Towards in situ Single Cell Systems Biology

Systems-level studies of biological systems rely on observations taken at a resolution lower than the essential unit of biology, the cell. Recent technical advances in DNA sequencing have enabled measurements of the transcriptomes in single cells excised from their environment, but it remains a daunting technical problem to reconstruct in situ gene expression patterns from sequencing data. In this thesis I develop methods for the routine, quantitative in situ measurement of gene expression using fluorescence microscopy.

The number of molecular species that can be measured simultaneously by fluorescence microscopy is limited by the pallet of spectrally distinct fluorophores. Thus, fluorescence microscopy is traditionally limited to the simultaneous measurement of only five labeled biomolecules at a time. The two methods described in this thesis, super-resolution barcoding and temporal barcoding, represent strategies for overcoming this limitation to monitor expression of many genes in a single cell. Super-resolution barcoding employs optical super-resolution microscopy (SRM) and combinatorial labeling via-smFISH (single molecule fluorescence in situ hybridization) to uniquely label individual mRNA species with distinct barcodes resolvable at nanometer resolution. This method dramatically increases the optical space in a cell, allowing a large numbers of barcodes to be visualized simultaneously. As a proof of principle this technology was used to study the S. cerevisiae calcium stress response. The second method, sequential barcoding, reads out a temporal barcode through multiple rounds of oligonucleotide hybridization to the same mRNA. The multiplexing capacity of sequential barcoding increases exponentially with the number of rounds of hybridization, allowing over a hundred genes to be profiled in only a few rounds of hybridization.

The utility of sequential barcoding was further demonstrated by adapting this method to study gene expression in mammalian tissues. Mammalian tissues suffer both from a large amount of auto-fluorescence and light scattering, making detection of smFISH probes on mRNA difficult. An amplified single molecule detection technology, smHCR (single molecule hairpin chain reaction), was developed to allow for the quantification of mRNA in tissue. This technology is demonstrated in combination with light sheet microscopy and background reducing tissue clearing technology, enabling whole-organ sequential barcoding to monitor in situ gene expression directly in intact mammalian tissue.

The methods presented in this thesis, specifically sequential barcoding and smHCR, enable multiplexed transcriptional observations in any tissue of interest. These technologies will serve as a general platform for future transcriptomic studies of complex tissues.

Multi-channel 2-D pattern transfer model based on imaging optics for submarine laser uplink communication

An optical communication scheme of 2-D pattern transfer based on imaging optics for submarine laser uplink communication (SLUC) is suggested. Unlike the methods aiming at avoiding neighboring crosstalk used in traditional multi-channel optical beam transferring, we make full use of the overlapping of each spreading beam other than controlling divergence effect of each beam to avoid interference noise. The apparent parameters have been introduced to simplify theoretical analysis of optical pattern transfer problem involving underwater condition, with the help of which the complex beam propagation inside two kinds of mediums can be easily reduced to brief beam transfer only inside air medium. In this paper, optical transmission path and receiver terminal optics geometry have been described in detail. The link range equation and system uplink performance analysis have also been given. At last, results of a proof-of-concept experiment indicate good feasibility of the proposed SLUC model. © 2007 Elsevier GmbH. All rights reserved.

On the uniqueness of singular solutions to boundary-initial value problems in linear elastodynamics

This investigation deals with certain generalizations of the classical uniqueness theorem for the second boundary-initial value problem in the linearized dynamical theory of not necessarily homogeneous nor isotropic elastic solids. First, the regularity assumptions underlying the foregoing theorem are relaxed by admitting stress fields with suitably restricted finite jump discontinuities. Such singularities are familiar from known solutions to dynamical elasticity problems involving discontinuous surface tractions or non-matching boundary and initial conditions. The proof of the appropriate uniqueness theorem given here rests on a generalization of the usual energy identity to the class of singular elastodynamic fields under consideration.

Following this extension of the conventional uniqueness theorem, we turn to a further relaxation of the customary smoothness hypotheses and allow the displacement field to be differentiable merely in a generalized sense, thereby admitting stress fields with square-integrable unbounded local singularities, such as those encountered in the presence of focusing of elastic waves. A statement of the traction problem applicable in these pathological circumstances necessitates the introduction of "weak solutions'' to the field equations that are accompanied by correspondingly weakened boundary and initial conditions. A uniqueness theorem pertaining to this weak formulation is then proved through an adaptation of an argument used by O. Ladyzhenskaya in connection with the first boundary-initial value problem for a second-order hyperbolic equation in a single dependent variable. Moreover, the second uniqueness theorem thus obtained contains, as a special case, a slight modification of the previously established uniqueness theorem covering solutions that exhibit only finite stress-discontinuities.

Revisão sistemática sobre os estudos de prevalência de infecção do colo do útero pelo papilomavírus humano (HPV) no Brasil

O câncer do colo do útero é responsável por 7% do total dos óbitos por câncer entre a população feminina brasileira e tem uma incidência estimada de 20/100 mil para todo o país. Evidências científicas comprovam que o papilomavírus humano (HPV) é causa necessária para a ocorrência deste tipo de câncer. Ações de prevenção e controle recomendadas têm se baseado no conhecimento sobre a epidemiologia da doença. Os estudos realizados no Brasil sobre a prevalência da infecção por HPV disponíveis na literatura têm características variadas que ainda não foram analisadas em conjunto e de modo sistematizado. O objetivo deste estudo foi realizar uma revisão sistemática dos artigos sobre prevalência do HPV em mulheres brasileiras considerando as prevalências globais e entre aquelas com exame citológico cervical normal. Foram selecionados todos os artigos após busca nas bases de dados Medline e BVS, tomando-se como termos human papillomavirus, HPV, prevalence Brazil. Entre 1989 e 2008, foram selecionados 155 artigos, sendo 133 nas bases de dados e 22 referências secundárias. Após leitura de título e resumo, 82 artigos foram incluídos, e a seguir submetidos à leitura integral dos textos, sendo enfim selecionados 14 artigos, os quais representaram estudos de quatro grandes regiões brasileiras (Sudeste 43,0%, Sul 21,4%, Nordeste 21,4% e Norte 7,1%). Em sua maioria (64,5%), trata-se de artigos que relatam desenho transversal. Com referência ao método de identificação do HPV nas mulheres, em oito (57,1%) artigos, há relato do emprego de PCR para tipagem do HPV e, em sete (50,0%) artigos, houve emprego de HC para detecção do HPV. As amostras variaram de 49 a 2329 mulheres. A prevalência global de infecção do colo do útero pelo HPV variou entre 13,7 e 54,3%, e para as mulheres com citologia normal, a prevalência de infecção pelo HPV no colo do útero varia entre 10 e 24,5%. Os resultados obtidos permitiram criar um panorama das prevalências e da distribuição da infecção pelo HPV e principais tipos em mulheres com citologia cervical normal e assim contribuir para a compreensão da distribuição da infecção pelo HPV no país, auxiliando na orientação de outros estudos bem como de políticas voltadas para a saúde da mulher e prevenção do câncer do colo do útero.

Infiltração microbiana por Enterococcus faecalis em canais retrobturados com MTA, iRoot SP e Endo CPM Sealer

O objetivo deste trabalho consistiu na análise da infiltração apical em dentes retrobturados por três materiais: MTA, iROOT SP e Endo CPM Sealer. Para tal, foram utilizados 51 dentes humanos extraídos, incisivos centrais superiores, que foram instrumentados manualmente com limas tipo K, pela técnica Crown-down, obturados com compactação lateral e, após serem apicectomizados a 3mm aquém do ápice foram submetidos à retrobturação, com os três materiais propostos. As amostras foram divididas, randomicamente, em três grupos: GI MTA, GII iROOT SP e GIII Endo CPM Sealer, cada grupo com 15 amostras. Os dentes foram inseridos em tubos de eppendorfs, e feitos a impermeabilização do remanescente radicular utilizando duas camadas de cianocrilato, epóxi, e outra camada de esmalte. Em cada eppendorf foi adicionado caldo TSB estéril e uma suspensão de Enterococcos faecalis e adaptado ao frasco de vidro com meio de cultura enterococcosel. A infiltração bacteriana foi verificada pela turvação do meio de cultura. Após a análise no período de 60 dias, podemos concluir que durante esse tempo ocorreram infiltrações no Grupo I, 43,75 % das amostras apresentaram turvamento do meio de cultura demonstrando persistência da infecção. Já no Grupo II, 31,25 % das amostras tiveram crescimento bacteriano. Por fim no Grupo III, 25,00 % houve a infiltração. Grupos controle positivo e negativo para crescimento bacteriano foram realizados (n=3, cada). Os cimentos testados comportaram-se de maneira semelhante frente à infiltração bacteriana durante o período testado.

A prova do dolo

O trabalho tem como objetivo perscrutar os métodos de prova do dolo, no direito penal, a fim de avaliar se esses métodos são eficientes, de modo a determinar se é possível, enfim, a prova do dolo; investiga-se, ainda, se é necessária ou possível a mudança do próprio conceito de dolo. Na primeira parte, é apresentada a conceituação de dolo, com base nos principais autores do direito penal, com o intuito de delimitar o objeto central do estudo. Para tanto, as diversas controvérsias conceituais são analisadas em concordância com o sistema em que se inserem: escola clássica; causalismo; finalismo; funcionalismo. As demais divergências estão agrupadas em dois grandes blocos as teorias intelectivas e as teorias volitivas em conformidade com o enfoque que é dado pelos autores que defendem esta ou aquela conceituação do dolo. No cerne do trabalho, apresenta-se o método psicanalítico de aferição da consciência e da vontade humanas, para, então, realizar-se o estudo dos métodos de prova adotados no direito penal, sempre cotejado com a análise psicanalítica pertinente, a fim de proporcionar ao leitor uma visão multidisciplinar dos fenômenos subjetivos da mente. Constatar-se-á a insuficiência dos métodos de prova do dolo, no direito penal. Na terceira parte, é feito um estudo da jurisprudência brasileira, no que tange à forma como os tribunais costumam provar o dolo, com o intuito de avaliar se o discurso doutrinário da prova do dolo coaduna-se com a prática judicial. Conclui-se que há, de fato, um descompasso entre o que a doutrina entende como método viável e aquilo que, na prática, é adotado pelos tribunais.

Criminalização secundária e justiça penal hegemônica: aspectos criminológicos no caso do Massacre de Eldorado de Carajás

A presente tese faz um estudo sobre a criminalização secundária e a justiça penal hegemônica a partir da análise criminológica do caso de Eldorado de Carajás. A metodologia usada é a pesquisa bibliográfica agregada à pesquisa documental. Nestas, extraiu-se o discurso das criminalizações e sua função subterrânea no Estado Policial. A metodologia empreendida na realização deste trabalho parte da perspectiva do materialismo histórico. Os processos criminalizantes secundários subterrâneos não se exaurem em um momento efêmero, mas são a continuidade histórica de uma tragédia, de uma mesma matriz massacrante, seguindo a lógica da luta de classes. Essa continuação se dá pelas violências institucionais e estruturais com matriz nos conflitos agrários antecedentes e que detêm raízes legitimantes de massacres nos discursos criminológicos que vão do pré-positivismo ao criticismo contemporâneo. A comprovação da tese ocorre pela análise da ação penal que ficou mundialmente conhecida como O Caso do Massacre de Eldorado dos Carajás. O ponto de partida é a verificação concreta do respectivo caso, avançando para uma concepção abstrata da criminalização secundária subterrânea. O papel de pulsão vingativa do Estado contra a miséria e a adesão subjetiva à barbárie pela Justiça Penal deixam claros seu caráter hegemônico e a existência de uma criminalização vitimológica (secundária e subterrânea) em razão da distribuição desigual dos bens positivos e negativos aos condenados da terra.

Novos rumos da prova pericial

A autora parte da premissa de que a prova pericial dá ensejo a equívocos e, por isso, sua produção deve ser rigorosamente controlada. A partir do enfoque histórico, a autora demonstra como a separação de questões de fato e de direito serve de instrumento ao controle judicial da prova pericial, que deve ser promovido desde a fase da admissibilidade a da valoração, sempre levando em consideração o debate real entre as partes. A autora dedicou grande parte da pesquisa ao estudo do direito probatório da common law, aos precedentes Frye, Daubert, Joiner e Kumho, bem como a outros casos marcantes, para fundamentar seu entendimento de que é tão importante o exame da admissibilidade da prova, como da sua valoração. O controle em todas as etapas da prova pericial, possível de lege lata no Brasil, visa à obtenção de prova idônea, sem a qual não é possível chegar a um resultado legítimo amparado em dados racionais.

Fluidic flow delay by ionogel passive pumps in microfluidicpaper-based analytical devices

[EN] A new concept for fluid flow manipulation in microfluidic paper-based analytical devices ( µPADs) is presented by introducing ionogel materials as passive pumps. µPADs were fabricated using a new doubleside contact stamping process and ionogels were precisely photopolymerised at the inlet of the µPADs.The ionogels remain mainly on the surface of the paper and get absorbed in the superficial paper-fibers allowing for the liquid to flow from the ionogel into the paper easily. As a proof of concept the fluid flow and mixing behaviour of two different ionogels µPADs were compared with the non-treated µPADs.It was demonstrated that both ionogels highly affect the fluid flow by delaying the flow due to their different physical and chemical properties and water holding capacities.

Pondo as palavras a caminho: o conto afim de Pessoa e Rosa

O presente trabalho visa estabelecer uma reflexão sobre o conto e mais propriamente sobre a linguagem como aquilo que propicia e concede ao homem a sua essência. Para isto, tem como proposta estabelecer uma leitura do livro Grande sertão: veredas, de Guimarães Rosa, à luz de alguns versos de Fernando Pessoa, especialmente um verso do heterônimo Ricardo Reis: somos contos contando contos, nada. Nesta esteira, o presente estudo procura estebelecer afinidades eletivas entre os textos pela via do tema proposto. Neste sentido, considera-se que Fernando Pessoa fez da sua vida uma grande obra literária, sendo ele próprio um conto a contar contos, sendo a experiência heteronímica a evidência do poder de criação da língua vivenciado pelo escritor. Considera-se também que a obra Grande sertão: veredas de Guimarães Rosa pode ser lida como um grande conto, tendo por base uma declaração feita pelo próprio autor em entrevista. Desta forma, o presente trabalho procura desenvolver o gesto de contar como a forma como o homem torna o mundo habitável, abordável, e também como a prova de sua própria existência, sendo o gesto de colocar as palavras a caminho a forma de realizar a travessia da vida através das palavras

Proteomic Analysis of the Ubiquitin Landscape in the Drosophila Embryonic Nervous System and the Adult Photoreceptor Cells

Background Ubiquitination is known to regulate physiological neuronal functions as well as to be involved in a number of neuronal diseases. Several ubiquitin proteomic approaches have been developed during the last decade but, as they have been mostly applied to non-neuronal cell culture, very little is yet known about neuronal ubiquitination pathways in vivo. Methodology/Principal Findings Using an in vivo biotinylation strategy we have isolated and identified the ubiquitinated proteome in neurons both for the developing embryonic brain and for the adult eye of Drosophila melanogaster. Bioinformatic comparison of both datasets indicates a significant difference on the ubiquitin substrates, which logically correlates with the processes that are most active at each of the developmental stages. Detection within the isolated material of two ubiquitin E3 ligases, Parkin and Ube3a, indicates their ubiquitinating activity on the studied tissues. Further identification of the proteins that do accumulate upon interference with the proteasomal degradative pathway provides an indication of the proteins that are targeted for clearance in neurons. Last, we report the proof-of-principle validation of two lysine residues required for nSyb ubiquitination. Conclusions/Significance These data cast light on the differential and common ubiquitination pathways between the embryonic and adult neurons, and hence will contribute to the understanding of the mechanisms by which neuronal function is regulated. The in vivo biotinylation methodology described here complements other approaches for ubiquitome study and offers unique advantages, and is poised to provide further insight into disease mechanisms related to the ubiquitin proteasome system.

Considerações sobre o planejamento regional no Rio de Janeiro: uma análise do Consórcio Intermunicipal do Leste Fluminense (CONLESTE)

Este trabalho apresenta e analisa o Consórcio Intermunicipal do Leste Fluminense (CONLESTE), criado em 2006 e composto por dezesseis municípios do estado do Rio de Janeiro, com o objetivo de buscar soluções para os impactos do Complexo Petroquímico da Petrobras (Comperj). Discute a crise do planejamento regional e a ausência de arranjos de gestão do território que atendam às especificidades do pacto federativo brasileiro. Apresenta os consórcios intermunicipais como alternativa utilizada por muitas cidades brasileiras ao modelo obsoleto das Regiões Metropolitanas, sem, contudo, se deter na comprovação da eficiência dos mesmos. Através de uma revisão bibliográfica de autores clássicos e contemporâneos, aborda o controverso conceito de região, como método para compreender a função regional exercida pelo consórcio. Debate a importância das escalas intermediárias em meio à falsa polarização global-local. Reforça a ideia da necessidade de articulação entre as distintas esferas de governo como forma de minimizar os transtornos provocados pelo caos urbano em que vive a população da área do CONLESTE.

Orientação pedagógica em Duque de Caxias: repensando práticas para trilhar novos caminhos

Este trabalho apresenta os resultados de uma investigação que buscou conhecer o trabalho do orientador pedagógico (OP) na rede do município de Duque de Caxias, Rio de Janeiro. Especificamente, buscou-se responder as seguintes questões de pesquisa: (a) Quais os dispositivos legais que conformam a profissão do OP no município de Duque de Caxias?, (b) que atribuições são demandadas pela escola a este profissional? e (c) como o OP percebe o trabalho por ele desempenhado na escola? Para a realização da pesquisa, partimos de uma retrospectiva histórica da função deste profissional, por meio da análise de documentos legais (leis, decretos, pareceres e diretrizes), identificando marcos da constituição desta profissão. A pesquisa também fez uso de entrevistas a uma amostra de orientadores que atuam na rede escolar desse município, escolhidos de forma aleatória. As entrevistas foram analisadas segundo orientações de Bardin e visaram à identificação do modo como este profissional concebe a sua atuação no âmbito da orientação pedagógica na escola. Por meio de análise estatística aos dados dos diretores da Prova Brasil 2009, a pesquisa buscou ainda identificar, em uma perspectiva panorâmica, como a direção da escola percebe o trabalho do orientador pedagógico. A análise aos documentos evidenciou mudanças significativas na concepção e atuação do orientador pedagógico, ampliando sua atuação às questões da gestão escolar. As análises estatísticas evidenciaram que a maioria das escolas públicas brasileiras conta com o apoio de um orientador pedagógico e que o diretor escolar considera fundamental contar com tal profissional na unidade. As entrevistas evidenciaram que os orientadores pedagógicos se enxergam como um elemento de potencialidade nas escolas e colocam em destaque a necessidade de uma formação profissional que dê conta tanto dos aspectos políticos envolvidos na gestão educacional, como dos aspectos pedagógicos demandados pela escola

Estimulando a consciência fonológica em jovens com deficiência intelectual

O desenvolvimento da consciência fonológica vem ganhando muito destaque quando se discute o processo de aquisição da leitura e da escrita de jovens com dificuldades de aprendizagem. Distinguir os sons das palavras, compreender e manipular as sílabas parece afetar a capacidade para ler e escrever qualquer palavra. O presente estudo tem como objetivos verificar os efeitos de um programa de ensino para favorecer o desenvolvimento da consciência fonológica. Esse programa de ensino foi elaborado com base em estudos e nas atividades realizadas por Capovilla e Capovilla (2000), Valério (1998), Moussatché (2002), Nunes (2009), dentre outros. A pesquisa está composta por dois estudos: estudo piloto e esstudo 1. O estudo piloto, iniciado em 2012 ? foi formado por dois jovens com deficiência intelectual que frequentavam uma escola regular e apresentavam dificuldade na leitura e escrita. Um estava no início e o outro já havia passado pelo processo de alfabetização. O estudo 1 iniciado em 2013, foi formado por quatro jovens com deficiência intelectual que estavam no processo de alfabetização e frequentavam uma escola especial. A pesquisa foi realizada nas escolas onde esses alunos estavam matriculados. A análise dos testes de Prova de Consciência Fonológica proposta por Capovilla e Capovilla (2000) o pré-teste - mostrou que os sujeitos do estudo piloto apresentavam na primeira testagem bom rendimento em tarefas como aliteração e rima, mas demonstraram dificuldade na parte de segmentação, síntese e manipulação fonêmica.Com a segunda testagem, o pós-teste - realizada após a implementação de um programa para favorecer o desenvolvimento de habilidades de consciência fonológica pode-se observar uma melhora no desempenho dessas habilidades. No estudo 1, o pré-teste mostrou que os alunos apresentavam dificuldades nas atividades que envolviam as habilidades de adição, subtração e transposição fonêmica e um melhor desempenho em atividades de rima e aliteração. Na prova de leitura oral de palavras e pseudopalavras, observou-se maior dificuldade na leitura das pseudopalavras. No pós-teste, aplicado após o período de intervenção com o programa supracitado, observou-se que nas questões de rima, adição e subtração silábica, adição e subtração fonêmica e transposição silábica, os sujeitos apresentaram aumento na porcentagem de acerto das atividades. Nas atividades de aliteração, transposição fonêmica e trocadilho os sujeitos mantiveram os mesmos resultados do pré-teste ou apresentaram queda na porcentagem de acertos. Nas provas de leitura de palavras e pseudopalavras os sujeitos não demonstraram aumento na porcentagem de leitura correta, com exceção apenas de Ana Clara, que apresentou pequeno aumento no seu resultado. Na parte de compreensão de leitura, os participantes apresentaram pequena alteração no resultado, mas não temos como associar essa melhora ao desempenho nas provas de consciência fonológica. Na avaliação de ditado de palavras e pseudopalavras os alunos demonstraram aumento nos resultados

O Deus de Espinosa: substância una ou múltipla? Um estudo sobre a possibilidade do monismo

Esta pesquisa terá como objetivo compreender a tese do monismo, isto é, a tese de que existe uma única substância cuja unidade é garantida pela compatibilidade entre sua natureza absolutamente infinita e a multiplicidade real dos seus infinitos atributos. Mas o monismo não é aceito por todos os intérpretes como não problemático, o que, se comprovado, levaria o sistema de Espinosa à ruína. No primeiro capítulo, através da crítica de um destes intérpretes, Ferdinand Alquié, será colocado o problema do monismo. De acordo com este intérprete, Espinosa não consegue estabelecer racionalmente a possibilidade da substância absoluta. Veremos que, não conseguindo conceber como os infinitos atributos podem constituir a essência de uma substância que seja única, Alquié conclui que a tese do monismo é incompatível com a estrutura argumentativa do primeiro livro da Ética. Após a exposição do problema do monismo apresentado a partir de Alquié, será realizada uma tentativa de resgatar a coerência interna da obra de Espinosa. Este estudo visará explicitar os conceitos de substância e atributo, procurando acompanhar as duas etapas da construção do monismo ao longo das onze primeiras proposições da Ética, a saber: (1) a prova de que há uma única substância por atributo; (2) a prova de que há uma única substância para todos os atributos. Para avançar na compreensão dos problemas ontológicos envolvidos na construção do monismo, e de como a posição de Espinosa só pode ser compreendida a partir de uma transformação profunda dos conceitos herdados do cartesianismo, a pesquisa privilegiará as interpretações magistrais propostas por Martial Gueroult (Spinoza, I, Dieu; Aubier-Montaigne, Paris, 1968) e Gilles Deleuze (Spinoza et le problème de l'expression; Les Editions de Minuit, Paris, 1968). Estes intérpretes realizam cada um ao seu modo uma genealogia da substância absolutamente infinita e apresentam soluções que permitem pensar a tese do monismo como coerente. Estas soluções serão apresentadas e avaliadas para que se saiba em que medida elas conseguem expor o problema do monismo e solucioná-lo de maneira plausível.