Vascular endothelial growth factor regulates melanoma cell adhesion and growth in the bone marrow microenvironment via tumor cyclooxygenase-2

Background: Human melanoma frequently colonizes bone marrow (BM) since its earliest stage of systemic dissemination, prior to clinical metastasis occurrence. However, how melanoma cell adhesion and proliferation mechanisms are regulated within bone marrow stromal cell (BMSC) microenvironment remain unclear. Consistent with the prometastatic role of inflammatory and angiogenic factors, several studies have reported elevated levels of cyclooxygenase-2 (COX-2) in melanoma although its pathogenic role in bone marrow melanoma metastasis is unknown. Methods: Herein we analyzed the effect of cyclooxygenase-2 (COX-2) inhibitor celecoxib in a model of generalized BM dissemination of left cardiac ventricle-injected B16 melanoma (B16M) cells into healthy and bacterial endotoxin lipopolysaccharide (LPS)-pretreated mice to induce inflammation. In addition, B16M and human A375 melanoma (A375M) cells were exposed to conditioned media from basal and LPS-treated primary cultured murine and human BMSCs, and the contribution of COX-2 to the adhesion and proliferation of melanoma cells was also studied. Results: Mice given one single intravenous injection of LPS 6 hour prior to cancer cells significantly increased B16M metastasis in BM compared to untreated mice; however, administration of oral celecoxib reduced BM metastasis incidence and volume in healthy mice, and almost completely abrogated LPS-dependent melanoma metastases. In vitro, untreated and LPS-treated murine and human BMSC-conditioned medium (CM) increased VCAM-1-dependent BMSC adherence and proliferation of B16M and A375M cells, respectively, as compared to basal medium-treated melanoma cells. Addition of celecoxib to both B16M and A375M cells abolished adhesion and proliferation increments induced by BMSC-CM. TNF alpha and VEGF secretion increased in the supernatant of LPS-treated BMSCs; however, anti-VEGF neutralizing antibodies added to B16M and A375M cells prior to LPS-treated BMSC-CM resulted in a complete abrogation of both adhesion-and proliferation-stimulating effect of BMSC on melanoma cells. Conversely, recombinant VEGF increased adherence to BMSC and proliferation of both B16M and A375M cells, compared to basal medium-treated cells, while addition of celecoxib neutralized VEGF effects on melanoma. Recombinant TNFa induced B16M production of VEGF via COX-2-dependent mechanism. Moreover, exogenous PGE2 also increased B16M cell adhesion to immobilized recombinant VCAM-1. Conclusions: We demonstrate the contribution of VEGF-induced tumor COX-2 to the regulation of adhesion-and proliferation-stimulating effects of TNFa, from endotoxin-activated bone marrow stromal cells, on VLA-4-expressing

Three-dimensional growth as multicellular spheroid activates the proangiogenic phenotype of colorectal carcinoma cells via LFA-1-dependent VEGF: implications on hepatic micrometastasis

Background: The recruitment of vascular stromal and endothelial cells is an early event occurring during cancer cell growth at premetastatic niches, but how the microenvironment created by the initial three-dimensional (3D) growth of cancer cells affects their angiogenesis-stimulating potential is unclear. Methods: The proangiogenic profile of CT26 murine colorectal carcinoma cells was studied in seven-day cultured 3D-spheroids of <300 mu m in diameter, produced by the hanging-drop method to mimic the microenvironment of avascular micrometastases prior to hypoxia occurrence. Results: Spheroid-derived CT26 cells increased vascular endothelial growth factor (VEGF) secretion by 70%, which in turn increased the in vitro migration of primary cultured hepatic sinusoidal endothelium (HSE) cells by 2-fold. More importantly, spheroid-derived CT26 cells increased lymphocyte function associated antigen (LFA)-1-expressing cell fraction by 3-fold; and soluble intercellular adhesion molecule (ICAM)-1, given to spheroid-cultured CT26 cells, further increased VEGF secretion by 90%, via cyclooxygenase (COX)-2-dependent mechanism. Consistent with these findings, CT26 cancer cells significantly increased LFA-1 expression in non-hypoxic avascular micrometastases at their earliest inception within hepatic lobules in vivo; and angiogenesis also markedly increased in both subcutaneous tumors and hepatic metastases produced by spheroid-derived CT26 cells. Conclusion: 3D-growth per se enriched the proangiogenic phenotype of cancer cells growing as multicellular spheroids or as subclinical hepatic micrometastases. The contribution of integrin LFA-1 to VEGF secretion via COX-2 was a micro environmental-related mechanism leading to the pro-angiogenic activation of soluble ICAM-1-activated colorectal carcinoma cells. This mechanism may represent a new target for specific therapeutic strategies designed to block colorectal cancer cell growth at a subclinical micrometastatic stage within the liver.

A biochemical and structural characterization of Drosophila neuroglian

A number of cell-cell interactions in the nervous system are mediated by immunoglobulin gene superfamily members. For example, neuroglian, a homophilic neural cell adhesion molecule in Drosophila, has an extracellular portion comprising six C- 2 type immunoglobulin-like domains followed by five fibronectin type III (FnIII) repeats. Neuroglian shares this domain organization and significant sequence identity with Ll, a murine neural adhesion molecule that could be a functional homologue. Here I report the crystal structure of a proteolytic fragment containing the first two FnIII repeats of neuroglian (NgFn 1,2) at 2.0Å. The interpretation of photomicrographs of rotary shadowed Ng, the entire extracellular portion of neuroglian, and NgFnl-5, the five neuroglian Fn III domains, is also discussed.

The structure of NgFn 1,2 consists of two roughly cylindrical β-barrel structural motifs arranged in a head-to-tail fashion with the domains meeting at an angle of ~120, as defined by the cylinder axes. The folding topology of each domain is identical to that previously observed for single FnIII domains from tenascin and fibronectin. The domains of NgFn1,2 are related by an approximate two fold screw axis that is nearly parallel to the longest dimension of the fragment. Assuming this relative orientation is a general property of tandem FnIII repeats, the multiple tandem FnIII domains in neuroglian and other proteins are modeled as thin straight rods with two domain zig-zag repeats. When combined with the dimensions of pairs of tandem immunoglobulin-like domains from CD4 and CD2, this model suggests that neuroglian is a long narrow molecule (20 - 30 Å in diameter) that extends up to 370Å from the cell surface.

In photomicrographs, rotary shadowed Ng and NgFn1-5 appear to be highly flexible rod-like molecules. NgFn 1-5 is observed to bend in at least two positions and has a mean total length consistent with models generated from the NgFn1,2 structure. Ng molecules have up to four bends and a mean total length of 392 Å, consistent with a head-to-tail packing of neuroglian's C2-type domains.

Anatomical and developmental patterns of interleukin-2 gene expression in the mouse: analysis of IL-2 expressing cells and partial characterization of interactions involved in mediating IL-2 gene expression in vivo

Interleukin-2 (IL-2) is an important mediator in the vertebrate immune system. IL-2 is a potent growth factor that mature T lymphocytes use as a proliferation signal and the production of IL-2 is crucial for the clonal expansion of antigen-specific T cells in the primary immune response. IL-2 driven proliferation is dependent on the interaction of the lymphokine with its cognate multichain receptor. IL-2 expression is induced only upon stimulation and transcriptional activation of the IL-2 gene relies extensively on the coordinate interaction of numerous inducible and constitutive trans-acting factors. Over the past several years, thousands of papers have been published regarding molecular and cellular aspects of IL-2 gene expression and IL-2 function. The vast majority of these reports describe work that has been carried out in vitro. However, considerably less is known about control of IL-2 gene expression and IL-2 function in vivo.

To gain new insight into the regulation of IL-2 gene expression in vivo, anatomical and developmental patterns of IL-2 gene expression in the mouse were established by employing in situ hybridization and immunohistochemical staining methodologies to tissue sections generated from normal mice and mutant animals in which T -cell development was perturbed. Results from these studies revealed several interesting aspects of IL-2 gene expression, such as (1) induction of IL-2 gene expression and protein synthesis in the thymus, the primary site of T-cell development in the body, (2) cell-type specificity of IL-2 gene expression in vivo, (3) participation of IL-2 in the extrathymic expansion of mature T cells in particular tissues, independent of an acute immune response to foreign antigen, (4) involvement of IL-2 in maintaining immunologic balance in the mucosal immune system, and (5) potential function of IL-2 in early events associated with hematopoiesis.

Extensive analysis of IL-2 mRNA accumulation and protein production in the murine thymus at various stages of development established the existence of two classes of intrathymic IL-2 producing cells. One class of intrathymic IL-2 producers was found exclusively in the fetal thymus. Cells belonging to this subset were restricted to the outermost region of the thymus. IL-2 expression in the fetal thymus was highly transient; a dramatic peak ofiL-2 mRNA accumulation was identified at day 14.5 of gestation and maximal IL-2 protein production was observed 12 hours later, after which both IL-2 mRNA and protein levels rapidly decreased. Significantly, the presence of IL-2 expressing cells in the day 14-15 fetal thymus was not contingent on the generation of T-cell receptor (TcR) positive cells. The second class of IL-2 producing cells was also detectable in the fetal thymus (cells found in this class represented a minority subset of IL-2 producers in the fetal thymus) but persist in the thymus during later stages of development and after birth. Intrathymic IL-2 producers in postnatal animals were located in the subcapsular region and cortex, indicating that these cells reside in the same areas where immature T cells are consigned. The frequency of IL-2 expressing cells in the postnatal thymus was extremely low, indicating that induction of IL-2 expression and protein synthesis are indicative of a rare activation event. Unlike the fetal class of intrathymic IL-2 producers, the presence of IL-2 producing cells in the postnatal thymus was dependent on to the generation of TcR+ cells. Subsequent examination of intrathymic IL-2 production in mutant postnatal mice unable to produce either αβ or γδ T cells showed that postnatal IL-2 producers in the thymus belong to both αβ and γδ lineages. Additionally, further studies indicated that IL-2 synthesis by immature αβ -T cells depends on the expression of bonafide TcR αβ-heterodimers. Taken altogether, IL-2 production in the postnatal thymus relies on the generation of αβ or γδ-TcR^+ cells and induction of IL-2 protein synthesis can be linked to an activation event mediated via the TcR.

With regard to tissue specificity of IL-2 gene expression in vivo, analysis of whole body sections obtained from normal neonatal mouse pups by in situ hybridization demonstrated that IL-2 mRNA^+ cells were found in both lymphoid and nonlymphoid tissues with which T cells are associated, such as the thymus (as described above), dermis and gut. Tissues devoid of IL-2 mRNA^+ cells included brain, heart, lung, liver, stomach, spine, spinal cord, kidney, and bladder. Additional analysis of isolated tissues taken from older animals revealed that IL-2 expression was undetectable in bone marrow and in nonactivated spleen and lymph nodes. Thus, it appears that extrathymic IL-2 expressing cells in nonimmunologically challenged animals are relegated to particular epidermal and epithelial tissues in which characterized subsets of T cells reside and thatinduction of IL-2 gene expression associated with these tissues may be a result of T-cell activation therein.

Based on the neonatal in situ hybridization results, a detailed investigation into possible induction of IL-2 expression resulting in IL-2 protein synthesis in the skin and gut revealed that IL-2 expression is induced in the epidermis and intestine and IL-2 protein is available to drive cell proliferation of resident cells and/or participate in immune function in these tissues. Pertaining to IL-2 expression in the skin, maximal IL-2 mRNA accumulation and protein production were observed when resident Vγ_3^+ T-cell populations were expanding. At this age, both IL-2 mRNA^+ cells and IL-2 protein production were intimately associated with hair follicles. Likewise, at this age a significant number of CD3ε^+ cells were also found in association with follicles. The colocalization of IL-2 expression and CD3ε^+ cells suggests that IL-2 expression is induced when T cells are in contact with hair follicles. In contrast, neither IL-2 mRNA nor IL-2 protein were readily detected once T-cell density in the skin reached steady-state proportions. At this point, T cells were no longer found associated with hair follicles but were evenly distributed throughout the epidermis. In addition, IL-2 expression in the skin was contingent upon the presence of mature T cells therein and induction of IL-2 protein synthesis in the skin did not depend on the expression of a specific TcR on resident T cells. These newly disclosed properties of IL-2 expression in the skin indicate that IL-2 may play an additional role in controlling mature T-cell proliferation by participating in the extrathymic expansion of T cells, particularly those associated with the epidermis.

Finally, regarding IL-2 expression and protein synthesis in the gut, IL-2 producing cells were found associated with the lamina propria of neonatal animals and gut-associated IL-2 production persisted throughout life. In older animals, the frequency of IL-2 producing cells in the small intestine was not identical to that in the large intestine and this difference may reflect regional specialization of the mucosal immune system in response to enteric antigen. Similar to other instances of IL-2 gene expression in vivo, a failure to generate mature T cells also led to an abrogation of IL-2 protein production in the gut. The presence of IL-2 producing cells in the neonatal gut suggested that these cells may be generated during fetal development. Examination of the fetal gut to determine the distribution of IL-2 producing cells therein indicated that there was a tenfold increase in the number of gut-associated IL-2 producers at day 20 of gestation compared to that observed four days earlier and there was little difference between the frequency of IL-2 producing cells in prenatal versus neonatal gut. The origin of these fetally-derived IL-2 producing cells is unclear. Prior to the immigration of IL-2 inducible cells to the fetal gut and/or induction of IL-2 expression therein, IL-2 protein was observed in the fetal liver and fetal omentum, as well as the fetal thymus. Considering that induction of IL-2 protein synthesis may be an indication of future functional capability, detection of IL-2 producing cells in the fetal liver and fetal omentum raises the possibility that IL-2 producing cells in the fetal gut may be extrathymic in origin and IL-2 producing cells in these fetal tissues may not belong solely to the T lineage. Overall, these results provide increased understanding of the nature of IL-2 producing cells in the gut and how the absence of IL-2 production therein and in fetal hematopoietic tissues can result in the acute pathology observed in IL-2 deficient animals.

Isolation and characterization of proteins that bind to yeast origins of DNA replication

Yeast chromosomes contain sequences called ARSs which function as origins of replication in vitro and in vivo. We have carried out a systematic deletion analysis of ARS1, allowing us to define three functionally distinct domains, designated A, B, and C. Domain A is a sequence of 11 to 19bp, containing the core consensus element that is required for replication. The core consensus sequence, A/TTTTATPuTTTA/T, is conserved at all ARSs sequenced to date. A fragment containing only element A and 8 flanking nucleotides enables autonomous replication of centromeric plasmids. These plasmids replicate very inefficiently, suggesting that flanking sequences must be important for ARS function. Domain B also provides important sequences needed for efficient replication. Deletion of domain B drastically increases the doubling times of transformants and reduces plasmid stability. Domain B contains a potential consensus sequence conserved at some ARSs which overlaps a region of bent DNA. Mutational analysis suggests this bent DNA may be important for ARS function. Deletion of domain C has only a slight effect on replication of plasmids carrying those deletions.

We have identified a protein called ARS binding factor I (ABF-I) that binds to the HMR-E ARS and ARS1. We have purified this protein to homogeneity using conventional and oligonucleotide affinity chromatography. The protein has an apparent molecular weight of 135kDa and is present at about 700 molecules per diploid cell, based on the yield of purified protein and in situ antibody staining. DNaseI footprinting reveals that ABF-I binds sequence-specifically to an approximately 24bp sequence that overlaps element Bat ARSl. This same protein binds to and protects a similar size region at the HMR-E ARS.

We also find evidence for another ARS binding protein, ABF-III, based on DN asei footprint analysis and gel retardation assays. The protein protects approximately 22bp adjacent to the ABF-I site. There appears to be no interaction between ABF-I and ABF-III despite the proximity of their binding sites.

To address the function of ABF-I in DNA replication, we have cloned the ABF-I gene using rabbit polyclonal anti-sera and murine monoclonal antibodies against ABF-I to screen a λgt11 expression library. Four EcoRI restriction fragments were isolated which encoded proteins that were recognized by both polyclonal and monoclonal antibodies. A gene disruption can now be constructed to determine the in vivo function of ABF-I.

Studies toward the total synthesis of ritterazine B : the investigation of alkynylation reactions for use in the synthesis of the western fragment

The ritterazine and cephalostatin natural products have biological activities and structures that are interesting to synthetic organic chemists. These products have been found to exhibit significant cytotoxicity against P388 murine leukemia cells, and therefore have the potential to be used as anticancer drugs. The ritterazines and cephalostatins are steroidal dimers joined by a central pyrazine ring. Given that the steroid halves are unsymmetrical and highly oxygenated, there are several challenges in synthesizing these compounds in an organic laboratory.

Ritterazine B is the most potent derivative in the ritterazine family. Its biological activity is comparable to drugs that are being used to treat cancer today. For this reason, and the fact that there are no reported syntheses of ritterazine B to date, our lab set out to synthesize this natural product.

Herein, efforts toward the synthesis of the western fragment of ritterazine B are described. Two different routes are explored to access a common intermediate. An alkyne conjugate addition reaction was initially investigated due to the success of this key reaction in the synthesis of the eastern fragment. However, it has been found that a propargylation reaction has greater reactivity and yields, and has the potential to reduce the step count of the synthesis of the western fragment of ritterazine B.

Wide Field-of-view Microscopes and Endoscopes for Time-lapse Imaging and High-throughput Screening

Wide field-of-view (FOV) microscopy is of high importance to biological research and clinical diagnosis where a high-throughput screening of samples is needed. This thesis presents the development of several novel wide FOV imaging technologies and demonstrates their capabilities in longitudinal imaging of living organisms, on the scale of viral plaques to live cells and tissues.

The ePetri Dish is a wide FOV on-chip bright-field microscope. Here we applied an ePetri platform for plaque analysis of murine norovirus 1 (MNV-1). The ePetri offers the ability to dynamically track plaques at the individual cell death event level over a wide FOV of 6 mm × 4 mm at 30 min intervals. A density-based clustering algorithm is used to analyze the spatial-temporal distribution of cell death events to identify plaques at their earliest stages. We also demonstrate the capabilities of the ePetri in viral titer count and dynamically monitoring plaque formation, growth, and the influence of antiviral drugs.

We developed another wide FOV imaging technique, the Talbot microscope, for the fluorescence imaging of live cells. The Talbot microscope takes advantage of the Talbot effect and can generate a focal spot array to scan the fluorescence samples directly on-chip. It has a resolution of 1.2 μm and a FOV of ~13 mm². We further upgraded the Talbot microscope for the long-term time-lapse fluorescence imaging of live cell cultures, and analyzed the cells’ dynamic response to an anticancer drug.

We present two wide FOV endoscopes for tissue imaging, named the AnCam and the PanCam. The AnCam is based on the contact image sensor (CIS) technology, and can scan the whole anal canal within 10 seconds with a resolution of 89 μm, a maximum FOV of 100 mm × 120 mm, and a depth-of-field (DOF) of 0.65 mm. We also demonstrate the performance of the AnCam in whole anal canal imaging in both animal models and real patients. In addition to this, the PanCam is based on a smartphone platform integrated with a panoramic annular lens (PAL), and can capture a FOV of 18 mm × 120 mm in a single shot with a resolution of 100─140 μm. In this work we demonstrate the PanCam’s performance in imaging a stained tissue sample.

A atividade da pterocarpanoquinona LQB 118 in vitro e in vivo em Leishmania braziliensis

As leishmanioses estão entre as mais importantes endemias brasileiras e encontram-se entre as doenças mais negligenciadas no mundo. O arsenal terapêutico disponível é restrito, tóxico, caro e em algumas situações ineficazes, devido ao surgimento de cepas resistentes do parasito. No Brasil são registrados anualmente mais de 20 mil casos de leishmaniose tegumentar e a Leishmania braziliensis é a principal espécie causadora das formas clínicas cutânea e mucosa. Portanto tornam-se importantes estudos que conduzam ao desenvolvimento de novas alternativas terapêuticas. O objetivo do presente estudo foi avaliar a atividade da pterocarpanoquinona denominada LQB118 sobre Leishmania braziliensis in vitro e in vivo usando hamsters como modelo experimental. O efeito antiparasitário foi avaliado sobre o crescimento in vitro das formas promastigotas e sobre amastigotas intracelulares em macrófagos peritoneais de camundongos. Para avaliar o modo ação in vitro foi investigada a indução de apoptose usando marcação por TUNEL e Anexina V-FITC. O efeito sobre a modulação da ativação de macrófagos murinos foi analisada pela dosagem de óxido nítrico (reagente de Griess) e de citocinas IL-12, TNF-alfa e IL-10 (por ELISA) nos sobrenadantes de macrófagos. In vivo a atividade terapêutica da LQB 118 foi estudada em grupos de hamsters infectados com L.braziliensis na pata, tratados com a LQB118 pelas vias intralesional (100M/3x/semana) ou oral (0,5mg/5x/semana) após 7 dias de infecção durante oito semanas. A ação terapêutica foi analisada através do tamanho da lesão. A resposta imune foi avaliada durante o tratamento, pela resposta de hipersensibilidade tardia (DTH) ao antígeno total de L. braziliensis. A ação da LQB118 in vitro foi dose-dependente tanto na forma promastigota inibindo 45%, 64,7% e 99,95%, quanto nas amastigotas intracelulares 22%, 72% e 81% nas concentrações de 5M, 10M e 20M, respectivamente para ambas as formas evolutivas. A LQB118 foi capaz de induzir a externalização de fosfatidilserina em promastigotas (18,57% das células incubadas por 24 h e em 25,79% de células tratadas por 48h) e também promoveu aumento da fluorescência nas duas formas evolutivas da Leishmania quando comparadas aos controles, demonstrando a indução de fragmentação do DNA do parasito. Esta substância também foi capaz de modular a resposta dos macrófagos infectados por 24 horas aumentando de forma dose-dependente a IL-12 e NO, mantendo constante TNF-α. In vivo, na sétima semana de tratamento, observamos uma redução significativa do tamanho das lesões nos animais tratados com LQB 118 intralesional (p<0, 001) e no grupo tratado pela via oral (p<0,05) quando comparado com o controle. Estes resultados demonstram que a atividade anti-Leishmania da LQB118 é direta sobre o parasito pela indução de morte por apoptose, apresentando também uma ação moduladora da resposta dos macrófagos contribuindo para ação leishmanicida, sem alterar a morfologia da célula hospedeira e que a LQB 118 apresenta uma atividade terapêutica no modelo hamster e pode ser uma importante molécula para o desenvolvimento de um novo fármaco.

Atividade pró-trombótica da toxina ExoU de Pseudomonas aeruginosa detectada em modelos experimentais in vivo e in vitro

Pseudomonas aeruginosa é um importante agente de pneumonia, particularmente em pacientes submetidos à ventilação mecânica, que pode evoluir para sepse, com elevadas taxas de letalidade. Na sepse, o processo inflamatório sistêmico exacerbado favorece o desequilíbrio entre as vias de coagulação e fibrinólise e a instalação de um estado pró-coagulante, com o aparecimento de trombose microvascular, coagulação intravascular disseminada e falência de múltiplos órgãos. Conhecendo a potente atividade pró-inflamatória da toxina ExoU produzida por P. aeruginosa, decorrente de sua atividade fosfolipásica A2, o objetivo desta tese foi investigar seu potencial de indução de alterações hemostáticas relacionadas à patogênese da sepse. Utilizando modelo de sepse em camundongos inoculados, por via intratraqueal, com suspensões de P. aeruginosa produtora de ExoU (PA103) ou de cepa com deleção do gene exoU, não produtora da toxina, foi mostrado que ExoU determinou maior gravidade da infecção, maior taxa de letalidade, leucopenia, trombocitose, hiperpermeabilidade vascular e transudação plasmática, evidenciadas, respectivamente, pela maior concentração de proteínas nos lavados broncoalveolares (LBAs) e acúmulo do corante Azul de Evans, previamente inoculado nos animais, por via endovenosa, no parênquima renal. ExoU favoreceu, também, a ativação plaquetária, confirmada pela maior concentração de plaquetas expressando P-selectina em sua superfície, maior número de micropartículas derivadas de plaquetas e maior concentração plasmática de tromboxano A2. A histopatologia dos pulmões e rins dos animais infectados com PA103 confirmou a formação de microtrombos, que não foram detectados nos animais controles ou infectados com a cepa mutante. Nos pulmões, a produção de ExoU determinou intensa resposta inflamatória com maior concentração de leucócitos totais e polimorfonucleados, interleucina-6 e fator de necrose tumoral-α nos LBAs. A análise imunohistoquímica mostrou intensa deposição de fibrina nos alvéolos e septos interalveolares. A atividade pró-coagulante dependente do fator tissular detectada nos LBAs dos camundongos infectados com PA103 foi independente da produção do inibidor da via de ativação do fator tissular (TFPI), mas associada ao aumento da produção do inibidor do ativador do plasminogênio-1 (PAI-1). Para investigar a participação do fator de ativação plaquetária (PAF) na liberação de PAI-1, foi pesquisada a atividade da enzima PAF-acetil-hidrolase (PAF-AH) nos LBAs dos camundongos. A atividade de PAF-AH apresentou-se significativamente elevada nos LBA dos camundongos infectados com PA103. O tratamento dos animais com um inibidor do PAF, antes da infecção, resultou na diminuição significativa das concentrações de PAI-1 e de leucócitos totais, bem como da atividade pró-coagulante dos LBAs. In vitro, ExoU induziu maior expressão do RNA mensageiro de PAI-1 e maior liberação da proteína PAI-1 nos sobrenadantes de células epiteliais respiratórias da linhagem A549. O tratamento das células A549 com um anticorpo anti-receptor de PAF, antes da infecção, reduziu significativamente a concentração de PAI-1 nos sobrenadantes de células infectadas com a cepa selvagem. Estes resultados demonstraram um novo mecanismo de virulência de P. aeruginosa através da atividade pró-trombótica de ExoU e a possibilidade de utilização da identificação de ExoU em isolados clínicos de pacientes graves como um marcador prognóstico para estes pacientes.

Efeito da 1,10-fenantrolina e seus derivados complexados em metal na atividade proteolítica de Leishmania braziliensis

Leishmanioses são um grupo de doenças com um largo espectro de manifestações clínicas, as quais variam desde lesões cutâneas até o envolvimento visceral severo, podendo levar ao óbito. A leishmaniose é, ainda hoje, uma doença negligenciada, estando entre os agravos prioritários do programa de pesquisa sobre doenças da pobreza da Organização Mundial da Saúde (OMS). Além de não haver vacinas disponíveis, a terapia é baseada em medicamentos injetáveis que causam sérios efeitos colaterais, tornando o tratamento inviável para muitos países endêmicos. Drogas derivadas de metal representam um novo arsenal terapêutico antimicrobiano e anti-câncer. Os inibidores de peptidase/agentes quelantes tais como 1,10-fenantrolina e seus derivados, no estado livre de metal ou como ligantes com metais de transição, interferem com a função de vários sistemas biológicos. Em trabalhos anteriores, nosso grupo descreveu que o parasito L. braziliensis produziu moléculas gp63 sensíveis a 1,10-fenantrolina. No presente trabalho, demonstramos a distribuição celular da molécula gp63 em uma cepa virulenta de L. braziliensis por meio de análises bioquímicas e imuno-histoquímica. Depois disso, relatamos os efeitos inibitórios de três compostos derivados da 1,10-fenantrolina, 1,10-fenantrolina-5,6-diona (phendio), [Cu(phendio)2] e [Ag(phendio)2], nas atividades metalopeptidases celulares e extracelulares produzidas por promastigotas de L. braziliensis, bem como as suas ações sobre a viabilidade do parasita e na interação com as células de macrófagos murinos. As moléculas gp63 foram detectadas em compartimentos de parasitos, incluindo membrana citoplasmatica e bolsa flagelar. O tratamento de promastigotas de L. braziliensis durante 1 hora com 1,10-fenantrolina e seus derivados resultou numa inibição significativa da viabilidade celular e mostrou um mecanismo de ação irreversível. Estes inibidores de metalopeptidases induziram apoptose em promastigotas de L. braziliensis, demonstrada através da marcação com anexina/iodeto de propídio e ensaio TUNEL. O pré-tratamento de promastigotas com os inibidores de metalopeptidases induziram uma diminuição na expressão de moléculas de superfície gp63, assim como uma redução significativa no índice de associação com macrófagos. Em paralelo, macrófagos infectados com L. braziliensis e tratados com 1,10-fenantrolina e seus derivados promoveram uma potente redução sobre o número de amastigotas intracelulares. O tratamento de macrófagos com 1,10-fenantrolina e seus derivados não induziram o aumento de óxido nítrico. A ação combinatória sobre a capacidade de crescimento entre os compostos derivados da 1,10-fenantrolina e Glucantime, quando ambos foram utilizados em concentracões sub-inibidoras, também foi observada. In vivo os compostos derivados da 1,10-fenantrolina e seus drivados foram capazes de controlar o tamanho das lesões a partir da terceira semana de tratamento em relação ao controle não tratado em hamsters infectados quando administrado por via intraperitoneal. Os animais tratados com os compostos apresentaram maior resposta intradérmica (DTH) aos antígenos de L. braziliensis. Coletivamente, a 1,10-fenantrolina e seus derivados metálicos apresentam uma nova perspectiva de estudos para o desenvolvimento de novos fármacos anti-L. braziliensis

Estudos dos efeitos antioxidantes e anti-inflamatórios da própolis sobre as células RAW 264.7 e na resposta inflamatória pulmonar aguda causada pela exposição à fumaça de cigarro em camundongos

A doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) causa a redução da capacidade respiratória e seu desenvolvimento é associado à fumaça de cigarro. O cigarro possui mais de 4800 substâncias tóxicas e causa a morte de seis milhões de pessoas por ano no mundo. Estudos buscam meios de reverter os males causados pela fumaça de cigarro. A própolis (P) é um produto produzido por abelhas que possui várias propriedades. O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos antioxidantes da P em macrófagos murinos e na inflamação pulmonar aguda induzida pela fumaça de cigarro (CS) em camundongos. A análise dos compostos fitoquímicos do extrato alcóolico da P (EAP) foi feita por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa (GC-MS). Células da linhagem RAW 264.7 foram tratadas em diversas concentrações de P durante 24 horas. Após tratamento, as seguintes análises foram realizadas: polifenóis totais; viabilidade celular (MTT); potencial redutor (DPPH); espécies reativas de oxigênio totais (ROS) e de malondialdeído (MDA). Trinta camundongos C57BL/6 foram divididos em 3 grupos (n=10/grupo): Controle+P, CS e CS+P. Ambos os grupos CS foram expostos a 6 cigarros/dia durante 5 dias. O grupo CS foi tratado com veículo. O pulmão e o lavado broncoalveolar (BAL) foram coletados para análise histológica e contagem diferencial de células. As análises para mieloperoxidase (MPO), superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx), glutationa reduzida (GSH) e oxidada (GSSG), MDA, nitrito e western blotting para TNF-alfa foram realizadas. A análise fitoquímica do EAP mostrou a presença dos ácidos hidrocinâmicos e coumárico, a artepilina C e a drupanina. Foi observado o aumento concentração-dependente dos níveis de polifenóis totais (p<0,001), do MTT (p<0,001) e do DPPH (p<0,001), e o inverso com o MDA (p<0,001). Os níveis de ROS diminuem nas concentrações de 15,6 e 31,2 mg/mL (p<0,05, ambos). A histologia pulmonar do grupo Controle+P foi similar ao do CS+P e foi observado um influxo de macrófagos e neutrófilos no grupo CS (p<0,01 e p<0,001, respectivamente). Os níveis de MPO foram aumentados no grupo CS (526,534,72 mU/mg ptn, p<0,01), mas houve uma redução no grupo CS+P (385,127,64 mU/mg ptn, p<0,05) comparável ao Controle+P (13412,99 mU/mg ptn, p<0,001), o mesmo aconteceu com as enzimas antioxidantes: SOD (Controle+P: 523,529,6 U/mg ptn; CS: 523,529,6 U/mg ptn, p<0,001; CS+P: 246,815,69 U/mg ptn, p<0,001); CAT (Controle+P: 37,383,39 U/mg ptn; CS: 92,686,24 U/mg ptn, p<0,001; CS+P: 59,844,55 U/mg ptn, p<0,05); GPx (Controle+P: 2,230,17 (M/min/mg ptn) x 10-1; CS: 4,510,31 (M/min/mg ptn) x 10-1, p<0,001; CS+P: 2,640,19 (M/min/mg ptn) x 10-1, p<0,05). O inverso ocorreu com a relação GSH/GSSG (Controle+P: 1,0880,17; CS: 0,7360,07, p<0,05; CS+P: 1,2580,10, p<0,05). Os níveis de MDA (Controle+P: 0,2660,05 nMol/mg ptn; CS: 0,940,076 nMol/mg ptn, p<0,001; CS+P: 0,4980,06 nMol/mg ptn, p<0,01) e de nitrito (Controle+P: 50,014,19 Mol/mg ptn; CS: 108,77,73 Mol/mg ptn, p<0,001; CS+P: 58,843,42 nMol/mg ptn, p<0,01) estavam aumentados no CS que em outros grupos. A expressão de TNF-α foi observada no grupo CS. O tratamento da P apresentou ação anti-inflamatória e antioxidante em macrófagos e em camundongos expostos à fumaça de cigarro, possivelmente pela ação dos polifenóis presentes nela

Atividade do flavonóide quercetina em Leishmania braziliensis usando hamster como modelo de infecção

As leishmanioses estão entre as mais importantes endemias brasileiras e encontram-se entre as doenças mais negligenciadas no mundo. O arsenal terapêutico disponível é restrito, tóxico, caro e em algumas situações ineficazes, devido ao surgimento de cepas resistentes do parasito. No Brasil são registrados anualmente mais de 20 mil casos de leishmaniose tegumentar e a Leishmania braziliensis é a principal espécie causadora das formas clínicas cutânea e mucosa. Estudos prévios mostraram que o flavonóide quercetina tem ação terapêutica pela via oral em camundongos infectados com L. amazonensis. O objetivo do presente estudo foi avaliar a atividade do flavonóide quercetina sobre Leishmania braziliensis in vitro e in vivo usando hamsters como modelo experimental. O efeito antiparasitário da quercetina foi avaliado sobre o crescimento in vitro das formas promastigotas e sobre amastigotas intracelulares em macrófagos peritoneais de camundongos e hamsters. O efeito da quercetina sobre macrófagos foi avaliado pela dosagem de óxido nítrico pelo método de Griess nos sobrenadantes das culturas e espécies reativas de oxigênio (EROs) intracelular através do H2DCFDA. In vivo a atividade terapêutica da quercetina foi estudada em grupos de hamsters infectados com L.braziliensis na pata, tratados com quercetina pela via oral (2mg/ 5X / semana) após 7 dias de infecção durante oito semanas.A ação terapêutica foi analisada através do tamanho da lesão. A resposta imune foi avaliada durante o tratamento, pela resposta de hipersensibilidade tardia (DTH) ao antígeno total de L. braziliensis. A quercetina não apresentou atividade sobre o crescimento de promastigotas em cultura em nenhuma das concentrações testadas. Em amastigotas intracelulares quercetina apresentou ação dose dependente em macrófagos de camundongos e hamsters inibindo 45% e 54% e 25% e 48 %, respectivamente nas concentrações de 50 e 100g/ml após 48h de tratamento. O pré - tratamento dos macrófagos de camundongos e hamsters com quercetina foi capaz de inibir o crescimento de amastigotas intracelulares em 57, 58 e 74% e 49, 50, e 58% respectivamente, nas concentrações de 25, 50 e 100 g/ml, apresentado ação inibitória significativa em todas as concentrações testadas. Não houve alteração na produção de NO pelos macrófagos, entretanto macrófagos pré tratados com a quercetina por 24 horas antes da infecção apresentaram um aumento significativo na produção de EROs, quando comparados aos controles. Macrófagos tratados antes e depois da infecção, apresentaram diminuição da produção de EROs. In vivo, a quercetina foi capaz de controlar o tamanho das lesões a partir da terceira semana de tratamento em relação ao controle não tratado ( P< 0,05). Os animais tratados com quercetina apresentaram maior resposta intradérmica aos antígenos de L. braziliensis. Esses dados mostram que a quercetina tem atividade sobre L. braziliensis, inibindo amastigotas intracelulares in vitro e sendo capaz de controlar o tamanho das lesões em hamsters infectados quando administrada pela via oral.

Papel regulatório da proteína anexina-1 e de seu derivado Ac2-26 no modelo experimental de asma alérgica em camundongos

A asma é uma doença inflamatória crônica caracterizada por hiper-reatividade das vias aéreas, acúmulo de eosinófilos, secreção de muco e remodelamento. No decorrer do estabelecimento do processo inflamatório, há liberação de mediadores endógenos que atuam limitando a evolução do quadro patológico e garantindo a manutenção da homeostasia (COHN, ELIAS e CHUPP, 2004). Dentre estes recebem destaque os hormônios glicocorticóides, reconhecidos por sua atividade anti-inflamatória, dependente, em parte, da geração de fatores intermediários como a proteína anexina-1 (AnxA1) (KAMAL, FLOWER e PERRETTI, 2005; PERRETTI, 2003). Neste estudo investigou-se o papel regulatório da AnxA1 e do peptídeo derivado Ac2-26 (50 - 200 g/animal) no modelo experimental de asma alérgica murina. Camundongos BALB/c (AnxA1+/+) e depletados do gene codificante para AnxA1 (AnxA1-/-) foram sensibilizados com ovoalbumina (OVA 50 g) e hidróxido de alumínio (5 mg), por via subcutânea. Após 14 dias, foi feito reforço com OVA (25 g), por via intraperitoneal, e nos dias 19, 20 e 21 foram desafiados com OVA (25 g), por via intranasal. O tratamento consistiu na administração intranasal do peptídeo Ac2-26 (50 - 200 g), 1 h antes de cada desafio. As análises foram feitas 24 h após o último desafio e incluíram: i) função pulmonar (resistência e elastância) e hiper-reatividade das vias aéreas à metacolina (3 27 mg/ml) através de pletismografia invasiva; ii) alterações morfológicas através de histologia clássica; iii) quantificação de colágeno e iv) quantificação de mediadores inflamatórios através de ELISA. Verificou-se que camundongos AnxA1-/-, quando ativamente sensibilizados e desafiados com OVA apresentaram exacerbação do quadro de hiper-reatividade das vias aéreas, assim como do número de eosinófilos no lavado broncoalveolar e no infiltrado peribrônquico, deposição de colágeno e nos níveis de IL-13 em comparação aos controles AnxA1+/+. Em paralelo, observou-se que o peptídeo Ac2-26 levou a uma redução da hiper-reatividade das vias aéreas frente à estimulação com metacolina nos animais AnxA1+/+. O peptídeo Ac2-26 reduziu o infiltrado inflamatório no parênquima pulmonar e o número de eosinófilos peribronquiolares, além da produção de muco no tecido pulmonar e da geração IL-4, IL-13, eotaxina-1 e -2. Em conjunto, nossos achados mostram que os camundongos AnxA1-/- mostraram-se mais responsivos à estimulação antigênica, o que foi indicativo de que a AnxA1 parece exercer um papel regulatório importante sobre a resposta inflamatória alérgica murina. Além disso, o efeito inibitório do peptídeo Ac2-26 sobre a resposta alérgica pulmonar foi indicativo de que este se coloca como um composto anti-inflamatório e anti-alérgico promissor para utilização na terapia da asma.

Avaliação do efeito anti-inflamatório e antiasmático da 15-deoxy-delta-12,14-prostaglandina J2 em modelos murinos de asma

A asma é um distúrbio crônico pulmonar caracterizado por inflamação, obstrução e remodelamento brônquico, levando a sintomas como sibilo, tosse e falta de ar. A terapia antiasmática consiste em corticosteroides inalados e agonistas β2 de curta ou longa duração. O tratamento é limitado por efeitos colaterais e refratariedade de alguns pacientes, justificando a necessidade de novas terapias. Estudos demonstram que a 15-deoxy-delta- 12,14-prostaglandina J2 (15d-PGJ2), um ligante endógeno de receptores ativados por proliferadores de peroxissomos do tipo gama (PPAR-γ), é capaz de reduzir a expressão de citocinas pró-inflamatórias, o que pode resultar em benefícios no tratamento de doenças com esse perfil. O objetivo deste estudo foi avaliar o potencial anti-inflamatório e antiasmático da 15d-PGJ2 em modelos experimentais de asma. Camundongos A/J machos foram sensibilizados nos dias 0 e 7 através de injeção subcutânea (s.c.), contendo ovoalbumina (OVA) e Al(OH)3, e desafiados com 4 instilações intranasais (i.n.) de OVA em intervalos semanais. O tratamento com 15d-PGJ2 (30 e 100 g/Kg, s.c.) foi realizado 30 min antes dos desafios a partir da terceira provocação antigênica. Em outro modelo, camundongos A/J foram desafiados intranasalmente com extrato de ácaro 3 vezes por semana durante 3 semanas. As administrações de 15d-PGJ2 (30, 70 e 100 g/Kg, s.c. e 0,65; 1,5 e 2,3 g/animal, i.n.) foram realizadas a partir da 3 semana, 30 min antes dos desafios. As análises ocorreram 24 h após o último desafio. Nossos resultados mostraram que, em camundongos previamente sensibilizados e desafiados com OVA, a administração de 15d-PGJ2 limitou significativamente o influxo peribrônquico de eosinófilos e neutrófilos, bem como a produção de muco por células caliciformes e fibrose sub-epitelial, além da hiperreatividade das vias aéreas e produção de IL-5. A redução do epitélio brônquico e das citocinas IL-13 e TNF-α foram observadas somente na maior dose administrada. No modelo HDM a inflamação e o remodelamento foram atenuados em todas as doses administradas do composto, enquanto que a hiperresponssividade brônquica foi inibida apenas nas doses de 70 e 100 μg/Kg (via sistêmica) e na dose intermediária dada topicamente (1,5 μg/animal, i.n.). Os níveis de citocinas foram atenuados pelo tratamento subcutâneo, porém somente os níveis de IL-17, eotaxina-1 e TNF-α foram inibidos com a dose intranasal de 0,65 g/animal. O aumento da expressão de NF-κB, induzido por provocação com HDM também foi reduzido significativamente pela administração de 15d-PGJ2. Em conjunto, nossos dados indicam que o tratamento com 15d-PGJ2 inibe alterações cruciais associadas à patogênese da asma, em modelos experimentais distintos da doença, demonstrando possuir grande potencial para controlar e reverter inflamação, hiperreatividade e remodelamento pulmonar desencadeados por provocação alérgica.

Estudo in vitro de derivados sintéticos da Isoniazida e da Pirazinamida sobre Leishmania (Viannia) braziliensis

As leishmanioses são um grupo de doenças causadas por protozoários do gênero Leishmania spp que afetam 98 países. No Brasil, no ano de 2013, foram relatados 3.253 casos de leishmaniose visceral e 18.226 casos de Leishmaniose Tegumentar Americana. O tratamento de primeira escolha continua sendo realizado com antimoniais pentavalentes, e em casos de insucessos os fármacos de segunda escolha são a pentamidina e a anfotericina B. Tais medicamentos causam intensos efeitos adversos e ultimamente têm surgido cepas resistentes aos mesmos. Em áreas endêmicas têm sido cada vez mais comum o surgimento da co-infecção Leishmania com Mycobacterium tuberculosis. O tratamento para a tuberculose com pirazinamida (PZA) e isoniazida (INZ), controla a leishmaniose. Esses dados sugerem atividade anti-leishmania da PZA e da INZ. O objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade in vitro da INZ e da PZA e seus compostos derivados (série G e série R, respectivamente) sobre Leishmania (Viannia) braziliensis. As moléculas foram testadas em monocamadas de macrófagos peritoneais de camunongos infectados com L. (V) braziliensis durante 48h. Todas as moléculas testadas inibiram o índice de infecção de forma dose dependente em comparação aos controles. As moléculas da série R foram mais ativas do que a PZA, porém o resultado foi significativo somente para a R02 (p < 0,005). Apenas a molécula R05 (76,64M) foi relativamente tóxica para macrófagos. Os compostos mais ativos foram R02, G01 e G02, cujos índices de seletividade foram 14,31, 19 e 30, respectivamente. A dosagem de nitrito foi feita em sobrenadantes de monocamadas de macrófagos peritoniais infectados e tratados com as substâncias nas concentrações 10 e 100M. A G01 e a G02 estimularam a produção de NO2 nas duas concentrações, entretanto o resultado foi estatisticamente significativo para a G02 em 100M (p < 0,0001), a G05 só estimulou óxido nítrico na maior concentração. Todos os compostos da série R estimularam NO2, contudo, o resultado foi estatisticamente significativo para a R03 e R05 a 100M (p < 0,001). Adicionalmente, foi realizado uma análise preditiva in sílico de parâmetros farmacocinéticos das moléculas mais ativas in vitro, utilizando o software admetSAR. Os dados obtidos mostraram que de forma semelhante às suas moléculas originais a G01, G02 e R02 apresentaram alta capacidade de serem absorvidas pelo trato gastrointestinal, baixo potencial hepatotoxico e carcinogênico. Juntos, esses dados demonstram que essas moléculas são seletivamente tóxicas para o parasito com potencial para serem testadas pela via oral em estudos em modelo experimental de infecção.