Demonstration of helicase activity in the nonstructural protein, NSs, of the negative-sense RNA virus, Groundnut bud necrosis virus

The nonstructural protein NSs, encoded by the S RNA of groundnut bud necrosis virus (GBNV) (genus Tospovirus, family Bunyaviridae) has earlier been shown to possess nucleic-acid-stimulated NTPase and 50 a phosphatase activity. ATP hydrolysis is an essential function of a true helicase. Therefore, NSs was tested for DNA helicase activity. The results demonstrated that GBNV NSs possesses bidirectional DNA helicase activity. An alanine mutation in the Walker A motif (K189A rNSs) decreased DNA helicase activity substantially, whereas a mutation in the Walker B motif resulted in a marginal decrease in this activity. The parallel loss of the helicase and ATPase activity in the K189A mutant confirms that NSs acts as a non-canonical DNA helicase. Furthermore, both the wild-type and K189A NSs could function as RNA silencing suppressors, demonstrating that the suppressor activity of NSs is independent of its helicase or ATPase activity. This is the first report of a true helicase from a negative-sense RNA virus.

Targeted Modifications in Adeno-Associated Virus Serotype 8 Capsid Improves Its Hepatic Gene Transfer Efficiency In Vivo

Recombinant adeno-associated virus vectors based on serotype 8 (AAV8) have shown significant promise for liver-directed gene therapy. However, to overcome the vector dose dependent immunotoxicity seen with AAV8 vectors, it is important to develop better AAV8 vectors that provide enhanced gene expression at significantly low vector doses. Since it is known that AAV vectors during intracellular trafficking are targeted for destruction in the cytoplasm by the host-cellular kinase/ubiquitination/proteasomal machinery, we modified specific serine/threonine kinase or ubiquitination targets on the AAV8 capsid to augment its transduction efficiency. Point mutations at specific serine (S)/threonine (T)/lysine (K) residues were introduced in the AAV8 capsid at the positions equivalent to that of the effective AAV2 mutants, generated successfully earlier. Extensive structure analysis was carried out subsequently to evaluate the structural equivalence between the two serotypes. scAAV8 vectors with the wild-type (WT) and each one of the S/T -> Alanine (A) or K-Arginine (R) mutant capsids were evaluated for their liver transduction efficiency in C57BL/6 mice in vivo. Two of the AAV8-S -> A mutants (S279A and S671A), and a K137R mutant vector, demonstrated significantly higher enhanced green fluorescent protein (EGFP) transcript levels (similar to 9- to 46-fold) in the liver compared to animals that received WT-AAV8 vectors alone. The best performing AAV8 mutant (K137R) vector also had significantly reduced ubiquitination of the viral capsid, reduced activation of markers of innate immune response, and a concomitant two-fold reduction in the levels of neutralizing antibody formation in comparison to WT-AAV8 vectors. Vector bio-distribution studies revealed that the K137R mutant had a significantly higher and preferential transduction of the liver (106 vs. 7.7 vector copies/mouse diploid genome) when compared to WT-AAV8 vectors. To further study the utility of the K137R-AAV8 mutant in therapeutic gene transfer, we delivered human coagulation factor IX (h. FIX) under the control of liver-specific promoters (LP1 or hAAT) into C57BL/6 mice. The circulating levels of h. FIX: Ag were higher in all the K137R-AAV8 treated groups up to 8 weeks post-hepatic gene transfer. These studies demonstrate the feasibility of the use of this novel AAV8 vectors for potential gene therapy of hemophilia B.

A Multiantigenic DNA Vaccine That Induces Broad Hepatitis C Virus-Specific T-Cell Responses in Mice

There are 3 to 4 million new hepatitis C virus (HCV) infections annually around the world, but no vaccine is available. Robust T-cell mediated responses are necessary for effective clearance of the virus, and DNA vaccines result in a cell-mediated bias. Adjuvants are often required for effective vaccination, but during natural lytic viral infections damage-associated molecular patterns (DAMPs) are released, which act as natural adjuvants. Hence, a vaccine that induces cell necrosis and releases DAMPs will result in cell-mediated immunity (CMI), similar to that resulting from natural lytic viral infection. We have generated a DNA vaccine with the ability to elicit strong CMI against the HCV nonstructural (NS) proteins (3, 4A, 4B, and 5B) by encoding a cytolytic protein, perforin (PRF), and the antigens on a single plasmid. We examined the efficacy of the vaccines in C57BL/6 mice, as determined by gamma interferon enzyme-linked immunosorbent spot assay, cell proliferation studies, and intracellular cytokine production. Initially, we showed that encoding the NS4A protein in a vaccine which encoded only NS3 reduced the immunogenicity of NS3, whereas including PRF increased NS3 immunogenicity. In contrast, the inclusion of NS4A increased the immunogenicity of the NS3, NS4B, andNS5B proteins, when encoded in a DNA vaccine that also encoded PRF. Finally, vaccines that also encoded PRF elicited similar levels of CMI against each protein after vaccination with DNA encoding NS3, NS4A, NS4B, and NS5B compared to mice vaccinated with DNA encoding only NS3 or NS4B/5B. Thus, we have developed a promising ``multiantigen'' vaccine that elicits robust CMI. IMPORTANCE Since their development, vaccines have reduced the global burden of disease. One strategy for vaccine development is to use commercially viable DNA technology, which has the potential to generate robust immune responses. Hepatitis C virus causes chronic liver infection and is a leading cause of liver cancer. To date, no vaccine is currently available, and treatment is costly and often results in side effects, limiting the number of patients who are treated. Despite recent advances in treatment, prevention remains the key to efficient control and elimination of this virus. Here, we describe a novel DNA vaccine against hepatitis C virus that is capable of inducing robust cell-mediated immune responses in mice and is a promising vaccine candidate for humans.

A carboxy terminal domain of the L protein of rinderpest virus possesses RNA triphosphatase activity - The first enzyme in the viral mRNA capping pathway

The large protein L of negative-sense RNA viruses is a multifunctional protein involved in transcription and replication of genomic RNA. It also possesses enzymatic activities involved in capping and methylation of viral mRNAs. The pathway for mRNA capping followed by the L protein of the viruses in the Morbillivirus genus has not been established, although it has been speculated that these viruses may follow the unconventional capping pathway as has been shown for some viruses of Rhabdoviridae family. We had earlier shown that the large protein L of Rinderpest virus expressed as recombinant L-P complex in insect cells as well as the ribonucleoprotein complex from purified virus possesses RNA triphosphatase (RTPase) and guanylyltransferase activities, in addition to RNA dependent RNA polymerase activity. In the present work, we demonstrate that RTPase as well as nucleoside triphosphatase (NTPase) activities are exhibited by a subdomain of the L protein in the C terminal region (a.a. 1640 1840). The RTPase activity depends absolutely on a divalent cation, either magnesium or manganese. Both the RTPase and NTPase activities of the protein show dual metal specificity. Two mutant proteins having alanine mutations in the glutamic acid residues in motif-A of the RTPase domain did not show RTPase activity, while exhibiting reduced NTPase activity suggesting overlapping active sites for the two enzymatic functions. The RTPase and NTPase activities of the L subdomain resemble those of the Vaccinia capping enzyme D1 and the baculovirus LEF4 proteins. (C) 2015 Elsevier Inc. All rights reserved.

HuR Displaces Polypyrimidine Tract Binding Protein To Facilitate La Binding to the 3 ` Untranslated Region and Enhances Hepatitis C Virus Replication

HuR is a ubiquitous, RNA binding protein that influences the stability and translation of several cellular mRNAs. Here, we report a novel role for HuR, as a regulator of proteins assembling at the 3' untranslated region (UTR) of viral RNA in the context of hepatitis C virus (HCV) infection. HuR relocalizes from the nucleus to the cytoplasm upon HCV infection, interacts with the viral polymerase (NS5B), and gets redistributed into compartments of viral RNA synthesis. Depletion in HuR levels leads to a significant reduction in viral RNA synthesis. We further demonstrate that the interaction of HuR with the 3' UTR of the viral RNA affects the interaction of two host proteins, La and polypyrimidine tract binding protein (PTB), at this site. HuR interacts with La and facilitates La binding to the 3' UTR, enhancing La-mediated circularization of the HCV genome and thus viral replication. In addition, it competes with PTB for association with the 3' UTR, which might stimulate viral replication. Results suggest that HuR influences the formation of a cellular/viral ribonucleoprotein complex, which is important for efficient initiation of viral RNA replication. Our study unravels a novel strategy of regulation of HCV replication through an interplay of host and viral proteins, orchestrated by HuR. IMPORTANCE Hepatitis C virus (HCV) is highly dependent on various host factors for efficient replication of the viral RNA. Here, we have shown how a host factor (HuR) migrates from the nucleus to the cytoplasm and gets recruited in the protein complex assembling at the 3' untranslated region (UTR) of HCV RNA. At the 3' UTR, it facilitates circularization of the viral genome through interaction with another host factor, La, which is critical for replication. Also, it competes with the host protein PTB, which is a negative regulator of viral replication. Results demonstrate a unique strategy of regulation of HCV replication by a host protein through alteration of its subcellular localization and interacting partners. The study has advanced our knowledge of the molecular mechanism of HCV replication and unraveled the complex interplay between the host factors and viral RNA that could be targeted for therapeutic interventions.

Characterization of type I interferon pathway during hepatic differentiation of human pluripotent stem cells and hepatitis C virus infection

Pluripotent stem cells are being actively studied as a cell source for regenerating damaged liver. For long-term survival of engrafting cells in the body, not only do the cells have to execute liver-specific function but also withstand the physical strains and invading pathogens. The cellular innate immune system orchestrated by the interferon (IFN) pathway provides the first line of defense against pathogens. The objective of this study is to assess the innate immune function as well as to systematically profile the IFN-induced genes during hepatic differentiation of pluripotent stem cells. To address this objective, we derived endodermal cells (day 5 post-differentiation), hepatoblast (day 15) and hepatocyte-like cells (day 21) from human embryonic stem cells (hESCs). Day 5, 15 and 21 cells were stimulated with IFN-alpha and subjected to IFN pathway analysis. Transcriptome analysis was carried out by RNA sequencing. The results showed that the IFN-alpha treatment activated STAT-JAK pathway in differentiating cells. Transcriptome analysis indicated stage specific expression of classical and non-classical IFN-stimulated genes (ISGs). Subsequent validation confirmed the expression of novel ISGs including RASGRP3, CLMP and TRANK1 by differentiated hepatic cells upon IFN treatment. Hepatitis C virus replication in hESC-derived hepatic cells induced the expression of ISGs - LAMP3, ETV7, RASGRP3, and TRANK1. The hESC-derived hepatic cells contain intact innate system and can recognize invading pathogens. Besides assessing the tissue-specific functions for cell therapy applications, it may also be important to test the innate immune function of engrafting cells to ensure adequate defense against infections and improve graft survival. (C) 2015 The Authors. Published by Elsevier B.V.

Immune responses against hepatitis C virus genotype 3a virus-like particles in mice: A novel VLP prime-adenovirus boost strategy

Chronic hepatitis C virus (HCV) infection represents a major health threat to global population. In India, approximately 15-20% of cases of chronic liver diseases are caused by HCV infection. Although, new drug treatments hold great promise for HCV eradication in infected individuals, the treatments are highly expensive. A vaccine for preventing or treating HCV infection would be of great value, particularly in developing countries. Several preclinical trials of virus-like particle (VLP) based vaccine strategies are in progress throughout the world. Previously, using baculovirus based system, we have reported the production of hepatitis C virus-like particles (HCV-LPs) encoding structural proteins for genotype 3a, which is prevalent in India. In the present study, we have generated HCV-LPs using adenovirus based system and tried different immunization strategies by using combinations of both kinds of HCV-LPs with other genotype 3a-based immunogens. HCV-LPs and peptides based ELISAs were used to evaluate antibody responses generated by these combinations. Cell-mediated immune responses were measured by using T-cell proliferation assay and intracellular cytokine staining. We observed that administration of recombinant adenoviruses expressing HCV structural proteins as final booster enhances both antibody as well as T-cell responses. Additionally, reduction of binding of VLP and JFH1 virus to human hepatocellular carcinoma cells demonstrated the presence of neutralizing antibodies in immunized sera. Taken together, our results suggest that the combined regimen of VLP followed by recombinant adenovirus could more effectively inhibit HCV infection, endorsing the novel vaccine strategy. (C) 2015 Elsevier Ltd. All rights reserved.

Evaluación preliminar de dos variedades de frijol común (Phaseolus vulgaris L.) inoculadas en diferentes etapas fenológicas con el virus del mosaico común del frijol BCMV

Con el objetivo de evaluar la respuesta de dos variedades de frijol Phaseolus vulgaris L. al virus del mosaico común del frijol (BCMV) se llevó acabo este trabajo en dos etapas de investigación; La etapa I se realizó en la Universidad Nacional Agraria, en los meses de julio a septiembre de 1991, y la etapa II en la estación experimental La Compañía, en los meses de octubre a diciembre de 1991. Para la etapa I, se sembraron en 40 maceteras, semillas de frijol de las variedades Criolla A-1936 y Revolución 79. En la etapa II los tratamientos estaban arreglados en un Bloque Completamente al Azar en un arreglo de parcelas divididas con tres repeticiones. En las dos etapas las variedades fueron inoculadas mecánicamente en tres momentos a los 7, 15, y 21 días después de la emergencia (DDE), y un testigo sin inocular en la etapa I. Se describieron los síntomas y se tomaron los datos de rendimiento. En las dos etapas de investigación ambas variedades resultaron susceptibles al virus. Tendiendo a ser más afectada en los rendimientos la variedad Revolución 79 que la Criolla a-1936 en la etapa II. El momento de inoculación en el que las variedades fueron más afectadas fue a los 15 DDE y no a los 7 DDE y de manera más notable en la variedad Criolla A-1936, esta respuesta se atribuye a: la temperatura, la concentración del virus y a la respuesta de hipersensibilidad en el caso particular de la variedad Criolla A-1936.

Evaluación preliminar de dos variedades de frijol común (Phaseolus vulgaris L.) inoculadas en diferentes etapas fenológicas con el virus del mosaico amarillo del frijol (BYMV)

Con el objetivo de evaluar la respuesta del frijol común (Phaseolus vulgaris L.) al virus del mosaico amarillo del frijol (BYMV) se seleccionaron las variedades Revolución 81 y Revolución 84, las cuales fueron inoculadas con BYMV en diferentes etapas fenológicas. El experimento consistió de dos etapas; Etapa 1 (vivero) en el período comprendido de julio-septiembre de 1991, en el campo de la Escuela de Sanidad Vegetal, Universidad Nacional Agraria, kilómetro 12 1/2 carretera norte, Managua; y la Etapa II (campo), en La Compañía, Masatepe, Carazo. Las variables evaluadas fueron, número de vainas por planta, número de granos por vaina y rendimiento (peso de granos). Para evaluar las diferencias estadísticas de las variables mencionadas se realizó análisis de varianza. En la Etapa 1 se observó que el menor rendimiento se presentó en el momento de inoculación a los 7 DDE para la variedad Rev. 81 y para la variedad Rev. 84 el menor rendimiento fue a los 15 DDE. En la Etapa II el mayor rendimiento se presentó cuando la inoculación se hizo a los 15 DDE, para la variedad Rev.81 y a los 7 DDE, para la variedad Rev.84. Los resultados obtenidos indican que la variedad Rev.81 y Rev. 84 son susceptibles al BYMV resultando con un menor rendimiento la variedad Rev. 81.

Determinación de daño y período crítico del virus del mosaico amarillo del frijol (BYMV) en cuatro variedades de frijol común (Phaseolus vulgaris L.) en Nicaragua

Con el objetivo de determinar el daño y periodo crítico del BYMV en cuatro variedades de frijol (Phaseolus vulgaris L.), utilizándose para dicho fin las variedades mejoradas DOR-364, REV-84 y las variedades Criollas-A-2343 y la Criolla-A-1923, las cuales fueron inoculadas en cuatro etapas fenológicas, siendo estas las etapas V2, V3, V4, R5 y un testigo sin inocular. De acuerdo a los resultados obtenidos en el estudio la variedad Criolla-A-1923 resultó la más afectada con reducciones que oscila entre 88.26% y 70.58% Resultando la variedad Criolla-A-2343 con daños que oscila entre 38.75 y 0%, la variedad Rev-84 con daños de 53.04% y 1.13% y la variedad Dor-364 con daños de 65.66% y 11.24%, lo cual indica que la variedad menos afectada es la Criolla-A-2343, seguido de la variedad Rev-84 y Dor-364. A pesar de que las variedades mejoradas presentan rendimientos superiores ocasionados por el BYMV. El periodo crítico para las variedades evaluadas comprende hasta la etapa V4 de manera general o sea 18 días después de la siembra. Desde el punto de vista del comportamiento individual de las variedades se definió el periodo crítico para las variedades Criolla-A-2343 y Rev-34 hasta la etapa V2, o sea 8 días después de la siembra, a la variedad Dor-364 se le determinó un periodo crítico hasta la etapa V3 equivalente a 13 días después de la siembra y a la variedad Criolla-A-1923 se le asignó hasta finales de la etapa V4 equivalente a 25 días después de siembra.

Determinación de daño y período crítico del virus del mosaico común del frijol (BCMV) en cuatro variedades de frijol común (Phaseolus vulgaris L.) en Nicaragua

Este ensayo experimental se realizó en época de postrera de 1992, en los terrenos del vivero de la Universidad Nacional Agraria, con el objetivo de determinar el daño causado por el virus del mosaico común del frijol BCMV y determinar el periodo critico necesario para proteger el cultivo. Las variedades que se utilizaron durante la investigación fueron DOR-364, REV-84, (variedades mejoradas) CA-2343 y CA-1923 (variedades criollas). La metodología usada fue inocular el virus mecánicamente, realizada en 4 momentos (Etapas fenológicas V2, V3, V4, R5). y un testigo sin inocular. Se realizaron observaciones de sistomatología desde la primera inoculación hasta la etapa de maduración fisiológica del cultivo. A partir de la cosecha se tomaron datos del número de vainas por planta, número de semillas por vainas y el peso de semillas por panta (gramos). Los resultados indican que la inoculación del BCMV efectuada en las diferentes etapas influyen sobre el daño en las plantas. Las plantas que fueron inoculadas en la primera etapa mostraron daños más severos y aquellas que se inocularon en la etapa R5 con daños menos severos. La variedad DOR-364 presentó daños por 7,5-36.1 %, la variedad REV-84 de 6-37.5%, la variedad CA-2343 de 8-35.1% y la variedad CA-1923 resultó con daños más severos siendo de 48.9-97.4%. En relación al período crítico las variedades DOR-364, REV-84 y CA-2343, el tiempo de protección requerido para reducir el daño fue de 13 días (Etapa V3) y para la variedad CA-1923 de 25 días (Etapa V2-R5)

Producción de plantas libres de virus y morfogénesis indirecta a partir del cultivo de meristemo de tres genotipos de quequisque (Xanthosoma saggittifolium (L) Schott

Se establecieron dos ensayos con el objetivo de determinar en que condición de cultivo se induce: 1) mayor cantidad de plantas libres del DMV diagnosticado con la prueba ELISA; 2) mayor cantidad de callos y plantas regeneradas a partir de callos en tres genotipos de quequisque. Ambos ensayos se iniciaron utilizando meristemos como explantes. Los ensayos se establecieron en esquema de diseño DCA bifactorial: a) genotipos de quequisque, Masaya (My), Nueva Guinea (NG) y Blanco (Bco); b) 5 variantes medios de cultivos. Se realizaron 3 pruebas ELISA a plantas de los tres genotipos que presentasen síntomas del DMV en el campo, a plantas del campo seleccionadas al azar y a plantas provenientes del cultivo de meristemos. En el ensayo de saneamiento del DMV se empleó en el medio MS suplido con combinaciones de AIA y 6-BAP, y para el ensayo de producción de callos se utilizaron combinaciones de 2,4-D y 6-BAP. La regeneración de plantas a partir de callos se logró en el medio MS sencillo. El desarrollo de los explantes en el primer ensayo se cuantificó utilizando escalas arbitrarias para el color y el crecimiento. En el segundo ensayo se utilizó una escala para medir el desarrollo. A los datos de cada variable se realizó un ANDEVA y la prueba de rangos múltiples Tukey, al α= 0.05, cuando hubo diferencias estadísticas entre tratamientos. Cien porciento de las muestras de hojas de plantas de los 3 genotipos que presentaban síntomas del DMV en el campo, resultaron positivas. Las plantas del campo de los genotipos My, NG y Bco elegidas al azar, registraron 88.32, 98.70 y el 90.00% de infección con el DMV; en cambio las plantas in vitro registraron 93.7, 100 y 100% libres de DMV en los mismos genotiposrespectivamente. A los 90 días de establecido el primer ensayo, el medio MS sin reguladores de crecimiento resultó estadísticamente superior con 84% de explantes creciendo y 8% plantas formadas. El medio MS + 1 mgl-16-BAP + 1 mgl-1 AIA registró los valores más discretos con 53% de explantes sin crecer y 41% plantas creciendo. El genotipo My fue superior en todos los medios con 90% de explantes creciendo y 7% plantas formadas. El genotipo Bco registró los más bajos valores con 58% de explantes sin crecer y 5% plantas formadas. Las variables color y crecimiento reportaron similar comportamiento. El medio de cultivo testigo fue estadísticamente superior con 64% de explantes color verde, 30% amarillo y 6% necróticos. El genotipo My sobresalió con 40% de explantes amarillos y 60% verdes. Los genotipos NG y Bco tuvieron comportamientos similares. En el ensayo de producción de callos, tres tratamientos resultaron estadísticamente superiores: el genotipo NG en el medio MS + 3 mgl-12,4-D (60% de explantes formando callos) y el genotipo Masaya en los medios MS+ 5 mg l-12,4-D y MS + 3 mg l-12,4-D (26.7 y 40% callos formados, respectivamente). No se registraron diferencias estadísticas entre los genotipos (16, 17 y 17% callos formados). El medio de cultivo MS + 3 mg l-12,4-D indujo la formación de 4% callos y 44% plantas. El medio de cultivo testigo (MS sin reguladores de crecimiento) resultó en 47% explantes sin crecer y ningún callo formado. Después de los 60 días del trasplante de los callos a un medio sin hormonas, los genotipos Masaya, Nueva Guinea y Blanco reportaron que el 94, 83 y 58 % regeneraron yemas respectivamente.

Comportamiento agronómico en vitroplantas sanas e infestadas con el virus del dasheen (DMV) en tres cultivares de quequisque (Xanthosomas spp.) en el CNIA-INTA, Managua

Con el objetivo de evaluar el comportamiento agronómico de vitroplantas de tres cultivaresde quequisque (Xanthosoma spp.) libres del virus DMV producidas a través del cultivo de meristemos, se estableció el ensayo en el CNIA-INTA (Centro Nacional de Investigación Agropecuaria–Instituto Nicaragüense de Tecnología Agropecuaria) en el departamento de Managua, entre los meses abril-diciembre del año 2004. Se evaluaron variables morfológicas: altura de la planta (cm), área foliar (cm²), diámetro del pseudotallo (cm) y número de hojas; de rendimiento: número de cormelos por planta, peso de cormelo (g), rendimiento (kg ha), diámetro de cormelo (cm) y largo de cormelo (cm) y la presencia del virus e insectos asociados al cultivo en los cultivares Masaya (MY), Nueva Guinea (NG) y Blanco (Bco). Se utilizó un diseño de arreglos en Parcelas Divididas conformado por tres bloques, en la parcela grande se ubicaron los cultivares y en las pequeñas la condición sanitaria (sana e infectada). Se realizó ANDEVA y la separación de medias de rangos múltiples de Tukey ( ∞ =0.05). Los cultivares y la condición sanitaria presentaron diferencias estadísticas entre ellas en las variables morfológicas, habiendo obtenido el cultivar NG los mayores promedios: altura de la planta con (64.23 cm ), área foliar con (1129 cm²), diámetro del pseudotallo con (4.68 cm) y número de hojas con (3.90 cm). El rendimiento presentó efecto significativo en las condiciones fitosanitarias, pero no en los cultivares e interacción. Se encontró tendencia al incremento del porcentaje de reinfección de plantas con presencia del DMV a través del tiempo, el cultivar Bco a los 192 dds reportó un máximo valor del (90 %), seguido de los cultivares MY (65 %) y NG (60 %). Las principales plagas asociadas a los cultivares de quequisque fueron del orden Diptera, Homoptera, Coleoptero, Heminoptero y Lepidoptero, considerándose al áfido Aphis gossypii del orden Homoptera como el posible vector del virus DMV.