Isolation and characterization of bacterial strains with a hydrolytic profile with potential use in bioconversion of agroindustial by-products and waste

There is a trend towards the use of novel technologies nowadays, mainly focused on biological processes, for recycling and the efficient utilization of organic residues that can be metabolized by different microorganisms as a source of energy. In the present study the isolation of bacterial strains from six different agro-industrial by-products and waste was performed with the objective of evaluating their hydrolytic capacities and suitability for use in bioconversion of specific substrates. The 34 isolated strains were screened in specific culture media for the production of various hydrolytic enzymes (lipase, protease, cellulase, and amylase). It was found that 28 strains exhibited proteolytic activity, 18 had lipolytic activity, 13 had caseinolytic activity, 15 had amylolytic activity, and 11 strains exhibited cellulolytic activity. The strains that showed the highest hydrolytic capacities with biotechnological potential were selected, characterized genotipically, and identified as Bacillus, Serratia, Enterococcus, Klebsiella, Stenotrophomonas, Lactococcus, and Escherichia genera. It was concluded that the strain isolates have a high potential for use in the bioconversion of agro-industrial waste, both as a pure culture and as a microbial consortium.

Green and brown propolis: efficient natural biocides for the control of bacterial contamination of alcoholic fermentation of distilled beverage

This study aimed to evaluate the efficiency of natural biocides, brown and green propolis, for the control of bacterial contamination in the production of sugarcane spirit. The treatments consisted of brown and green propolis extracts, ampicillin, and a control and were assessed at the beginning and end of harvest season in ten fermentation cycles. In the microbiological analyses, the lactic acid bacteria were quantified in the inoculum before and after the treatment with biocides, and the viability of yeast cells during fermentation was evaluated. The levels of acids, glycerol, total residual reducing sugars, and ethanol were analyzed for the wine resulting from each fermentation cycle. A reduction in the number of bacterial contaminants in the inoculum in the treatments with the natural biocides was observed, but it did not affect the viability of yeast cells. The control of the contaminants led to the production of higher levels of ethanol and reduced acidity in the wine produced. The results of the use of brown and green propolis to control the growth microorganisms in the fermentation of sugarcane spirit can be of great importance for using alternative strategies to synthetic antibacterials in fermentation processes including other distilled beverage or spirits.

Bacterial adhesion and biofilm formation on monolithic zirconia

Tutkimuksen tavoitteena oli selvittää bakteerien kiinnittymistä ja bakteeribiofilmin muodostumista implanttimateriaalien pinnalla. Monoliittisen zirkonian ja lasikeramien käyttö implanttikruunujen materiaaleina kasvaa jatkuvasti. Zirkoniaa käytetään myös abutmenttien materiaalina esteettisillä alueilla. Tällä hetkellä on vain vähän tutkimustietoa näiden implanttikruunumateriaalien sekä implanttikruunujen sementoimiseen käytetyn sementin pinnalla tapahtuvasta bakteeriadheesiosta ja biofilmin muodostumisesta. Bakteerien adheesiota ja biofilmin muodistumista tutkittiin neljän eri materiaalin pinnalla. Tutkimuksessa käytetyt materiaalit olivat: (1) Litiumdisilikaatti (LDS; IPS e.max CAD, Ivoclar Vivadent,kontrolli), (2) Kokonaan stabiloitu zirkonia (FSZ; Prettau Anterior, Zirkonzahn), (3) Osittain stabiloitu zirkonia (PSZ; Katana, Noritake), ja (4) Kaksoiskovetteinen sementti (DCC; Multilink hybrid abutment cement, Ivoclar Vivadent). Kaikki tutkimuksessa käytetyt materiaalit valmisteltiin ja kiillotettiin valmistajien ohjeiden mukaisesti Tutkittavat pinnat inkuboitiin Streptococcus mutans-suspensiossa +37°C:ssä asteessa. Bakteeriadheesiotestissä inkubointiaika oli 30 minuuttia ja biofilmitestissä vastaava aika oli 24 tuntia. Materiaalien pintoja tarkasteltiin myös elektronimikroskooppia käyttäen. Tutkimuksessa todettiin, että bakteeriadheesiossa oli eroja eri materiaalien välillä. Biofilmin. muodostumisessa ei todettu tilastollisesti merkittäviä eroja tutkittavien materiaalien välillä.

Analytical modelling of bacterial migration and accumulation with rate-limited sorption in discrete fractures

An analytical model for bacterial accumulation in a discrete fractllre has been developed. The transport and accumlllation processes incorporate into the model include advection, dispersion, rate-limited adsorption, rate-limited desorption, irreversible adsorption, attachment, detachment, growth and first order decay botl1 in sorbed and aqueous phases. An analytical solution in Laplace space is derived and nlln1erically inverted. The model is implemented in the code BIOFRAC vvhich is written in Fortran 99. The model is derived for two phases, Phase I, where adsorption-desorption are dominant, and Phase II, where attachment-detachment are dominant. Phase I ends yvhen enollgh bacteria to fully cover the substratllm have accllillulated. The model for Phase I vvas verified by comparing to the Ogata-Banks solution and the model for Phase II was verified by comparing to a nonHomogenous version of the Ogata-Banks solution. After verification, a sensitiv"ity analysis on the inpllt parameters was performed. The sensitivity analysis was condllcted by varying one inpllt parameter vvhile all others were fixed and observing the impact on the shape of the clirve describing bacterial concentration verSllS time. Increasing fracture apertllre allovvs more transport and thus more accllffilliation, "Vvhich diminishes the dllration of Phase I. The larger the bacteria size, the faster the sllbstratum will be covered. Increasing adsorption rate, was observed to increase the dllration of Phase I. Contrary to the aSSllmption ofllniform biofilm thickness, the accllffilliation starts frOll1 the inlet, and the bacterial concentration in aqlleous phase moving towards the olitiet declines, sloyving the accumulation at the outlet. Increasing the desorption rate, redllces the dliration of Phase I, speeding IIp the accllmlilation. It was also observed that Phase II is of longer duration than Phase I. Increasing the attachment rate lengthens the accliffililation period. High rates of detachment speeds up the transport. The grovvth and decay rates have no significant effect on transport, althollgh increases the concentrations in both aqueous and sorbed phases are observed. Irreversible adsorption can stop accllillulation completely if the vallIes are high.

X-ray diffraction of a gram-negative bacterial membrane mimetic

This thesis applies x-ray diffraction to measure he membrane structure of lipopolysaccharides and to develop a better model of a LPS bacterial melilbrane that can be used for biophysical research on antibiotics that attack cell membranes. \iVe ha'e Inodified the Physics department x-ray machine for use 3.'3 a thin film diffractometer, and have lesigned a new temperature and relative humidity controlled sample cell.\Ve tested the sample eel: by measuring the one-dimensional electron density profiles of bilayers of pope with 0%, 1%, 1G :VcJ, and 100% by weight lipo-polysaccharide from Pse'udo'lTwna aeTuginosa. Background VVe now know that traditional p,ntibiotics ,I,re losing their effectiveness against ever-evolving bacteria. This is because traditional antibiotic: work against specific targets within the bacterial cell, and with genetic mutations over time, themtibiotic no longer works. One possible solution are antimicrobial peptides. These are short proteins that are part of the immune systems of many animals, and some of them attack bacteria directly at the membrane of the cell, causing the bacterium to rupture and die. Since the membranes of most bacteria share common structural features, and these featuret, are unlikely to evolve very much, these peptides should effectively kill many types of bacteria wi Lhout much evolved resistance. But why do these peptides kill bacterial cel: '3 , but not the cells of the host animal? For gramnegative bacteria, the most likely reason is that t Ileir outer membrane is made of lipopolysaccharides (LPS), which is very different from an animal :;ell membrane. Up to now, what we knovv about how these peptides work was likely done with r !10spholipid models of animal cell membranes, and not with the more complex lipopolysa,echaricies, If we want to make better pepticies, ones that we can use to fight all types of infection, we need a more accurate molecular picture of how they \vork. This will hopefully be one step forward to the ( esign of better treatments for bacterial infections.

Synthesis of 3', 5'-cyclic diguanylic acid (c-di-GMP) analogues

In the past few years, interest in signaling networks involving 3ʹ, 5ʹ -cyclic diguanylic acid (c-di-GMP) has increased dramatically. Evidence started to emerge that connects c-di-GMP to the regulation of a range of biological processes in bacteria, such as bacterial biofilm formation, virulence, extracellular polysaccharide synthesis, however, much remains to be explored in the signaling pathways that involve this secondary messenger. This molecule has also been shown to be a very powerful immunostimulating agent and potent mucosal vaccine adjuvant.

Surface display of proteins by Gram-negative bacterial autotransporters

Affiliation: Faculté de Médecine Vétérinaire, Université de Montréal

Étude des interactions entre Haemophilus parasuis et des cellules endothéliales et épithéliales porcines: implications d’une composante bactérienne, le lipooligosaccharide (LOS)

Haemophilus parasuis est un pathogène porcin causant la maladie de Glässer caractérisée par de la polysérosite fibrineuse, polyarthrite, méningite et septicémie. La pathogenèse de l’infection et les facteurs de virulence sont encore mal connus. Le site de colonisation de Haemophilus parasuis dans le tractus respiratoire supérieur est controversé. Pour accéder à la circulation sanguine, H. parasuis doit envahir la muqueuse. H. parasuis adhère à des cellules épithéliales porcines de trachée (NPTr). Pour accéder au système nerveux central et causer la méningite, H. parasuis doit traverser la barrière hémato-méningée. H. parasuis adhère à et envahit des cellules endothéliales porcines de microvaisseaux cérébraux (PBMEC) provenant de la BBB. Le but de cette étude était d’étudier certaines interactions entre H. parasuis et son lipooligosccharide (LOS), et des cellules endothéliales et épithéliales porcines. Les résultats démontrent que l’adhésion de H. parasuis Nagasaki aux NPTr et aux PBMEC est en partie médiée par son LOS. H. parasuis induit l’apoptose des NPTr et des PBMEC, mais le LOS ne semble pas impliqué. H. parasuis, et à un niveau moindre son LOS, stimulent la sécrétion d’interleukine- (IL) 6 et d’IL-8. Différentes souches de H. parasuis sérotypes 4 et 5 (sérotypes les plus prévalents en Amérique du Nord) stimulent également les NPTr et PBMEC à produire IL-6 et IL-8. Les résultats suggèrent que le LOS de H. parasuis joue un certain rôle dans la pathogenèse de l’infection, mais d’autres composantes bactériennes sont également impliquées.

Caractérisation phénotypique et génotypique d’isolats de Salmonella Typhimurium provenant de porcs sains ou septicémiques

Les infections à Salmonella Typhimurium constituent un problème de taille pour l’industrie porcine et la santé publique car cet animal est un réservoir pour les infections chez l’homme. De plus, on observe, chez des souches appartenant au lysotype (LT) 104, des résistances multiples aux antimicrobiens associées à des septicémies chez les porcs en engraissement, ce qui peut contribuer à la contamination des carcasses. Il faut donc contrôler l’infection au niveau du troupeau. Pour ce faire, il importe donc de mieux caractériser ces souches, comprendre la pathogénie de l’infection et identifier des facteurs de virulence. L’objectif principal de cette étude était de caractériser des isolats de S. Typhimurium provenant de porcs septicémiques et de les comparer avec ceux de porcs sains. Une banque d’isolats provenant de porcs septicémiques (ASC) et de porcs sains à l’abattoir (SSC) était constituée. Le lysotype des isolats a été identifié et ceux-ci ont été caractérisés selon le profil de résistance aux antimicrobiens, le SDS-PAGE et l’immunobuvardage et le PFGE. Chez les isolats ASC, LT 104 représentait 36.4% des isolats et chez les isolats SSC la proportion était de 51.5%. Les isolats pouvaient être résistants jusqu’à douze antimicrobiens, peu importe leur origine. Il n’a toutefois pas été possible d’associer une protéine spécifique au groupe d’isolats ASC. Parmi les souches LT 104, plusieurs groupes génétiques ont été identifiés. Les différentes étapes de la pathogénie de Salmonella ont ensuite été évaluées, dont l’adhésion et l’invasion des isolats des deux banques sur des cellules intestinales humaines. Nos résultats ont démontré que les isolats ASC avaient un pouvoir accru d’invasion comparés aux isolats SSC (P=0.003). Pour un sous-groupe d’isolats sélectionnés selon leur taux d’invasion, des tests de phagocytose, d’apoptose et d’adhésion au mucus intestinal ont été effectués en utilisant la cytométrie en flux. La survie des bactéries après la phagocytose a aussi été évaluée et la méthode MATS a été utilisée pour évaluer l'adhésion aux solvants. Les pourcentages de phagocytose chez les isolats SSC par les monocytes porcins étaient plus élevés que chez les isolats ASC à 15 minutes (P=0.02). Nous n’avons trouvé aucune différence significative pour les autres méthodes utilisées. Nous avons ensuite comparé le génome d’un isolat ASC (#36) à celui d’un isolat SSC (#1) par le SSH pour identifier des facteurs de virulence potentiels. Des clones correspondant à des gènes retrouvés sur le chromosome ainsi que sur des plasmides ont été identifiés. Ces résultats nous ont dirigés vers l’analyse des profils plasmidiques de tous les isolats. Les différents profils étaient retrouvés autant chez les isolats ASC que chez les isolats SSC. Deux profils (PL14 et PL20) étaient observés plus fréquemment chez les isolats LT 104 que chez les isolats d’autres lysotypes (P=0.01 et P=0.01, respectivement). Le séquençage d’un des plasmides de l’isolat ASC, démontrait la présence d’informations génétiques codant pour la réplication et une bêta-galactosidase-α. Il serait intéressant de préciser le rôle exact de ces gènes dans l’infection. Nos travaux suggèrent que les isolats de S. Typhimurium provenant de porcs septicémiques se distinguent par un pouvoir d’invasion accru ainsi que par des taux de phagocytose plus faibles dans les phases initiales de l’infection. Cette étude aura donc permis d’accroître les connaissances sur la pathogénie des infections à S. Typhimurium chez le porc.

Étude du rôle spécifique du système à deux composantes PhoBR et du système Pst (phosphate specific transport) dans la virulence d’une souche pathogène aviaire de Escherichia coli (APEC)

Les souches d’Escherichia coli pathogènes aviaires (APEC) sont responsables d’infections respiratoires et de septicémies chez la volaille. Le régulon Pho est contrôlé conjointement par le système à deux composantes PhoBR et par le système de transport spécifique du phosphate (Pst). Afin de déterminer l’implication de PhoBR et du système Pst dans la pathogenèse de la souche APEC O78 χ7122, différentes souche mutantes phoBR et pst ont été testées pour divers traits de virulence in vivo et in vitro. Les mutations menant à l’activation constitutive du régulon Pho rendaient les souches plus sensibles au peroxyde d’hydrogène et au sérum de lapin comparativement à la souche sauvage. De plus, l’expression des fimbriae de type 1 était affectée chez ces souches. L’ensemble des mutants Pho-constitutifs étaient aussi significativement moins virulents que la souche sauvage dans un modèle de coinfection de poulet, incluant les souches avec un système Pst fonctionnel. De plus, l’inactivation du régulateur PhoB chez un mutant Pst restaure la virulence. Par ailleurs, l’inactivation de PhoB n’affecte pas la virulence de la souche χ7122 dans notre modèle. De manière intéressante, le degré d’atténuation des souches mutantes corrèle directement avec le niveau d’activation du régulon Pho. Globalement, les résultats indiquent que l’activation du régulon Pho plutôt que le transport du phosphate via le système Pst joue un rôle majeur dans l’atténuation des APEC.

Caractérisation des souches de Salmonella Typhimurium responsables de septicémies chez le porc

Depuis quelques années, il y a émergence de souches de Salmonella enterica sérovar Typhimurium multirésistantes causant une septicémie et la mort chez le porc. Ceci constitue un problème majeur pour l’industrie porcine et possiblement pour la santé publique. L’objectif de ce projet était de comparer et de caractériser une souche capable de causer une septicémie chez le porc et une souche commensale, en observant l’interaction avec des cellules épithéliales, des macrophages humains et d’identifier des gènes exprimés par les souches septicémiques et les souches commensales. Tout d’abord, l’infection de cellules épithéliales permet d’observer l’adhérence et l’invasion des bactéries, pour ainsi mettre en évidence la capacité des souches à coloniser le tractus gastro-intestinal. La souche commensale possède un pouvoir d’adhésion supérieur à la souche septicémique. Par la suite, l’infection de macrophages permet de caractériser le niveau de phagocytose et de survie. L’importance de la survie dans les macrophages pourrait permettre de faire un lien avec la septicémie. Toutefois, aucune différence n’est observable dans les conditions qui ont été testé. Ensuite, la technique SCOTS (Selective Capture of Transcribed Sequences) est utilisée pour capturer des gènes uniques à la souche septicémique et un autre SCOTS est fait pour capturer les gènes spécifiques à la souche commensale. Finalement, les gènes sont clonés, leur spécificité face aux souches est analysé par dot blot et ils sont identifiés par séquençage suivient d’une analyses bioinformatiques. Les gènes identifiés par SCOTS, lors des captures pour la souche septicémique et la souche commensale, se trouvent à être des gènes communs aux Salmonella. Toutefois, la différence de pathologie causée par les deux souches, n’est peut-être pas l’acquisition de nouveaux gènes, mais plutôt une différence d’expression entre les deux souches.

L’apolipoprotéine A-I interagit avec l’adhésine impliquée dans l’adhérence diffuse (AIDA-I) d’Escherichia coli : rôle lors du processus d’adhésion et d’invasion

L’adhésine impliquée dans l’adhérence diffuse (AIDA-I) est une adhésine bactérienne présente chez certaines souches d’Escherichia coli qui, associée aux toxines Stx2e ou STb, contribue à l’apparition de la maladie de l’œdème ou de la diarrhée post-sevrage chez les porcelets. AIDA-I est un autotransporteur qui confère des capacités d’autoaggrégation, de formation de biofilms et d’adhésion. L’objectif principal du projet de recherche consistait en la recherche de récepteur(s) potentiel(s) d’AIDA-I. Les bactéries pathogènes adhèrent aux cellules-cibles soit en liant directement des molécules à la surface cellulaire ou en utilisant des molécules intermédiaires qui permettent de diminuer la distance séparant la bactérie de la cellule-cible. Puisque le sérum est un fluide qui contient de nombreuses molécules, celui-ci a été utilisé comme matériel de départ pour l’isolement de récepteur(s) potentiels. Nous avons isolé un récepteur potentiel à partir du sérum porcin : l’apolipoprotéine A-I. L’interaction entre l’apolipoprotéine A-I et AIDA-I a été confirmée par ELISA et microscopie à fluorescence. La capacité à envahir les cellules épithéliales offre aux pathogènes la possibilité d’établir une niche intracellulaire qui les protègent contre les attaques du milieu extérieur. La présente étude a démontré que la présence d’AIDA-I en tant que seul facteur de virulence chez une souche de laboratoire permet de conférer la capacité d’envahir les cellules sans promouvoir la survie intracellulaire. L’étude de la souche sauvage 2787, exprimant AIDA-I en association avec d’autres facteurs de virulence, a démontré une différence significative pour les phénotypes d’invasion et de survie intracellulaire face à la souche de laboratoire exprimant AIDA-I.

Semisynthetic aminoglycoside antibiotics : toward biomimetic synthesis, evasion of bacterial resistance and reduced toxicity

Les antibiotiques aminoglycosidiques sont des agents bactéricides de grande valeur et d’efficacité à large spectre contre les pathogènes Gram-positifs et Gram-négatifs, dont plusieurs membres naturels et semisynthétiques sont importants dans l’histoire clinique depuis 1950. Des travaux crystallographiques sur le ribosome, récompensés par le prix Nobel, ont démontré comment leurs diverses structures polyaminées sont adaptées pour cibler une hélice d’ARN dans le centre de codage de la sous-unité 30S du ribosome bactérien. Leur interférence avec l’affinité et la cinétique des étapes de sélection et vérification des tARN induit la synthèse de protéines à basse fidélité, et l’inhibition de la translocation, établissant un cercle vicieux d’accumulation d’antibiotique et de stress sur la membrane. En réponse à ces pressions, les pathogènes bactériens ont évolué et disséminé une panoplie de mécanismes de résistance enzymatiques et d’expulsion : tels que les N acétyltransférases, les O phosphotransférases et les O nucleotidyltransférases qui ciblent les groupements hydroxyle et amino sur le coeur des aminoglycosides; des méthyl-transférases, qui ciblent le site de liaison ribosomale; et des pompes d’expulsion actives pour l’élimination sélective des aminoglycosides, qui sont utilisés par les souches Gram-négatives. Les pathogènes les plus problématiques, qui présentent aujourd’hui une forte résilience envers la majorité des classes d’antibiotiques sur le bord de la pan-résistance ont été nommés des bactéries ESKAPE, une mnémonique pour Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa et Enterobacteriaceae. La distribution globale des souches avec des mécanismes de résistance envers les standards cliniques aminoglycosides, tels que la tobramycine, l’amikacine et la gentamicine, est comprise entre 20 et 60% des isolées cliniques. Ainsi, les aminoglycosides du type 4,6-disubstitués-2-deoxystreptamine sont inadéquats comme thérapies anti-infectieuses à large spectre. Cependant, la famille des aminoglycosides 4,5-disubstitués, incluant la butirosine, la neomycine et la paromomycine, dont la structure plus complexe, pourrait constituter une alternative. Des collègues dans le groupe Hanessian et collaborateurs d’Achaogen Inc. ont démontré que certains analogues de la paraomomycine et neomycine, modifiés par désoxygénation sur les positions 3’ et 4’, et par substitution avec la chaîne N1-α-hydroxy-γ-aminobutyramide (HABA) provenant de la butirosine, pourrait produire des antibiotiques très prometteurs. Le Chapitre 4 de cette dissertation présente la conception et le développement d’une stratégie semi-synthétique pour produire des nouveaux aminoglycosides améliorés du type 4,5 disubstitués, inspiré par des modifications biosynthétiques de la sisomicine, qui frustrent les mécanismes de résistance bactérienne distribuées globalement. Cette voie de synthèse dépend d’une réaction d’hydrogénolyse de type Tsuji catalysée par palladium, d’abord développée sur des modèles monosaccharides puis subséquemment appliquée pour générer un ensemble d’aminoglycosides hybrides entre la neomycine et la sisomicine. Les études structure-activité des divers analogues de cette nouvelle classe ont été évaluées sur une gamme de 26 souches bactériennes exprimant des mécanismes de résistance enzymatique et d’expulsion qui englobe l’ensemble des pathogènes ESKAPE. Deux des antibiotiques hybrides ont une couverture antibacterienne excellente, et cette étude a mis en évidence des candidats prometteurs pour le développement préclinique. La thérapie avec les antibiotiques aminoglycosidiques est toujours associée à une probabilité de complications néphrotoxiques. Le potentiel de toxicité de chaque aminoglycoside peut être largement corrélé avec le nombre de groupements amino et de désoxygénations. Une hypothèse de longue date dans le domaine indique que les interactions principales sont effectuées par des sels des groupements ammonium, donc l’ajustement des paramètres de pKa pourrait provoquer une dissociation plus rapide avec leurs cibles, une clairance plus efficace et globalement des analogues moins néphrotoxiques. Le Chapitre 5 de cette dissertation présente la conception et la synthèse asymétrique de chaînes N1 HABA β substitutées par mono- et bis-fluoration. Des chaînes qui possèdent des γ-N pKa dans l’intervalle entre 10 et 7.5 ont été appliquées sur une neomycine tétra-désoxygénée pour produire des antibiotiques avancés. Malgré la réduction considérable du γ N pKa, le large spectre bactéricide n’a pas été significativement affecté pour les analogues fluorés isosteriques. De plus, des études structure-toxicité évaluées avec une analyse d’apoptose propriétaire d’Achaogen ont démontré que la nouvelle chaîne β,β difluoro-N1-HABA est moins nocive sur un modèle de cellules de rein humain HK2 et elle est prometteuse pour le développement d’antibiotiques du type neomycine avec des propriétés thérapeutiques améliorées. Le chapitre final de cette dissertation présente la proposition et validation d’une synthèse biomimétique par assemblage spontané du aminoglycoside 66-40C, un dimère C2 symétrique bis-imine macrocyclique à 16 membres. La structure proposée du macrocycle a été affinée par spectroscopie nucléaire à un système trans,trans-bis-azadiène anti-parallèle. Des calculs indiquent que l’effet anomérique de la liaison α glycosidique entre les anneaux A et B fournit la pré-organisation pour le monomère 6’ aldéhydo sisomicine et favorise le produit macrocyclique observé. L’assemblage spontané dans l’eau a été étudié par la dimérisation de trois divers analogues et par des expériences d’entre croisement qui ont démontré la généralité et la stabilité du motif macrocyclique de l'aminoglycoside 66-40C.

Étude fonctionnelle de l’opéron fimbriaire stg de Salmonella enterica sérovar Typhi

La bactérie Salmonella enterica sérovar Typhi (S. Typhi) provoque la fièvre typhoïde chez les humains et constitue un problème de santé publique important. La majorité de nos connaissances sur la pathogenèse de cette bactérie provient du modèle de fièvre entérique chez la souris causée par le sérovar Typhimurium. Peu d’études se sont penchées sur les facteurs de virulence uniques au sérovar Typhi, ni sur la possibilité que les pseudogènes retrouvés dans son génome puissent être fonctionnels. Le fimbria stg, unique au sérovar Typhi, renferme un codon d’arrêt TAA prématuré dans le gène stgC qui code pour le placier responsable de l’assemblage des sous-unités fimbriaires à la surface de la bactérie. Ainsi, le fimbria stg a été classifié dans la liste des pseudogènes non-fonctionnels. Les objectifs de cette étude étaient d’évaluer l’implication du fimbria stg lors de l’interaction avec les cellules humaines, puis de vérifier l’importance du pseudogène stgC lors de la biogenèse fimbriaire. Dans une première partie, la transcription de stg a été évaluée à l’aide d’une fusion lacZ. Malgré des niveaux d’expression observés généralement faibles en milieu riche, la croissance en milieu minimal a favorisé la transcription de l’opéron. La délétion complète de l’opéron fimbriaire stgABCD du génome de S. Typhi a été réalisée par échange allélique, puis a été complémentée sur un plasmide. Il a été démontré que la présence de stg chez S. Typhi, S. Typhimurium et E. coli contribue à une adhérence accrue sur les cellules épithéliales humaines. De plus, ce fimbria semble agir comme une structure anti-phagocytaire lors de l’interaction avec des macrophages humains. Ainsi, l’opéron stg semble fonctionnel, malgré son codon d’arrêt prématuré, puisque des phénotypes ont été observés. La seconde partie de cette étude consistait à vérifier le rôle joué par le pseudogène stgC dans la biogenèse du fimbria. Différentes variantes de l’opéron ont été générées, clonées dans un vecteur inductible à l’arabinose, puis transformées dans la souche afimbriaire d’E. coli ORN172. La translocation de la sous-unité fimbriaire StgD à la surface de la bactérie a été évaluée chez ces différents mutants par immunobuvardage de type Western. Cette expérience a permis de démontrer que le pseudogène stgC est essentiel pour l’exportation de la sous-unité StgD à la surface. L’ajout d’une étiquette de 6-histidines en C-terminal de StgC a permis de confirmer la traduction complète du gène, malgré le codon d’arrêt TAA prématuré. Le séquençage peptidique a révélé l’insertion d’une tyrosine à ce codon. Une fusion traductionnelle avec la protéine verte fluorescente a révélé qu’environ 0.8% de l’ARNm peut être traduit et permet la production complète du placier. Ce projet a permis la caractérisation d’un facteur de virulence unique à S. Typhi et constitue une étape de plus vers la compréhension de ses mécanismes de pathogenèse. Il s’agit de la première démonstration chez les bactéries de la fonctionnalité d’un gène interrompu prématurément par un codon d’arrêt TAA.

Étude de prévalence et associations des gènes de virulence et résistance aux antimicrobiens d’Escherichia coli de la flore intestinale du poulet sain

Les Escherichia coli pathogènes de la volaille (APEC) font partie des E. coli extra-intestinaux pathogènes (ExPEC) et seraient un réservoir possible de gènes de virulence et de résistance aux antimicrobiens (RAM) des ExPEC chez l’humain. L’objectif de cette étude était d’évaluer l’effet d’un prébiotique et d’un mélange d’acide organique et d’huiles essentielles encapsulés sur la prévalence des gènes de virulence des ExPEC et de RAM, ainsi que les associations entre ces gènes chez E. coli de l’intestin du poulet sain. Des échantillons de contenus caecaux de poulets de 29 jours d’âge ayant reçu un de ces ingrédients alimentaires comparativement à des témoins ont été analysés pour la présence des gènes de virulence iucD, tsh, papC et des gènes de RAM blaTEM, blaSHV, tetA, tetC, blaCMY-2, aadA1, aac3 par PCR. La prévalence d’iucD était supérieure dans le groupe témoin comparativement aux groupes «prébiotique» et «acide organique» et la prévalence de papC était affectée dans le groupe «acide organique». La prévalence d’isolats d’E.coli positifs pour blaCMY-2 était supérieure dans le groupe témoin comparée aux groupes «prébiotique» et «acide organique», tel que démontré par la technique d’hybridation de l’ADN sur HGMF (Hydrophobic Grid Membrane Filter). De plus, la prévalence des isolats d’E. coli positifs pour tetA, blaTEM, aadA1 ou tsh était affectée par les ingrédients alimentaires. Dans l’ensemble, des associations entre la présence de tsh et iucD, blaTEM et aadA1, et iucD et blaCMY-2 ont été observées. .Cette étude démontre l’utilité de certains ingrédients alimentaires pour dimunier le risque d’exposition en santé publique.