Études structurales par résonance magnétique nucléaire du ribozyme VS de Neurospora

Le ribozyme VS de Neurospora catalyse des réactions de clivage et de ligation d’un lien phosphodiester spécifique essentielles à son cycle de réplication. Il est formé de six régions hélicales (I à VI), qui se divisent en deux domaines, soit le substrat (SLI) et le domaine catalytique (tiges II à VI). Ce dernier comprend deux jonctions à trois voies qui permettent de reconnaître le substrat en tige-boucle de façon spécifique. Ce mode de reconnaissance unique pourrait être exploité pour cibler des ARN repliés pour diverses applications. Bien que le ribozyme VS ait été caractérisé biochimiquement de façon exhaustive, aucune structure à haute résolution du ribozyme complet n’a encore été publiée, ce qui limite la compréhension des mécanismes inhérents à son fonctionnement. Précédemment, une approche de divide-and-conquer a été initiée afin d’étudier la structure des sous-domaines importants du ribozyme VS par spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN) mais doit être complétée. Dans le cadre de cette thèse, les structures de la boucle A730 et des jonctions III-IV-V et II-III-VI ont été déterminées par spectroscopie RMN hétéronucléaire. De plus, une approche de spectroscopie RMN a été développée pour la localisation des ions divalents, tandis que diverses approches de marquage isotopique ont été implémentées pour l’étude d’ARN de plus grandes tailles. Les structures RMN de la boucle A730 et des deux jonctions à trois voies révèlent que ces sous-domaines sont bien définis, qu’ils sont formés de plusieurs éléments structuraux récurrents (U-turn, S-turn, triplets de bases et empilement coaxial) et qu’ils contiennent plusieurs sites de liaison de métaux. En outre, un modèle du site actif du ribozyme VS a été construit sur la base des similarités identifiées entre les sites actifs des ribozymes VS et hairpin. Dans l’ensemble, ces études contribuent de façon significative à la compréhension de l’architecture globale du ribozyme VS. De plus, elles permettront de construire un modèle à haute résolution du ribozyme VS tout en favorisant de futures études d’ingénierie.

Space and time characterization of laser-induced plasmas for applications in chemical analysis and thin film deposition

Après des décennies de développement, l'ablation laser est devenue une technique importante pour un grand nombre d'applications telles que le dépôt de couches minces, la synthèse de nanoparticules, le micro-usinage, l’analyse chimique, etc. Des études expérimentales ainsi que théoriques ont été menées pour comprendre les mécanismes physiques fondamentaux mis en jeu pendant l'ablation et pour déterminer l’effet de la longueur d'onde, de la durée d'impulsion, de la nature de gaz ambiant et du matériau de la cible. La présente thèse décrit et examine l'importance relative des mécanismes physiques qui influencent les caractéristiques des plasmas d’aluminium induits par laser. Le cadre général de cette recherche forme une étude approfondie de l'interaction entre la dynamique de la plume-plasma et l’atmosphère gazeuse dans laquelle elle se développe. Ceci a été réalisé par imagerie résolue temporellement et spatialement de la plume du plasma en termes d'intensité spectrale, de densité électronique et de température d'excitation dans différentes atmosphères de gaz inertes tel que l’Ar et l’He et réactifs tel que le N2 et ce à des pressions s’étendant de 10‾7 Torr (vide) jusqu’à 760 Torr (pression atmosphérique). Nos résultats montrent que l'intensité d'émission de plasma dépend généralement de la nature de gaz et qu’elle est fortement affectée par sa pression. En outre, pour un délai temporel donné par rapport à l'impulsion laser, la densité électronique ainsi que la température augmentent avec la pression de gaz, ce qui peut être attribué au confinement inertiel du plasma. De plus, on observe que la densité électronique est maximale à proximité de la surface de la cible où le laser est focalisé et qu’elle diminue en s’éloignant (axialement et radialement) de cette position. Malgré la variation axiale importante de la température le long du plasma, on trouve que sa variation radiale est négligeable. La densité électronique et la température ont été trouvées maximales lorsque le gaz est de l’argon et minimales pour l’hélium, tandis que les valeurs sont intermédiaires dans le cas de l’azote. Ceci tient surtout aux propriétés physiques et chimiques du gaz telles que la masse des espèces, leur énergie d'excitation et d'ionisation, la conductivité thermique et la réactivité chimique. L'expansion de la plume du plasma a été étudiée par imagerie résolue spatio-temporellement. Les résultats montrent que la nature de gaz n’affecte pas la dynamique de la plume pour des pressions inférieures à 20 Torr et pour un délai temporel inférieur à 200 ns. Cependant, pour des pressions supérieures à 20 Torr, l'effet de la nature du gaz devient important et la plume la plus courte est obtenue lorsque la masse des espèces du gaz est élevée et lorsque sa conductivité thermique est relativement faible. Ces résultats sont confirmés par la mesure de temps de vol de l’ion Al+ émettant à 281,6 nm. D’autre part, on trouve que la vitesse de propagation des ions d’aluminium est bien définie juste après l’ablation et près de la surface de la cible. Toutefois, pour un délai temporel important, les ions, en traversant la plume, se thermalisent grâce aux collisions avec les espèces du plasma et du gaz.

Caractérisation des nanoparticules polymériques par la technique d'ultracentrifugation analytique

L’utilisation de nanoparticules (NPs) dans divers domaines industriels est de plus en plus fréquente ce qui génère leur propagation dans l’environnement. Selon leur persistance, mobilité, bioaccumulation et toxicité, des risques inconnus pour la santé et pour des écosystèmes peuvent en résulter. En effet, la caractérisation et la quantification sont des défis analytiques très complexes en raison de la nature dynamique (petite taille, grande réactivité et instabilité) des nanomatériaux. L'objectif de cette étude est donc de caractériser par ultracentrifugation analytique (AUC) des nanoparticules polymériques (Allosperse® dites allosphères) qui sont destinées à des fins agricoles. Pour y parvenir, différentes NPs métalliques (argent, quantum dot), oxydes métalliques (dioxyde de titane, oxyde de zinc) et NPs de polystyrène ont d’abord été mesurés par AUC à l’aide des différents systèmes de détection (absorbance, fluorescence et interférence). Dans le cas des allosphères, un grand nombre d'essais préliminaires ont été réalisés afin d'optimiser la vitesse d'ultracentrifugation, le temps d'ultracentrifugation, le nombre de numérisations et la concentration de l'échantillon. Un protocole optimisé a été utilisé pour la détermination du diamètre hydrodynamique (dh) des NPs. Les différentes analyses qui ont été réalisées dans cette étude révèlent que l’AUC permet de déterminer la taille de très petites NPs. Par ailleurs, une étude du comportement de ces allosphères pour des pH entre 4-8, des forces ioniques de 0 à 500 mM, en présence ou absence de matière organique naturelle a été entreprise. Les travaux ont montré que le dH était d’environ 7,0 nm avec de petites augmentations à faible pH, ou à très grande force ionique ou dureté. Ces résultats indiquent la grande stabilité physique et chimique des allosphères qui auront, ainsi, une grande mobilité dans les sols. La diffusion de lumière dynamique et la spectroscopie de corrélation de fluorescence ont été utilisées afin de valider les résultats obtenus par l’AUC.

Design de nouvelles fonctionnelles en théorie de la fonctionnelle de la densité et conception de polymères pour application à la photovoltaïque organique

La présente thèse porte sur les calculs utilisant la théorie de la fonctionnelle de la densité (DFT) pour simuler des systèmes dans lesquels les effets à longue portée sont importants. Une emphase particulière est mise sur les calculs des énergies d’excitations, tout particulièrement dans le cadre des applications photovoltaïques. Cette thèse aborde ces calculs sous deux angles. Tout d’abord, des outils DFT déjà bien établis seront utilisés pour simuler des systèmes d’intérêt expérimental. Par la suite, la théorie sous-jacente à la DFT sera explorée, ses limites seront identifiées et de nouveaux développements théoriques remédiant à ceux-ci seront proposés. Ainsi, dans la première partie de cette thèse, des calculs numériques utilisant la DFT et la théorie de la fonctionnelle de la densité dépendante du temps (TDDFT) telles qu’implémentées dans le logiciel Gaussian [1] sont faits avec des fonctionnelles courantes sur des molécules et des polymères d’intérêt expérimental. En particulier, le projet présenté dans le chapitre 2 explore l’utilisation de chaînes latérales pour optimiser les propriétés électroniques de polymères déjà couramment utilisés en photovoltaïque organique. Les résultats obtenus montrent qu’un choix judicieux de chaînes latérales permet de contrôler les propriétés électroniques de ces polymères et d’augmenter l’efficacité des cellules photovoltaïques les utilisant. Par la suite, le projet présenté dans le chapitre 3 utilise la TDDFT pour explorer les propriétés optiques de deux polymères, le poly-3-hexyl-thiophène (P3HT) et le poly-3-hexyl- sélénophène (P3HS), ainsi que leur mélange, dans le but d’appuyer les observations expérimentales indiquant la formation d’exciplexe dans ces derniers. Les calculs numériques effectués dans la première partie de cette thèse permettent de tirer plusieurs conclusions intéressantes, mais mettent également en évidence certaines limites de la DFT et de la TDDFT pour le traitement des états excités, dues au traitement approximatif de l’interaction coulombienne à longue portée. Ainsi, la deuxième partie de cette thèse revient aux fondements théoriques de la DFT. Plus précisément, dans le chapitre 4, une série de fonctionnelles modélisant plus précisément l’interaction coulombienne à longue portée grâce à une approche non-locale est élaborée. Ces fonctionnelles sont basées sur la WDA (weighted density approximation), qui est modifiée afin d’imposer plusieurs conditions exactes qui devraient être satisfaites par le trou d’échange. Ces fonctionnelles sont ensuite implémentées dans le logiciel Gaussian [1] et leurs performances sont évaluées grâce à des tests effectués sur une série de molécules et d’atomes. Les résultats obtenus indiquent que plusieurs de ces fonctionnelles donnent de meilleurs résultats que la WDA. De plus, ils permettrent de discuter de l’importance relative de satisfaire chacune des conditions exactes.

Azabicycloalkanone synthesis by transannular cyclization

Une stratégie de synthèse efficace de différents composés de type azabicyclo[X.Y.0]alkanone fonctionnalisés a été développée. La stratégie synthétique implique la préparation de dipeptides par couplage avec des motifs vinyl-, allyl-, homoallyl- et homohomoallylglycine suivi d’une réaction de fermeture de cycle par métathèse permettant d’obtenir des lactames macrocycliques de 8, 9 et 10 membres, qui subissent une iodolactamisation transannulaire menant à l’obtention de mimes peptidiques bicycliques portant un groupement iode. Des couplages croisés catalysés par des métaux de transition ont été développés pour la synthèse d’acides aminés ω-insaturés énantiomériquement purs à partir de l’iodoanaline. L’étude du mécanisme suggère que l’iodure subit une attaque du coté le moins stériquement encombré de la lactame macrocyclique insaturée pour mener à l’obtention d’un intermédiaire iodonium. La cyclisation se produit ensuite par une route minimisant les interactions diaxiales et la tension allylique. L’iodolactamisation des différentes lactames macrocycliques insaturées a mené à l’obtention regio- et diastéréosélective d’acides aminés 5,5- et 6,6-iodobicycicliques. De plus, une imidate azabicyclo[4.3.1]alkane pontée de type anti-Bredt fut synthétisée à partir d’une lactame macrocyclique insaturé à neuf membres. Les analyses cristallographiques et spectroscopiques des macrocycles à 8, 9 et 10 membres, du composé iodobicyclique 5,5 ainsi que de l’imidate pontée, montrent bien le potentiel de ces dipeptides rigidifiés de servir en tant que mimes des résidus centraux de tours β de type I, II’, II et VI.

New grafted PLA-g-PEG polymeric nanoparticles used to improve bioavailability of oral drugs.

Les nanoparticules (NPs) de polymère ont montré des résultats prometteurs pour leur utilisation comme système de transport de médicaments pour une libération contrôlée du médicament, ainsi que pour du ciblage. La biodisponibilité des médicaments administrés oralement pourrait être limitée par un processus de sécrétion intestinale, qui pourrait par la suite être concilié par la glycoprotéine P (P-gp). La dispersion de la Famotidine (modèle de médicament) à l’intérieur des nanoparticules (NPs) pegylées a été évaluée afin d’augmenter la biodisponibilité avec du polyéthylène glycol (PEG), qui est connu comme un inhibiteur de P-gp. L’hypothèse de cette étude est que l’encapsulation de la Famotidine (un substrat de P-gp) à l’intérieur des NPs préparées à partir de PEG-g-PLA pourrait inhiber la fonction P-gp. La première partie de cette étude avait pour but de synthétiser quatre copolymères de PEG greffés sur un acide polylactide (PLA) et sur un squelette de polymère (PLA-g-PEG), avec des ratios de 1% et 5% (ratio molaire de PEG vs acide lactique monomère) de soit 750, soit 2000 Da de masse moléculaire. Ces polymères ont été employés afin de préparer des NPs chargés de Famotidine qui possède une faible perméabilité et une solubilité aqueuse relativement basse. Les NPs préparées ont été analysées pour leur principaux paramètres physicochimiques tels que la taille et la distribution de la taille, la charge de surface (Potentiel Zeta), la morphologie, l’efficacité d’encapsulation, le pourcentage résiduel en alcool polyvinylique (PVA) adsorbé à la surface des NPs, les propriétés thermiques, la structure cristalline et la libération du médicament. De même, les formules de NPs ont été testées in vitro sur des cellules CaCo-2 afin dʼévaluer la perméabilité bidirectionnelle de la Famotidine. Généralement, les NPs préparées à partir de polymères greffés PLA-g-5%PEG ont montré une augmentation de la perméabilité du médicament, ce par l’inhibition de l’efflux de P-gp de la Famotidine dans le modèle CaCo-2 in vitro. Les résultats ont montré une baisse significative de la sécrétion de la Famotidine de la membrane basolatéral à apical lorsque la Famotidine était encapsulée dans des NPs préparées à partir de greffes de 5% PEG de 750 ou 2000 Da, de même que pour d’autres combinaisons de mélanges physiques contenant du PEG5%. La deuxième partie de cette étude est à propos de ces NPs chargées qui démontrent des résultats prometteurs en termes de perméabilité et d’inhibition d’efflux de P-gp, et qui ont été choises pour développer une forme orale solide. La granulation sèche a été employée pour densifier les NPs, afin de développer des comprimés des deux formules sélectionnées de NPs. Les comprimés à base de NPs ont démontré un temps de désintégration rapide (moins d’une minute) et une libération similaire à la Famotidine trouvée sur le marché. Les résultats de l’étude du transport de comprimés à base de NPs étaient cohérents avec les résultats des formules de NPs en termes d’inhibition de P-gp, ce qui explique pourquoi le processus de fabrication du comprimé n’a pas eu d’effet sur les NPs. Mis ensemble, ces résultats montrent que l’encapsulation dans une NP de polymère pegylé pourrait être une stratégie prometteuse pour l’amélioration de la biodisponibilité des substrats de P-gp.

Agglomération et hétéroagglomération des nanoparticules d'argent en eaux douces

Les nanomatériaux sont une classe de contaminants qui est de plus en plus présent dans l’environnement. Leur impact sur l’environnement dépendra de leur persistance, mobilité, toxicité et bioaccumulation. Chacun de ces paramètres dépendra de leur comportement physicochimique dans les eaux naturelles (i.e. dissolution et agglomération). L’objectif de cette étude est de comprendre l’agglomération et l’hétéroagglomération des nanoparticules d’argent dans l’environnement. Deux différentes sortes de nanoparticules d’argent (nAg; avec enrobage de citrate et avec enrobage d’acide polyacrylique) de 5 nm de diamètre ont été marquées de manière covalente à l’aide d’un marqueur fluorescent et ont été mélangées avec des colloïdes d’oxyde de silice (SiO2) ou d’argile (montmorillonite). L’homo- et hétéroagglomération des nAg ont été étudiés dans des conditions représentatives d’eaux douces naturelles (pH 7,0; force ionique 10 7 à 10-1 M de Ca2+). Les tailles ont été mesurées par spectroscopie de corrélation par fluorescence (FCS) et les résultats ont été confirmés à l’aide de la microscopie en champ sombre avec imagerie hyperspectrale (HSI). Les résultats ont démontrés que les nanoparticules d’argent à enrobage d’acide polyacrylique sont extrêmement stables sous toutes les conditions imposées, incluant la présence d’autres colloïdes et à des forces ioniques très élevées tandis que les nanoparticules d’argent avec enrobage de citrate ont formées des hétéroagrégats en présence des deux particules colloïdales.

Greffage irréversible de polyélectrolytes sur des substrats de silice et de mica et étude des propriétés de surface et de gonflement

Le protocole pour le greffage irréversible du copolymère amphiphile polystyrène-b-poly (acrylate de sodium) PS-b-PANa, sur un substrat de mica et de silice hydrophobe a été développé, en utilisant la méthode de greffage à partir de solution. Les propriétés de surface du bloc chargé ont été évaluées. L’effet de la force ionique sur le gonflement des chaînes a été investigué par ellipsométrie. Les forces d’interaction entre les surfaces recouvertes du copolymère ont été évaluées par la technique SFA. Les profils de force ont démontré être stables et nettement répulsifs en compression et décompression, montrant l’irréversibilité du greffage. Les forces de frottement entre les brosses de PANa sont élevées, mais aucune évidence d’endommagement de la surface n’a été observée. La comparaison entre le comportement à la surface des chaînes de l’acide polyacrylique PAA et celles du PANa, obtenues par deux méthodes de greffage différentes, est également investiguée.

Étude de tour béta actif dans les modulateurs allostériques du récepteur de la prostaglandine F2alpha

La naissance avant terme constitue un important problème de santé périnatale partout dans le monde. Chaque année près de 15 millions de bébés naissent prématurément. Notre laboratoire s’intéresse depuis une décennie à la conception et le développement de nouvelles classes thérapeutiques (appelés agents tocolytiques) capables d’inhiber les contractions utérines et prolonger le temps de gestation. Due à son implication directe dans le déclanchement des contractions utérines, la prostaglandine F2α (FP) est devenue notre cible de choix. Le PDC 113.824 et aza-glycinyl-proline sont apparus comme des inhibiteurs allostériques puissants du récepteur de la prostaglandine F2α, capables de prolonger la durée de gestation chez les souris. Le travail réalisé au cours de ce mémoire a pour objectif d’étudier le tour β nécessaire pour la reconnaissance sur le récepteur de la prostaglandine F2α. Dans la conception de mime peptidique sélectif efficace et puissant, le repliement β est un élément structural essentiel pour le maintien ou l’amélioration de l’activité du mime peptidique. Les études conformationelles du PDC113.824 et l’aza-glycinyl-proline montrent que les squelettes centraux de ces mimes peptidiques pourraient adopter essentiellement un tour β de type I ou II`, ce qui suggère l’implication des deux types de tours dans l’activité biologique. La synthèse de mimes peptidiques adoptant le tour β de type I et II` est devenue une stratégie logique dans la recherche de nouveaux agents tocolytiques. Au cours de ces études quatre analogues du PDC113.824 ont été synthétisés, un azabicyclo[5.3.0]alkanone et un dipeptide macrocyclique (mimes du tours β de type I) pour étudier l’implication du tour β type I. Par la suite la synthèse de glycinyl-proline et le D-alaninyl-proline (des mimes du tour β du type II`) a été réalisée afin de valider l’implication du tour β type II` dans la reconnaissance sur le récepteur. Nous avons utilisé une stratégie de synthèse efficace pour obtenir les deux analogues (azabicyclo [5.3.0]alkanone et dipeptides macrocycles) à partir d’un intermédiaire commun, en procédant par une cyclisation transannulaire diastéréosélective du tétra-peptide.

Lactide polymerization with iron alkoxide complexes

Les essais préliminaires pour préparer des alcoolates de fer à partir du bichlorure ou bibromure de fer (II), en les combinant avec des ligands de type diimino pyridine, ont engendré la formation de complexes homoleptiques et hétéroleptiques, dépendant des substituants sur les branches imines du ligand. Ces complexes homoleptiques octaédriques et paramagnétiques ont été étudiés par rapport à leurs propriétés spectroscopiques et cristallographiques. De plus, la synthèse des complexes de fer hétéroleptique a engendré de bons précurseurs penta-coordonnés pour les réactions de substitution de ligands avec des alcoolates de métaux alcalins, de manière à produire les dialcoolates de fer (II) désirés. Des techniques d’analyse telles que la spectroscopie UV-vis, l’analyse élémentaire, la spectrométrie de masse à haute résolution et la cristallographie aux rayons X ont été utilisées pour caractériser ces complexes de fer. L’activité catalytique de ces complexes de fer (II) a aussi été étudiée par rapport à la polymérisation du lactide; les dialcoolates convoités ont été générés in-situ en raison de la difficulté à produire et à isoler les dérivés alcoolates des complexes diimino pyridine de fer. Une étude approfondie a aussi été faite sur les réactions de polymérisation, surtout par rapport aux valeurs de conversion à l’échelle du temps, ainsi qu’à la tacticité des chaines de polymères obtenues. Ces analyses ont été effectuées par l’entremise de la spectroscopie de résonance magnétique nucléaire, de la chromatographie d’exclusion stérique, et de la spectrométrie de masse MALDI (désorption-ionisation laser assistée par matrice).

Progrès vers la synthèse totale de l'hodgsonox

Ce mémoire présente une poursuite de l’étude vers la synthèse de l’hodgsonox, un sesquiterpénoïde naturel possédant des propriétés insecticides contre la mouche verte d’Australie, Lucilia cuprina. L’hodgsonox comporte six centres stéréogènes et trois cycles : un époxyde fusionné à un cycle à cinq chaînons et une fonction éther cyclique à six chaînons doublement allylique. La stratégie de synthèse de l’hodgsonox proposée comporte dix-neuf étapes linéaires. Elle s’appuie sur les travaux préliminaires de Lise Bréthous, étudiante au doctorat, de Nicolas Lévaray, étudiant à la maîtrise, ainsi que du Dr. Ying Dong Lu et de la Dr. Sonia Diab, qui ont tous travaillé précédemment dans le groupe de la Pr. Lebel. La première étape de cette synthèse consiste en une hydrogénation cinétique dynamique de Noyori permettant d’obtenir un seul diastéréoisomère à partir de l’α-acétylbutyrolactone. Une séquence de six étapes linéaires supplémentaires, comprenant l’ouverture de la lactone ainsi qu’une métathèse d’oléfine, permet d’obtenir le cycle à cinq chaînons avec un rendement global de 37%. L’unité isopropyle est par la suite installée par une addition conjuguée pour former un éther d’énol silylé, qui est directement oxydé en la cétone correspondante avec l’acétate de palladium(II). Une réaction d’hydrosilylation subséquente permet d’obtenir la stéréochimie syn attendue de l’unité isopropyle. Par la suite, la carbonylation d’un intermédiaire triflate permet d’obtenir le squelette de base pour la formation de l’éther cyclique. Enfin, le cycle à six chaînons est formé par insertion O−H intramoléculaire d’un diazo avec un rendement global de 2% sur 17 étapes. Les travaux spécifiques de l’auteure comprennent l’évaluation de conditions catalytiques pour l’oxydation de Saegusa de l’éther d’énol silylé. Les trois dernières étapes ont également été explorées par l’auteure. Il s’agit de l’époxydation de la double liaison endocyclique, de l’insertion dans un lien O−H catalysée par un dimère de rhodium, et de la méthylénation. Enfin, l’exploration d’une voie alternative a été entamée. Cette nouvelle voie consiste à former l’éther cyclique par une substitution nucléophile sur un époxyde. La double liaison exo-cyclique serait installée par une simple réaction de déshydratation.

Uncovering the role of misfolded SOD1 in the pathogenesis of Amyotrophic Lateral Sclerosis

La sclérose latérale amyothrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative charactérisée par la perte des neurones moteurs menant à la paralysie et à la mort. Environ 20% des cas familiaux de la SLA sont causés par des mutations de la superoxyde dismutase 1 (SOD1), conduisant vers un mauvais repliement de la protéine SOD1, ce qui a comme conséquence un gain de fonction toxique. Plusieurs anticorps spécifiques pour la forme mal repliée de la protéine ont été générés et utilisés comme agent thérapeutique dans des modèles précliniques. Comment le mauvais repliement de SOD1 provoque la perte sélective des neurones moteurs demeure non résolu. La morphologie, le bilan énergétique et le transport mitochondrial sont tous documentés dans les modèles de la SLA basés sur SOD1, la détérioration des mitochondries joue un rôle clé dans la dégénération des neurones moteurs. De plus, la protéine SOD1 mal repliée s’associe sélectivement sur la surface des mitochondries de la moelle épinière chez les modèles de rongeurs de la SLA. Notre hypothèse est que l’accumulation de la protéine SOD1 mal repliée sur les mitochondries pourrait nuire aux fonctions mitochondriales. À cette fin, nous avons développé un nouvel essai par cytométrie de flux afin d’isoler les mitochondries immunomarquées avec des anticorps spécifiques à la forme malrepliée de SOD1 tout en évaluant des aspects de la fonction mitochondriale. Cette méthode permettra de comparer les mitochondries portant la protéine SOD1 mal repliée à celles qui ne la portent pas. Nous avons utilisé un anticorps à conformation spécifique de SOD1, B8H10, pour démontrer que la protéine mal repliée SOD1 s’associe avec les mitochondries de la moelle épinière des rat SOD1G93A d’une manière dépendante du temps. Les mitochondries avec la protéine mal repliée SOD1 B8H10 associée à leur surface (B8H10+) ont un volume et une production excessive de superoxyde significativement plus grand, mais possèdent un potentiel transmembranaire comparable aux mitochondries B8H10-. En outre, la présence de la protéine mal repliée SOD1 reconnue par B8H10 coïncide avec des niveaux plus élevés de la forme pro-apoptotique de Bcl-2. L’immunofluorescence de sections de moelle épinière du niveau lombaire avec l’anticorps spécifique à la conformation B8H10 et AMF7-63, un autre anticorps conformationnel spécifique de SOD1, démontre des motifs de localisations distincts. B8H10 a été trouvé principalement dans les neurones moteurs et dans plusieurs points lacrymaux dans tout le neuropile. Inversement, AMF7-63 a marqué les neurones moteurs ainsi qu’un réseau fibrillaire distinctif concentré dans la corne antérieure. Au niveau subcellulaire, SOD1 possèdant la conformation reconnu par AMF7-63 est aussi localisée sur la surface des mitochondries de la moelle épinière d’une manière dépendante du temps. Les mitochondries AMF7-63+ ont une augmentation du volume comparé aux mitochondries B8H10+ et à la sous-population non marquée. Cependant, elles produisent une quantité similaire de superoxyde. Ensemble, ces données suggèrent qu’il y a plusieurs types de protéines SOD1 mal repliées qui convergent vers les mitochondries et causent des dommages. De plus, différentes conformations de SOD1 apportent une toxicité variable vers les mitochondries. Les protéines SOD1 mal repliées réagissant à B8H10 et AMF7-63 sont présentes en agrégats dans les fractions mitochondriales, nous ne pouvons donc pas prendre en compte leurs différents effets sur le volume mitochondrial. Les anticorps conformationnels sont des outils précieux pour identifier et caractériser le continuum du mauvais repliement de SOD1 en ce qui concerne les caractéristiques biochimiques et la toxicité. Les informations présentes dans cette thèse seront utilisées pour déterminer le potentiel thérapeutique de ces anticorps.

Fonction de la protéine Ceroid lipofuscinosis neuronal 5 (CLN5) dans le tri et le recyclage à l’endosome

Le tri et le transport efficace des hydrolases acides vers le lysosome jouent un rôle critique pour la fonction des cellules. Plus de 50 maladies humaines sont dues à des mutations des enzymes lysosomales, des protéines régulant des processus-clés du transport vers le lysosome ou des enzymes effectuant des modifications posttraductionnelles importantes pour la fonction du lysosome. L’objectif de cette thèse est d’identifier des protéines et des mécanismes permettant à la cellule de réguler le transport des enzymes vers le lysosome. Nous avons formulé l’hypothèse que des protéines mutées dans des maladies lysosomales et dont les fonctions étaient inconnues pouvaient jouer un rôle dans le transport vers le lysosome. Les céroïdes-lipofuscinoses neuronales forment une famille de maladies lysosomales rares mais sont aussi les maladies neurodégénératives infantiles les plus fréquentes. Plusieurs gènes impliqués dans les NCL encodent des protéines aux fonctions inconnues. Les travaux présentés dans cette thèse ont identifié la protéine « ceroid lipofuscinosis neuronal-5 » (CLN5) qui est localisée à l’endosome et au lysosome comme élément nécessaire au recrutement et à l’activation de rab7. Rab7 est une protéine Rab-clé qui contrôle le trafic à l’endosome tardif. Cette petite GTPase est impliquée dans le recrutement de retromer, un complexe protéique qui régule le trafic de l’endosome vers l’appareil de Golgi des récepteurs de tri lysosomal comme sortilin et le récepteur du mannose-6-phosphate. Dans les cellules où CLN5 est déplété, les récepteurs de tri lysosomal sont moins recyclés plus rapidement dégradés. En utilisant des expériences de photomarquage nous avons aussi pu démontrer que Rab7 est moins activées en l’absence de CLN5. Pour exécuter leur fonction les protéines rabs doivent être recrutée à la membrane et activées par l’échange d’une molécule de GDP pour une molécule de GTP. Le recrutement des Rabs à la membrane nécessite une modification posttraductionnelle lipidique pour être facilités. En utilisant un modèle de levures nous avons démontré que l’homologue de Rab7, Ypt7 est palmitoylée. Nous avons aussi démontré que la palmitoyltransférase Swif1 est nécessaire au recrutement de Ypt7 à la membrane. Nous avons aussi remarqué que les sous- unités de retromer chez la levure sont moins recrutées lorsque les palmitoyltransférases sont déplétées. Dans les cellules de mammifères nous avons démontré que Rab7 est également palmitoylé et que cette palmitoylation est possiblement effectuée par les palmitoyltransférases DHHC1 et DHHC8. La palmitoylation de Rab7 a lieu sur les cystéines en C-terminal qui sont nécessaires au recrutement membranaire et qui auparavant étaient uniquement décrites comme prénylées. En utilisant la méthode de « click chemistry » nous avons découvert que lorsque la prénylation de Rab7 est bloquée le niveau de palmitoylation augmente. Pour caractériser l’interaction entre CLN5 et Rab7 nous avons performé des expériences afin d’établir définitivement la topologie de cette protéine. Nous avons ainsi démontré que CLN5 est une protéine hautement glycosylée qui est initialement traduite en protéine transmembranaire et subséquemment clivée par un membre de la famille des peptidase de peptide signal (SPP). Cette protéine soluble peut alors possiblement interagir avec CLN3 qui est aussi palmitoylée pour recruter et activer Rab7. Nos études suggèrent pour la première fois que CLN5 pourrait être un recruteur et un activateur de Rab7 qui agirait avec la protéine CLN3 pour séquestrer Rab7 avec les autres récepteurs palmitoylés et permettre leur recyclage vers l’appareil de Golgi.

Development of a Phase Separation Strategy in Macrocyclization Reactions

La réaction de macrocyclisation est une transformation fondamentale en chimie organique de synthèse. Le principal défi associcé à la formation de macrocycles est la compétition inhérente avec la réaction d’oligomérisation qui mène à la formation de sousproduits indésirables. De plus, l’utilisation de conditions de dilutions élevées qui sont nécessaires afin d’obtenir une cyclisation “sélective”, sont souvent décourageantes pour les applications à l’échelle industrielle. Malgré cet intérêt pour les macrocycles, la recherche visant à développer des stratégies environnementalement bénignes, qui permettent d’utiliser des concentrations normales pour leur synthèse, sont encore rares. Cette thèse décrit le développement d’une nouvelle approche générale visant à améliorer l’efficacité des réactions de macrocyclisation en utilisant le contrôle des effets de dilution. Une stratégie de “séparation de phase” qui permet de réaliser des réactions à des concentrations plus élevées a été developpée. Elle se base sur un mélange de solvant aggrégé contrôlé par les propriétés du poly(éthylène glycol) (PEG). Des études de tension de surface, spectroscopie UV et tagging chimique ont été réalisées afin d’élucider le mécanisme de “séparation de phase”. Il est proposé que celui-ci fonctionne par diffusion lente du substrat organique vers la phase ou le catalyseur est actif. La nature du polymère co-solvant joue donc un rôle crutial dans le contrôle de l’aggrégation et de la catalyse La stratégie de “séparation de phase” a initiallement été étudiée en utilisant le couplage oxidatif d’alcynes de type Glaser-Hay co-catalysé par un complexe de cuivre et de nickel puis a été transposée à la chimie en flux continu. Elle fut ensuite appliquée à la cycloaddition d’alcynes et d’azotures catalysée par un complexe de cuivre en “batch” ainsi qu’en flux continu.

Agrégation de tensioactifs anioniques à une interface solide-aqueux induite par l'oxydation d'une monocouche auto-assemblée de ferrocenylalkanethiolates

L'oxydoréduction des monocouches auto-assemblées («Self-assembled monolayers ou SAMs) de ferrocenyldodecanethiolates sur une surface d'or (Fc(CH2)12SAu) dans des solutions aqueuses de n-alkyle sulfate de sodium (6, 8, 10 et 12 atomes de carbone) est étudiée par spectroscopie de résonance des plasmons de surface («Surface Plasmons Resonance ou SPR) couplée avec de la voltampérométrie cyclique (VC). La technique SPR est utilisée pour suivre en temps réel l'adsorption des tensioactifs en fonction du potentiel appliqué. Elle permet de quantifier l'épaisseur et le recouvrement des molécules adsorbées pour déterminer l'organisation des tensioactifs anioniques sur la SAM. La VC est utilisée afin de caractériser l'oxydation du groupement ferrocène en présence des n-alkyle sulfate de sodium qui s'associent à la SAM grâce à l'appariement entre le ferrocénium et le groupement sulfate. Des mélanges binaires d'alkylesulfates de différentes compositions sont utilisés dans le but de déterminer l'organisation induite par une réaction d'oxydoréduction. L'effet de la longueur de la chaîne d'hydrocarbures sur la quantité de tensioactifs anioniques adsorbés ainsi que les affinités relatives d'appariement des anions alkyle sulfate aux ferrocéniums sont rapportés dans ce mémoire. Ces surfaces électrosensibles permettront la détection de molécules amphiphiles et la compréhension du comportement de mélanges binaires de tensioactifs. Ainsi, ces travaux apporteront une avancée sur la modulation électrochimique de l'organisation de matériaux sur des substrats solides basée sur l'appariement d'ions.