Estudo do potencial antimutagênico, mutagênico, estrogênico e antibacteriano de flavonoides

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Determinação da atividade leishmanicida, antiproteolítica e antioxidante de Arrabidaea brachypoda

Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas - FCFAR

Análise molecular da proteína HC-Pro (Helper Component-Proteinase) e seu papel na relação patógeno-hospedeiro

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

Desenvolvimento e aplicação do ELISA indireto com proteína recombinante de nucleocapsídeo de coronavírus felino (FCoV) para quantificação de anticorpos em soros de gatos naturalmente infectados

Pós-graduação em Medicina Veterinária - FMVZ

Análise estrutural das proteínas da seda da teia da aranha Nephila clavipes por uma abordagem proteômica

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Composições e métodos para direcionar a expressão de genes usando o promotor do gene da família das peroxidades de plantas de café

A presente invenção compreende a descrição de uma nova seqUência regulatória provida para direcionar a expressão de uma seqUência de nucleotídeo, tal como genes estruturais, em raízes de plantas, incluindo monocotiledôneas e dicotiledôneas. Mais especificamente a invenção refere-se a seqUências regulatórias de polinucleotídeos isoladas de plantas de café que são capazes de iniciar e acionar a transcrição de polinucleotídeos, e ao uso destas seqUências regulatórias no direcionamento de transcrição de polinucleotídeos endógenos e/ou heterólogos para tecidos radiculares e produção de polipeptídeos. A invenção descreve ainda construções de DNA que contém o promotor de um gene que codifica uma proteína da família das peroxidases de plantas de café que está operacionalmente ligado a um gene heterólogo e/ou endógeno. Além disso, a invenção diz respeito ao uso destas construções na forma de vetores de expressão, vetores recombinantes e em plantas, células vegetais ou protoplastos transgênicos. A invenção ainda descreve um método utilizando tais construções contendo o promotor de um gene que codifica uma proteína da família das peroxidases de plantas de café para produção de plantas, células vegetais ou protoplastos transgênicos.

Interação da proteina e2 do vírus da hepatite c com o receptor de ldl e cd81 presentes em células endoteliais e ativação da resposta inflamatória

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Expressão de SmNPP5a de Schistosoma mansoni em Pichia pastoris

A esquistossomose é causada pelo Schistosoma mansoni e é considerada uma importante doença parasitária que afeta mais de 200 milhões de pessoas em países em desenvolvimento. Estima-se ainda que aproximadamente 600 milhões de pessoas vivam em áreas de risco e que o número de mortes por ano devido a esta parasitose chegue a 200.000. O tratamento existente hoje é eficiente, mas não previne contra re-infecção e contra as formas jovens dos parasitas. O desenvolvimento de uma vacina utilizando antígenos do parasita produzidos de modo recombinantes é o anseio para o controle da esquistossomose. A fosfodiesterase-5 (SmNPP-5a) é uma enzima presente na interface parasita-hospedeiro e acessível ao sistema imune, sendo portanto considerada um potencial candidato vacinal, sua avaliação se faz necessária. A obtenção de uma SmNPP-5a recombinante enzimaticamente ativa é um passo fundamental no processo de avaliação da sua capacidade protetora e determinação da sua função fisiológica para o parasita. Utilizando o sistema de expressão baseados em leveduras metilotróficas, Pichia pastoris, a proteína recombinante pode ser expressa com as modificações pós traducionais necessárias para ter sua estrutura original mantida, característica fundamental para se obter uma proteína enzimáticamente ativa. Para clonagem e expressão da proteína recombinante utilizamos o vetor pPICZαA, pois este possui um sistema de expressão baseado no promotor álcool oxidase (AOX1 e AOX2). Ele possui ainda, a capacidade de adicionar um peptídeo sinal e uma cauda de histidina, com objetivo de secretar a proteína expressa e facilitar sua purificação, respectivamente. A triagem e confirmação dos clones positivos foram feitas por PCR. A análise das amostras de sobrenadantes coletadas com 24, 48 e 72h de estímulo com metanol foi feita por SDS-PAGE e Western blot para verificação da expressão... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)

Geração e análise da imunogenicidade de plasmídeos contendo epítopos CD8 sub-dominantes expressos em Trypanosoma cruzi

Durante a infecção experimental por Trypanosoma cruzi, a resposta imune adaptativa mediada por células CD8+ é direcionada a poucos epítopos imunodominantes e subdominantes. Em estudos anteriores, foi demonstrado que, em diferentes linhagens de camundongos, a imunização com plasmídeos ou proteínas recombinantes, que expressam epítopos CD8 imunodominantes, antecipa a resposta imune após o desafio e proporciona resposta imune protetora contra infecções letais com T.cruzi. Em nosso estudo atual, desenvolvemos a hipótese que também é possível gerar resposta imune protetora a partir de imunizações com plasmídeos que expressam epítopos subdominantes. Neste caso, esta resposta poderia se somar a resposta imune dominante ampliando o espectro da resposta imuno-protetora. Para testar nossa hipótese, nós tivemos que construir diferentes plasmídeos contendo a ORF do gene da proteína 2 de superfície de amastigota (asp-2) de T.cruzi contendo mutações que: i) retiraram os epítopos imunodominantes CD8 (VNHRFTLV para H-2Kb ou TEWETGQI para H-2Kk) ;ii) trocaram o epítopo imunodominante por epítopos sub-dominantes (TsKb-18 ANYDFTLV ou TsKb-20 ANYKFTLV). Além disso, também foi construído um plasmídeo contendo somente a porção P4-P7 (261° a 500° aminoácidos) da asp-2. Após a construção destes plasmídeos, testamos a imunogencidade de dois deles, denominados pRE-P4P7 e o pIgSP-VNHRATLA, foram testados individualmente na vacinação de camundongos F1(C57BL/6 x B10.A) (H-2Kb e H- 2Kk) ou de CB10 (H-2Kb), respectivamente, e desafiados com tripomastigotas da cepa Y de T.cruzi. A vacinação de camundongos F1 (C57BL/6 x B10.A) com o plasmídeo pré- P4-P7 aumentou significativamente a resposta imune de células CD8+ específicas ao epítopo sub-dominante TEWETGQI, restrito ao MHC H-2kk, porém não diminuiu a resposta ...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)

Avaliação do metabolismo oxidativo em cepas de Trypanosoma cruzi naturalmente resistentes ao benzonidazol

O agente etiológico da doença de Chagas, Trypanosoma cruzi, é responsável pela infecção de milhões de pessoas na América Latina. No momento há apenas dois fármacos disponíveis, o nifurtimox (5-nitrofurano), teve o uso descontinuado no Brasil, e o benzonidazol (2-nitroimidazole), embora ambos possuam ações limitadas, visto que dependem da fase da doença, das condições fisiológicas do hospedeiro, da suscetibilidade e variabilidade genética da cepa. Assim, a busca de novas moléculas torna-se urgente e necessária, bem como a compreensão do mecanismo de resistência aos fármacos tripanocidas. Alguns estudos relatam aumento na produção de enzimas que atuam na defesa celular, as quais, provavelmente, poderiam ser responsáveis pela resistência de certas cepas do parasita. Tais enzimas têm funções importantes na sobrevivência e crescimento dos parasitas: superóxido dismutase (SOD), uma metaloenzima que elimina radicais superóxido ao convertê-los em peróxido de hidrogênio e oxigênio molecular; old yellow enzyme (OYE), que é uma NADPH flavina oxidoredutase e pode estar envolvida na redução de substâncias tripanocidas; e, peroxiredoxina (Prx), que catalisa a redução de peróxidos. O objetivo deste projeto é avaliar a suscetibilidade de diferentes cepas ao benzonidazol, clonar, sequenciar e expressar enzimas possivelmente envolvidas na resistência a este fármaco e realizar análises morfológicas serão nos parasitos após serem expostos à substância em questão. Futuramente os anticorpos policlonais obtidos a partir das proteínas recombinantes de Prx, SOD e OYE serão empregados para avaliar o nível de expressão das mesmas em parasitas tratados e não tratados com o benzonidazol.

Direcionamento de peptídeos tolerogênicos da proteína de choque térmico 60 para células dendríticas utilizando anticorpos anti-DEC-205

A indução de tolerância imunológica em situações altamente desejadas como no transplante e em doenças autoimunes permanece um grande desafio para pesquisa científica de tradução. Nesse contexto, o estudo das proteínas do choque térmico (HSPs) e seus peptídeos vêm trazendo informações relevantes sobre o controle da reposta imune. Dados da literatura mostram que alguns de seus peptídeos apresentam propriedades imunorreguladoras, como os peptídeos N3 e N7 da HSP60. Além disso, tem se mostrado que a apresentação de antígenos em contextos específicos por células dendríticas (DCs) pode favorecer o estabelecimento da tolerância imunológica. Dessa forma, o direcionamento dos peptídeos tolerogênicos da HSP60, N3 e N7, in vivo, para DCs, com o intuito de essas células apresentarem esses peptídeos em um contexto imunorregulador, pode induzir um estado de tolerância. Assim, nesse trabalho, tivemos como objetivo a produção de anticorpos (Acs) contra o receptor DEC-205 de DCs conjugados com os peptídeos N3 e N7 da HSP60. Esses Acs, ao se ligarem ao DEC-205 nas DCs, podem ser fagocitados, processados e por fim apresentados a células T em um contexto imunorregulador. Para tal, foram realizadas transfecções de células HEK-293T e CHO com plasmídeos codificando as cadeias leve e pesada dos respectivos Acs a fim de se obter essas proteínas recombinantes. Podemos observar que as células HEK apresentaram uma produção mais eficiente dos Acs quando comparadas com as células CHO (120 vs 30 ng/ml, respectivamente), apesar disso a produção dos Acs ficou abaixo do esperado impossibilitando a realização ensaios in vivo. Além disso, realizamos um ensaio de ligação do Ac anti-DEC-N7 a superfície de DCs e observamos que os Acs produzidos apresentam capacidade de se ligarem a superfície dessas células. Concluímos que os anticorpos recombinantes anti-DEC-205 são capazes... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)

Clonagem, expressão e purificação de três mutantes truncados da proteína LaRPA-1 de Leishmania amazonensis

A leishmaniose é uma doença que atinge milhões de pessoas no mundo e, de acordo com a FUNASA, está se espalhando por todas as regiões do Brasil. O tratamento desta zoonose é ineficaz, pois os fármacos utilizados apresentam muitos efeitos colaterais e colaboram com o aparecimento de parasitas e vetores resistentes. Portanto um maior conhecimento sobre a biologia molecular destes protozoários poderá facilitar o descobrimento de novas terapias e desenvolvimento de drogas antiparasitárias. O complexo telomérico é formado pela interação de DNA com proteínas, sendo que estas últimas podem também interagir entre si. A proteína RPA de eucariotos compreende um complexo trimérico subdividido em três subunidades. Este cumpre independentemente ou juntamente com outras proteínas diversas funções vitais para a célula, entre elas, auxiliar na manutenção dos telômeros e ajudar a recrutar a telomerase. Além disso, ela parece ser um dos principais componentes do complexo de proteínas que interagem com o terminal simples fita telomérico de protozoários tripanosomatídeos. Curiosamente, em Leishmania spp., as subunidades 2 e 3, ao contrário da subunidade 1 da RPA, não fazem parte do complexo telomérico. Portanto a LaRPA-1 pode apresentar comportamentos peculiares quando comparada a RPA dos outros eucariotos, e se tornar um importante alvo ao se estudar a biologia molecular do parasita. Este trabalho tem como objetivo clonar, expressar e purificar os três diferentes mutantes truncados da proteína LaRPA-1 para, futuramente, utilizar-se estas proteínas recombinantes como ligantes em ensaios de interação proteína:proteína, visando mapear possíveis sítios ou domínios na proteína LaRPA-1.O gene que codifica LaRPA-1 já encontrava-se clonado e sequenciado no laboratório de Telômeros da UNESP de Botucatu....(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)

Proposição de uma nova vacina para Brucelose bovina usando uma abordagem biotecnológica

A utilização de novas tecnologias empregando a biologia molecular busca superar os principais problemas encontrados nas vacinas atualmente comercializadas no combate à brucelose bovina. Desta forma, a identificação de proteínas imunogênicas e a posterior transformação dos genes correspondentes em micro-organismos competentes tem sido um dos principais alvos para o desenvolvimento de novas formas de controle da infecção. O presente trabalho tem como objetivo propor, em base teórica, uma vacina de eficácia e segurança superiores às encontradas atualmente no mercado contra a brucelose bovina, antropozoonose contagiosa provocada principalmente pela espécie Brucella abortus. Essa enfermidade produz infecção característica em bovinos e bubalinos e é infecciosa ao homem, causando doença crônica que leva à incapacidade parcial ou total para o trabalho. Por ter distribuição universal, acarreta problemas sanitário e de saúde pública importantes e grandes prejuízos econômicos. A vacina proposta visa o desenvolvimento de microorganismos transformados contendo genes de proteínas de potencial imunológico que, após purificação, são usadas para o combate da doença. As proteínas recombinantes abordadas no presente estudo são as proteína ribossomal L7/L12 e a lumazina sintetase que, ao serem utilizadas em uma vacina subcelular, diferente das comercializadas atualmente, induzem resposta de longa duração, não induzem a produção de anticorpos que interfiram no diagnóstico e não são patogênicas ao homem.

Clonagem de sequências codificantes de citocinas felinas para construção de curva padrão para PCR em tempo real

A quantificação de citocinas felinas possibilita uma avaliação do sistema imune do animal em diferentes doenças, permite também a identificação de diferentes fatores que alteram sua secreção, e colabora na compreensão da patogênese das enfermidades. Em humanos e camundongos essa mensuração é feita principalmente pelo método de ELISA, mas para os felinos há uma menor disponibilidade de kits específicos para determinadas citocinas, e estes possuem um custo elevado. Assim, uma alternativa é utilizar a reação de PCR em tempo real com transcrição reversa (RT-qPCR) para quantificação absoluta dos RNAs mensageiros das citocinas felinas, uma técnica bastante sensível e específica para analisar a expressão desses genes. Com esse intuito, esse trabalho teve como objetivo clonar as sequências gênicas codificantes de citocinas, para construir uma curva padrão para a qPCR. Assim, foi feita extração de RNA de amostras de sangue total de gatos domésticos, e estes foram tratados com DNAse para evitar contaminação por DNA genômico. O cDNA foi sintetizado, e amplificado com os primers específicos para cada fragmento codificante de citocina e o GAPDH felino. Cada amplicon purificado foi inserido em um plasmídeo comercial, e introduzido em bactérias E. coli cepa DH5. Os clones recombinantes foram sequenciados para confirmar a inserção do fragmento no vetor. As curvas padrão da qPCR foram construídas com cada plasmídeo recombinante numa de 106 a 101 cópias por reação. O sequenciamento mostrou que todos os clones eram semelhantes àqueles encontrados no GenBank. A eficiência das amplificações, baseado no slope das curvas padrão foram: 101,3% para GAPDH, 99,1% para IL-1, 83,2% para IL-6, 94,4% para IL-10, 105,5% para IL-12, 83,4% para IFN- e 83,8% para TNF-. O valor de r2 foi de 0,99 em todas as reações. Dessa forma, com a clonagem dos fragmentos... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)

Leishmaniose Visceral canina: Clonagem e expressão das proteínas Lc24 e Lc36 de L. chagasi com potencial aplicação no diagnóstico e desenvolvimento de vacina

Pós-graduação em Biociências e Biotecnologia Aplicadas à Farmácia - FCFAR