfurylpeptides sont des mimes peptidiques auxquels le carbone en position alpha et le carbonyle d’un acide aminé sont respectivement remplacés par un atome d’azote et un groupement sulfonyle (SO2). Le but premier de ce projet a été de développer une nouvelle méthode de synthèse de ces motifs, également appelés N-aminosulfamides. À cette fin, l’utilisation de sulfamidates de 4-nitrophénol s’est avérée importante dans la synthèse des azasulfuryltripeptides, permettant le couplage d’hydrazides avec l’aide d’irradiation aux micro-ondes (Chapitre 2). Par la suite, en quantité stoechiométrique d’une base et d’un halogénure d’alkyle, les azasulfurylglycines (AsG) formés peuvent être chimiosélectivement alkylés afin d’y insérer diverses chaînes latérales. Les propriétés conformationnelles des N-aminosulfamides à l’état solide ont été élucidées grâce à des études cristallographiques par rayons X : elles possèdent une structure tétraédrique autour de l’atome de soufre, des traits caractéristiques des azapeptides et des sulfonamides, ainsi que du potentiel à favoriser la formation de tours gamma (Chapitre 3). Après le développement d’une méthode de synthèse des N-aminosulfamides en solution, une approche combinatoire sur support solide a également été élaborée sur la résine amide de Rink afin de faciliter la génération d’une librairie d’azasulfurylpeptides. Cette étude a été réalisée en employant le growth hormone releasing peptide 6 (GHRP-6, His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2). Ce dernier est un hexapeptide possédant une affinité pour deux récepteurs, le growth hormone secretagogue receptor 1a (GHS-R1a) et le récepteur cluster of differenciation 36 (CD36). Une affinité sélective envers le récepteur CD36 confère des propriétés thérapeutiques dans le traitement de la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA). Six analogues d’azasulfurylpeptides de GHRP-6 utilisés comme ligands du CD36 ont été synthétisés sur support solide, mettant en évidence le remplacement du tryptophane à la position 4 de GHRP-6 (Chapitre 4). Les analogues de GHRP-6 ont été ensuite analysés pour leur capacité à moduler les effets de la fonction et de la cascade de signalisation des ligands spécifiques au Toll-like receptor 2 (TLR2), en collaboration avec le Professeur Huy Ong du département de Pharmacologie à la Faculté de Pharmacie de l’Université de Montréal. Le complexe TLR2-TLR6 est reconnu pour être co-exprimé et modulé par CD36. En se liant au CD36, certains ligands de GHRP-6 ont eu un effet sur la signalisation du TLR2. Par exemple, les azasulfurylpeptides [AsF(4-F)4]- et [AsF(4-MeO)4]-GHRP-6 ont démontré une capacité à empêcher la surproduction du monoxyde d’azote (NO), un sous-produit réactif formé suite à l’induction d’un signal dans les macrophages par des ligands spécifiques liés au TLR2, tel le fibroblast-stimulating lipopeptide 1 (R-FSL-1) et l’acide lipotéichoïque (LTA). En addition, la sécrétion du tumor necrosis factor alpha (TNFa) et du monocyte chemoattractant protein 1 (MCP-1), ainsi que l’activation du nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells (NF-kB), ont été réduites. Ces résultats démontrent le potentiel de ces azasulfurylpeptides à pouvoir réguler le rôle du TLR2 qui déclenche des réponses inflammatoires et immunitaires innées (Perspectives). Finalement, le potentiel des azasulfurylpeptides d’inhiber des métallo-bêta-lactamases, tels le New-Delhi Metallo-bêta-lactamase 1 (NDM-1), IMP-1 et le Verona Integron-encoded Metallo-bêta-lactamase 2 (VIM-2), a été étudié en collaboration avec le Professeur James Spencer de l’Université de Bristol (Royaumes-Unis). Certains analogues ont été des inhibiteurs micromolaires du IMP-1 (Perspectives). Ces nouvelles voies de synthèse des azasulfurylpeptides en solution et sur support solide devraient donc permettre leur utilisation dans des études de relations structure-activité avec différents peptides biologiquement actifs. En plus d'expandre l'application des azasulfurylpeptides comme inhibiteurs d'enzymes, cette thèse a révélé le potentiel de ces N-aminosulfamides à mimer les structures secondaires peptidiques, tels que les tours gamma. À cet égard, l’application des azasulfurylpeptides a été démontrée par la synthèse de ligands du CD36 présentant des effets modulateurs sur le TLR2. Compte tenu de leur synthèse efficace et de leur potentiel en tant qu’inhibiteurs, les azasulfurylpeptides devraient trouver une large utilisation dans les sciences de peptides pour des applications dans la médecine et de la chimie biologique.

Étude de l’évolution du tropisme et de la pression sélective exercée sur le gène de l’enveloppe du virus de l’immunodéficience humaine de type 1 au cours de la grossesse et à l’échelle de la population.

Introduction. Le VIH-1 évolue en fonction de la réponse immunitaire spécifique de l’hôte. La pression sélective exercée par la réponse immunitaire VIH-spécifique de l’hôte entraine l’évolution des gènes viraux et à terme détermine l’évolution de la maladie. Cette évolution du virus à l’échelle d’un individu façonne également l’évolution du virus à l’échelle de la population et détermine le devenir de l’épidémie. Le VIH utilise les corécepteurs d’entrée CCR5 (virus R5) et CXCR4 (virus X4) afin d’infecter la cellule cible, et l’évolution du tropisme du virus de R5 vers X4, appelé switch du tropisme, est associé à la progression de la maladie. Les virus R5 sont rencontrés en début d’infection tandis que les virus X4 apparaissent en fin de maladie chez un certain de nombre de patients et sont considérés comme plus virulents. La pression sélective immunitaire exercée sur le gène de l’enveloppe (env) peut donc entrainer l’évolution du tropisme du VIH. La grossesse est un état immunitaire particulier considéré comme étant principalement caractérisé par un biais Th2 nécessaire à l’établissement de la tolérance materno-fétale. Le switch de tropisme de R5 vers X4 en grossesse n’a jamais été documenté, de même que l’évolution des déterminants du tropisme à l’échelle de la population. Hypothèses. Les changements immunitaires associés à l’initiation et la progression de la grossesse engendrent des changements dans la pression immunitaire exercée sur l’enveloppe et peuvent favoriser le switch du tropisme. L’évolution du tropisme du VIH-1 peut être observé à l’échelle de la population au même titre que l’évolution de l’enveloppe virale. Objectifs. Analyser l’évolution du tropisme et décrire la pression sélective sur l’enveloppe des femmes enceintes infectées par le VIH-1. Analyser l’évolution des déterminants du tropisme à l’échelle de la population. Méthodes. Nous avons dans un premier temps analysé l’évolution des déterminants du tropisme et déterminé le génotype et phénotype du VIH-1 chez 19 femmes enceintes issues de la cohorte du centre maternel et infantile sur le SIDA de l’hôpital Sainte-Justine (CMIS). Nous avons ensuite caractérisé et comparé la pression sélective exercée sur env, par une méthode bayésienne, chez 31 femmes enceinte et 29 femmes non-enceintes. Enfin, nous avons analysé et comparé des déterminants du tropisme entre des séquences d’enveloppe contemporaines et anciennes, issues des bases de données du NCBI. Résultats. Nos résultats montrent la présence de virus X4 chez la moitié de notre cohorte, et un switch de tropisme de R5 vers X4 chez 5/19 sujets. Les séquences des femmes enceintes présentaient des taux de substitutions plus élevées que celles des femmes non-enceintes. La pression sélective dans la région C2 était plus faible chez les femmes enceintes que chez les femmes non-enceintes, et différait dans 4 positions entre ces 2 groupes. Cette sélection diminuait au cours de la grossesse chez les patientes traitées. Enfin, une accumulation de mutations X4 a été observée dans les séquences R5 contemporaines par rapport aux séquences R5 anciennes. Conclusion. Les changements immunitaires associés à la grossesse semblent induire des modifications subtiles dans la pression sélective exercée sur env, suffisant à influencer l’évolution du tropisme de R5 vers X4. Un switch du tropisme à l’échelle de la population impliquerait une épidémie évoluant vers une plus grande virulence du virus. Nos résultats sont d’importance en ce qui concerne la prophylaxie antirétrovirale pour la santé de la mère et la prévention de la transmission mère-enfant du VIH-1. Ils sont aussi importants concernant l’avenir de la thérapie antirétrovirale dans le contexte d’une épidémie évoluant vers une plus grande virulence

Régulation de la division asymétrique chez C. elegans

La division asymétrique est essentielle pour générer la diversité au cours du développement et permet aussi de réguler la balance entre renouvellement et différenciation des cellules souches chez l’adulte. Dans ces deux cas de figure, elle dépend respectivement d’une polarité intrinsèque ou d’une polarité extrinsèque. C. elegans est un excellent modèle pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires de la division asymétrique in vivo. Chez l’embryon, le maintien d’un axe de polarité antéro-postérieur dépend des protéines PAR conservées et localisées de façon asymétrique en deux groupes mutuellement exclusifs; le groupe antérieur avec PAR-3, PAR-6, PKC-3 et le groupe postérieur avec PAR-2 et PAR-1. L’absence d’une protéine PAR entraine une perte de polarité et une létalité embryonnaire. Lors d’un crible par ARN interférence mené par Jean-Claude Labbé pour identifier les suppresseurs de la létalité associée à la perte de PAR-2, deux cyclines de type B, CYB-2.1 et CYB-2.2 ont été trouvées. J’ai déterminé que CYB-2.1 et CYB-2.2 interviennent dans la polarité sans perturber le cycle cellulaire et agissent vraisemblablement avec leur kinase associée, CDK-1, pour stabiliser les niveaux protéiques de PAR-6. Ces travaux permettent de mieux définir les liens étroits entre polarité et cycle cellulaire. La lignée germinale de C. elegans est un excellent modèle pour étudier les divisions des cellules souches germinales in vivo. Par contre, l’absence d’orientation préférentielle de ces divisions laisse envisager que la complexité morphologique de la niche pourrait engendrer une diversité d’axe possible. J’ai étudié la régulation morphologique de cette niche, une unique cellule somatique appelée distal tip cell (DTC), qui arborise de longues extensions au stade adulte. Mes résultats préliminaires favorisent un modèle dans lequel les cellules souches et progéniteurs germinaux (CSPG) supportent la formation de ces extensions. Enfin, j’ai obtenu des conditions favorables à l’étude de la division asymétrique extrinsèque dans ce modèle, en simplifiant l’architecture de la niche dans des conditions qui préservent les divisions cellulaires des cellules souches. Mes travaux ont permis de mieux comprendre les liens unissant les différents processus biologiques impliqués dans la division asymétrique, d’une part par l’étude du rôle qu’y jouent des régulateurs clés du cycle cellulaire au cours du développement et d’autre part par la caractérisation d’une communication bidirectionnelle entre la niche et les cellules souches chez l’adulte.

La construction de la conjugalité chez des conjoints de couples formés sur des sites de rencontre en ligne : une perspective interactionniste symbolique

Le couple est le commencement de la famille, la cellule fondamentale de la société et un des principaux lieux de solidarité pour les individus. Or, depuis quelques années l’irruption d’internet a permis l’instauration de rapports sociaux nouveaux que l’on peut identifier dans les façons de rencontrer quelqu’un ou de tomber amoureux. L’apparition des sites de rencontre a notamment permis à des individus de pouvoir faire la rencontre amoureuse de l’autre sur un site dédié et à convenance. Cette étude vise à une meilleure compréhension du phénomène social qu’est la construction de la conjugalité à partir de la rencontre sur des sites dédiés sur internet et partant des représentations des participants interrogés. Notre but était également de démontrer comme l’a souligné Marie-Chantal Doucet (2009) que l’action de l’individu sur les sites de rencontre en ligne n’est pas le fait de déterminations mais qu’il bénéficie plutôt d’une marge de jeu, lui permettant d’interpréter les codes et de donner un sens à ses actions et aux actions des autres car l’individu sur les sites de rencontre en ligne joue un personnage. Pour mener à bien cette étude, nous avons adopté un cadre théorique qui s’inscrit dans la perspective de l’interactionnisme symbolique en nous appuyant sur une approche par théorisation ancrée. Il ressort entre autre de l’enquête qualitative que nous avons menée que la construction conjugale est surtout le fruit de la rencontre en face à face car la rencontre en ligne proprement dite est marquée par le stigma et la marchandisation des corps que proposent les sites de rencontre ne sont pas propice au sentiment d’intimité favorable au développement du lien conjugal.

Impact de la maladie du greffon contre l’hôte sur la reconstitution immunitaire suite à une transplantation allogénique de cellules souches hématopoïétiques

La transplantation allogénique de cellules souches hématopoïétiques (ASCT) est couramment utilisée pour traiter différents cancers hématologiques. Malheureusement, l’effet bénéfique de cette technique est limité par la réaction du greffon contre l’hôte (GVHD) qui demeure la cause principale de mortalité post-greffe. La GVHD endommage différents organes et retarde la reconstitution immunitaire des lymphocytes T (LT) ce qui augmente les risques d’infection et de rechute. Le développement de nouveaux traitements permettant d’accélérer la reconstitution immunitaire augmenterait donc les chances de survie des patients greffés. Il existe deux façons de régénérer des LT: via la thymopoïèse qui consiste à produire de nouveaux LT, ou par la prolifération homéostatique (PH) qui implique l’expansion rapide des LT matures retrouvés dans le greffon. La PH requiert deux signaux essentiels: l’interleukine-7 (IL-7) et la présentation d’antigènes du soi par les cellules dendritiques (DC) via le complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) I pour les LT CD8+ et le CMH II pour les LT CD4+. Dans un contexte d’ASCT, la chimiothérapie et la GVHD endommagent le thymus rendant la thymopoïèse inefficace. Par conséquent, la reconstitution immunitaire repose presque entièrement sur la PH des LT. L’objectif de cette thèse était de comprendre comment la GVHD affecte la reconstitution des LT. Grâce à un modèle murin, nous avons démontré que la PH des LT CD4+ est absente durant la GVHD et ce, dû à de faibles niveaux d’IL-7 et une diminution du nombre de DC. La perte des DC est en grande partie causée par des niveaux réduits de stromal derived factor-1α (SDF-1α) et par l’absence de progéniteurs de DC dans la moelle osseuse des souris en GVHD. Le traitement des souris en GVHD avec du SDF-1α permet d’augmenter le nombre de DC, et lorsqu’administré avec l’IL-7, améliore significativement la PH des LT CD4+. Contrairement aux LT CD4+, l’administration d’IL-7 seule est suffisante pour restaurer la PH des LT CD8+ durant la GVHD et ce, même en absence des DC. Ces différences s’expliquent pour deux raisons : 1) l’expression du CMH I, contrairement au CMH II, n’est pas limitée aux DC mais est également exprimée par les cellules stromales du receveur ce qui est suffisant pour induire la PH des LT CD8+ et 2) les LT CD8+ répondent à des concentrations plus faibles d’IL-7 systémique comparativement aux LT CD4+. En conclusion, l’ensemble de ces résultats permettra de mettre en place des études translationnelles sur le potentiel thérapeutique du SDF-1α et de l’IL-7 dans la reconstitution immunitaire des patients greffés.

Neurotensinergic modulation of glutamatergic neurotransmission in VTA neurons.

L’aire tegmentaire ventrale (VTA) contient une forte densité de terminaisons neurotensinergiques ainsi que des récepteurs à la surface des neurones dopaminergiques et non-dopaminergiques. Le VTA a été impliqué dans des maladies comme la schizophrénie, les psychoses et l’abus de substance. Les drogues d’abus sont connues pour induire le phénomène de sensibilisation - un processus de facilitation par lequel l’exposition à un stimulus produit une réponse augmentée lors de l’exposition subséquente au même stimulus. La sensibilisation se développe dans le VTA et implique mécanismes dopaminergiques et glutamatergiques. Il a été montré que les antagonistes neurotensinergiques bloquaient le développement de la sensibilisation et certains mécanismes de récompense et ces effets pourraient être médiés indirectement par une modulation de la neurotransmission glutamatergique. Cependant, on connaît peu les mécanismes de modulation de la transmission glutamatergique par la neurotensine (NT) dans le VTA. Le but de la présente thèse était d’étudier la modulation neurotensinergique de la neurotransmission glutamatergique dans les neurones dopaminergiques et non-dopaminergiques du VTA. Pour ce faire, nous avons utilisé la technique du patch clamp dans la cellule entière dans des tranches horizontales du VTA pour étudier les effets de différents agonistes et antagonistes neurotensinergiques. Les neurones ont été identifié comme Ih+ (présumés dopaminergiques) ou Ih- (présumés non-dopaminergiques) selon qu’ils exprimaient ou non un courant cationique activé par l’hyperpolarisation (Ih). Des techniques d’immunocytochimie ont été utilisées pour marquer les neurones et vérifier leur localisation dans le VTA. Dans une première étude nous avons trouvé que la neurotensine indigène (NT1-13) ou son fragment C-terminal, NT8-13, induisait une augmentation comparable des courants postsynaptiques excitateurs glutamatergiques (CPSEs) dans les neurones Ih+ ou Ih- du VTA. L'augmentation induite dans les neurones Ih+ par la NT8-13 a été bloquée par le SR48692, un antagoniste des récepteurs NTS1, et par le SR142948A, un antagoniste des récepteurs NTS1 et NTS2, suggérant que l'augmentation était médiée par l’activation des récepteurs NTS1. Dans les neurones Ih- l'augmentation n’a été bloquée que par le SR142948A indiquant une implication des récepteurs NTS2. Dans une deuxième étude, nous avons testé les effets de la D-Tyr[11]NT (un analogue neurotensinergique ayant différentes affinités de liaison pour les sous-types de récepteurs neurotensinergiques) sur les CPSEs glutamatergiques dans les neurones Ih+ et Ih- en parallèle avec une série d’expériences comportementales utilisant un paradigme de préférence de place conditionnée (PPC) menée dans le laboratoire de Pierre-Paul Rompré. Nous avons constaté que la D-Tyr[11]NT induisaient une inhibition dépendante de la dose dans les neurones Ih+ médiée par l'activation de récepteurs NTS2. En revanche, la D-Tyr[11]NT a produit une augmentation des CPSEs glutamatergiques médiée par des récepteurs NTS1 dans les neurones Ih-. Les résultats des expériences comportementales ont montré que des microinjections bilatérales de D-Tyr[11]NT dans le VTA induisait une PPC bloquée uniquement par la co-injection de SR142948A et SR48692, indiquant un rôle pour les deux types de récepteurs, NTS1 et NTS2. Cette étude nous a permis de conclure que i) la D-Tyr[11]NT agit dans le VTA via des récepteurs NTS1 et NTS2 pour induire un effet de récompense et ii) que cet effet est dû, au moins en partie, à une augmentation de la neurotransmission glutamatergique dans les neurones non-dopaminergiques (Ih-). Dans une troisième étude nous nous sommes intéressés aux effets de la D-Tyr[11]NT sur les réponses isolées médiées par les récepteurs N-méthyl-D-aspartate (NMDA) et acide α-amino-3- hydroxy-5-méthyl-4-isoxazolepropionique (AMPA) dans les neurones du VTA. Nous avons constaté que dans les neurones Ih+ l’amplitude des CPSEs NMDA et AMPA étaient atténuées de la même manière par la D-Tyr[11] NT. Cette modulation des réponses était médiée par les récepteurs NTS1 et NTS2. Au contraire, dans les neurones Ih-, l’amplitude des réponses NMDA et AMPA étaient augmentées en présence de D-Tyr[11]NT et ces effets dépendaient de l’activation des récepteurs NTS1 localisés sur les terminaisons glutamatergiques. Ces résultats fournissent une preuve supplémentaire que le NT exerce une modulation bidirectionnelle sur la neurotransmission glutamatergique dans les neurones du VTA et met en évidence un nouveau type de modulation peptidergique des neurones non-dopaminergiques qui pourrait être impliqué dans la sensibilisation. En conclusion, la modulation neurotensinergique de la neurotransmission glutamatergique dans les neurones dopaminergiques et non-dopaminergiques du VTA se fait en sens opposé soit, respectivement, par une inhibition ou par une excitation. De plus, ces effets sont médiés par différents types de récepteurs neurotensinergiques. En outre, nos études mettent en évidence une modulation peptidergique de la neurotransmission glutamatergique dans le VTA qui pourrait jouer un rôle important dans les mécanismes de lutte contre la toxicomanie.

Étude de la migration des populations de lymphocytes B du sang de patients infectés par le virus d’immunodéficience humaine (VIH)

La dérégulation du compartiment de cellules B est une conséquence importante de l’infection par le virus de l’immunodéficience humaine (VIH-1). On observe notamment une diminution des nombres de lymphocytes B sanguins ainsi qu’une variation des fréquences relatives des différentes populations de lymphocytes B chez les individus infectés par rapport aux contrôles sains. Notre laboratoire a précédemment démontré l’implication des cellules dendritiques dans la dérégulation des lymphocytes B via la roduction excessive de BLyS/BAFF, un stimulateur des cellules B. De plus, lors l’études menées chez la souris transgénique présentant une maladie semblable au SIDA, et chez la souris BLyS/BAFF transgénique, l’infection au VIH-1 fut associée à une expansion de la zone marginale (MZ) de la rate. De façon intéressante, nous observons chez les contrôleurs élites une diminution de la population B ‘mature’ de la MZ. Il s’agit du seul changement important chez les contrôleurs élites et reflète possiblement un recrutement de ces cellules vers la périphérie ainsi qu’une implication dans des mécanismes de contrôle de l’infection. Pour tenter d’expliquer et de mieux comprendre ces variations dans les fréquences des populations B, nous avons analysé les axes chimiotactiques CXCL13-CXCR5, CXCL12-CXCR4/CXCR7, CCL20-CCR6 et CCL25-CCR9. L’étude longitudinale de cohortes de patients avec différents types de progression clinique ou de contrôle de l’infection démontre une modulation des niveaux plasmatiques de la majorité des chimiokines analysées chez les progresseurs rapides et classiques. Au contraire, les contrôleurs élites conservent des niveaux normaux de chimiokines, démontrant leur capacité à maintenir l’homéostasie. La migration des populations de cellules B semble être modulée selon la progression ou le contrôle de l’infection. Les contrôleurs élites présentent une diminution de la population B ‘mature’ de la MZ et une augmentation de la fréquence d’expression du récepteur CXCR7 associé à la MZ chez la souris, suggérant un rôle important des cellules de la MZ dans le contrôle de l’infection au VIH-1. De façon générale, les résultats dans cette étude viennent enrichir nos connaissances du compartiment de cellules B dans le contexte de l’infection au VIH-1 et pourront contribuer à élaborer des stratégies préventives et thérapeutiques contre ce virus.

Régulation du facteur de transcription FOXK1 par O-GlcNAcylation : implications dans la différenciation adipocytaire

Les modifications post-traductionnelles telles que la phosphorylation, l’OGlcNAcylation et l’ubiquitination jouent des rôles critiques dans la coordination des fonctions protéiques et par conséquent influencent grandement de nombreux processus cellulaires. Il est à noter que ces modifications sont hautement dynamiques et finement regulées. Par exemple, l’ubiquitination peut être réversible via l’action des déubiquitinases comme le suppresseur de tumeurs BAP1. Parmis les gènes codant pour les déubiquitinases, BAP1 est la plus souvent mutée dans le cancer. Des études récentes ont démontré l’importance des dynamiques de modifications post-traductionnelles dans la régulation du complexe BAP1. En plus, BAP1 forme un complexe multi-protéiques contenant plusieurs régulateurs transcriptionnels comme la protéine polycomb OGT et les facteurs de transcription FOXK1 et FOXK2. OGT est une enzyme unique qui catalyze l’ajout d’un groupement O-GlcNAc sur ses substrats afin d’en moduler l’activité enzymatique, les interactions protéines-protéines et leur localisation cellulaire. Cette modification est aussi liée au métabolisme puisque son substrat donneur, l’UDP-GlcNAc, est dérivé de la voie biosynthétique des hexosamines. Parallèlement, FOXK1/2 ont aussi été démontrés comme étant critiques à des processus métaboliques telles que la myogenèse et l’autophagie. Lors de nos études, nous avons identifié FOXK1 comme un nouveau substrat d’OGT. De plus, les niveaux d’O-GlcNAcylation de FOXK1 fluctuent lors de l’entrée/sortie du cycle cellulaire. En outre, nous avons identifié l’importance de FOXK1 dans l’adipogenèse et observé que l’interaction FOXK1/BAP1 est affectée par le métabolisme cellulaire. En résumé, nos études ont révélé l’importance d’OGT dans la régulation de certaines composantes du complexe BAP1, ce qui aidera à la compréhension de l’effet suppresseur de tumeur de BAP1 ainsi que son mécanisme d'action dans différents processus tel que le remodelage de la chromatine.

Biogenesis of the C. elegans germline syncytium: from nucleation to maturation

La vie commence par la fusion des gamètes pour générer un zygote, dans lequel les constituants à la fois de l'ovocyte et des spermatozoïdes sont partagés au sein d'un syncytium. Le syncytium consiste en des cellules ou tissus dans lesquels des cellules nucléées individuelles distinctes partagent un cytoplasme commun. Alors que l’avantage du syncytium durant la fécondation est tout à fait évident, les syncytia se produisent également dans de nombreux contextes de développement différents dans les plantes, les champignons et dans le règne animal, des insectes aux humains, pour des raisons qui ne sont pas immédiatement évidentes. Par exemple, la lignée germinale de nombreuses espèces de vertébrés et d'invertébrés, des insectes aux humains, présente une structure syncytiale, suggérant que les syncytia constituent des phases conservées de développement de la lignée germinale. Malgré la prévalence commune des syncytia, ces derniers ont cependant confondu les scientifiques depuis des décennies avec des questions telles que la façon dont ils sont formés et maintenus en concurrence avec leurs homologues diploïdes, et quels sont les avantages et les inconvénients qu'ils apportent. Cette thèse va décrire l'utilisation de la lignée germinale syncytiale de C. elegans afin d'approfondir notre compréhension de l'architecture, la fonction et le mode de formation des tissus syncytiaux. Les cellules germinales (CGs) dans la lignée germinale de C. elegans sont interconnectées les unes aux autres par l'intermédiaire de structures appelées des anneaux de CG. En utilisant l'imagerie des cellules vivantes, nous avons d'abord analysé l'architecture syncytiale de la lignée germinale au long du développement et démontré que la maturation de l'anneau de CG se produit progressivement au cours de la croissance des larves et que les anneaux de CG sont composés de myosine II, de l'anilline canonique ANI-1, et de la courte isoforme d’anilline ANI-2, qui n'a pas les domaines de liaison à l’actine et à la myosine, depuis le premier stade larvaire, L1. Parmi les composants de l'anneau de CG, ANI-2 est exprimé au cours du développement et exclusivement enrichi entre les deux CGs primordiales (CGPs) au cours de l'embryogenèse de C. elegans, indiquant qu’ANI-2 est un composant bona fide des anneaux de CG. Nous avons en outre montré que les anneaux de CG sont largement absents dans les animaux mutants pour ani-2, montrant que leur maintien repose sur l'activité d'ANI-2. Contrairement à cela, nous avons trouvé que la déplétion d’ANI-1 a augmenté à la fois le diamètre des anneaux de CG et la largeur du rachis. Fait intéressant, la déplétion d’ANI-1 dans les mutants d’ani-2 a sauvé les défauts d'anneaux de CG des gonades déficientes en ani-2, ce qui suggère que l'architecture syncytiale de la lignée germinale de C. elegans repose sur un équilibre de l'activité de ces deux protéines Anilline. En outre, nous avons montré que lors de leur entrée à l'âge adulte, les mutants ani-2 présentent de sévères défauts de multinucléation des CGs qui découlent de l'effondrement des membranes de séparation des CGs individuelles. Cette multinucléation a coïncidé avec le début de la diffusion cytoplasmique, dont le blocage réduit la multinucléation des gonades mutantes pour ani-2, suggérant que les anneaux de CG résistent au stress mécanique associé au processus de diffusion cytoplasmique. En accord avec cela, nous avons trouvé aussi que la gonade peut soutenir la déformation élastique en réponse au stress mécanique et que cette propriété repose sur la malléabilité des anneaux de CGs. Dans une étude séparée afin de comprendre le mécanisme de formation du syncytium, nous avons suivi la dynamique de division de la cellule précurseur de la lignée germinale, P4 en deux CGP dans l’embryon de C. elegans. Nous avons démontré que les CGPs commencent la cytocinèse de manière similaire aux cellules somatiques, en formant un sillon de clivage, qui migre correctement et transforme ainsi l'anneau contractile en anneau de « midbody ring » (MBR), une structure qui relie de manière transitoire les cellules en division. Malgré cela, les CGPs, contrairement à leurs homologues somatiques, ne parviennent pas à accomplir la dernière étape de la cytocinèse, qui est la libération abscission-dépendante du MBR. Au lieu de cela, le MBR persiste à la frontière entre les CGPs en division et subit une réorganisation et une maturation pour se transformer finalement en structures en forme d'anneau qui relient les cellules en division. Nous montrons en outre que les composants du MB/MBR; UNC-59Septin, CYK-7, ZEN-4Mklp1, RHO-1RhoA sont localisés à des anneaux de CG au long du développement de la lignée germinale du stade L1 à l'âge adulte, ce qui suggère que les anneaux de CG sont dérivés des MBR. Bien qu'il reste encore beaucoup à faire pour comprendre pleinement le mécanisme précis de la formation du syncytium, le maintien, ainsi que la fonction du syncytium, nos résultats appuient un modèle dans lequel la stabilisation du MBR et la cytocinèse incomplète pourraient être une option conservée dans l’évolution pour la formation du syncytium. En outre, notre travail démontre que les régulateurs de la contractilité peuvent jouer un rôle dans la maturation et l’élasticité de l'anneau de CG au cours du développement de la lignée germinale, fournissant un ajout précieux pour une plus ample compréhension de la syncytiogenèse et de sa fonction.

Caractérisation du rôle transcriptionnel et épigénétique de l’O-GlcNAcylation des histones et du facteur de transcription FOXK1

L’O-GlcNAcylation est une modification post-traductionnelle qui consiste en l’ajout covalent du N-acetylglucosamine au groupement hydroxyle des sérines et thréonines des protéines nucléaires et cytoplasmiques. Ce type de glycosylation atypique est régulé de manière très dynamique par l’action de l’O-GlcNAc transférase (OGT) et de l’O-GlcNAcase (OGA) qui catalysent et hydrolysent cette modification respectivement. Aujourd’hui, OGT émerge comme un régulateur transcriptionnel et senseur critique du métabolisme où les protéines ciblées par l’O-GlcNAcylation couvrent la presque totalité des voies de signalisation cellulaire. Récemment, des études ont aussi proposé qu’OGT soit impliquée dans la régulation épigénétique par l’O-GlcNAcylation des histones. Dans le but de caractériser le rôle fonctionnel d’OGT dans la régulation épigénétique, nous avons revisité le concept d’O-GlcNAcylation des histones et, de manière surprenante, n’avons pu confirmer cette observation. En fait, nos données indiquent que les outils disponibles pour détecter l’O-GlcNAcylation des histones génèrent des artéfacts. De ce fait, nos travaux supportent plutôt un modèle où la régulation épigénétique médiée par OGT se fait par l’O-GlcNAcylation de régulateurs transcriptionnels recrutés à la chromatine. Parmi ceux-ci, OGT s’associe au complexe suppresseur de tumeurs BAP1. En étudiant le rôle d’OGT dans ce complexe, nous avons identifié le facteur de transcription FOXK1 comme un nouveau substrat d’OGT et démontrons qu’il est régulé par O-GlcNAcylation durant la prolifération cellulaire. Enfin, nous démontrons que FOXK1 est aussi requis pour l’adipogenèse. Ensemble, nos travaux suggèrent un rôle important d’OGT dans la régulation du complexe BAP1.