Caracterização de beta-lactamases de espectro ampliado (ESBLs), genes de resistência aos antimicrobianos e conteúdo plasmidial em cepas de Escherichia coli e Salmonella spp. não tifóides isoladas do ambiente hospitalar e da comunidade

Enterobactérias produtoras de ESBLs são descritas tanto no ambiente hospitalar quanto na comunidade em todo o mundo. No Brasil, esses microrganismos também têm emergido como uma causa importante de infecções, sendo as enzimas CTX-M as prevalentes. O objetivo deste estudo foi analisar diferentes aspectos genotípicos relacionados à expressão da resistência aos antimicrobianos em cepas Escherichia coli e de Salmonella spp, tais como: a diversidade de ESBLs, os genes de resistência aos antimicrobianos e o conteúdo plasmidial. Os aspectos epidemiológicos das cepas produtoras de ESBLs também foram investigados. Foram estudadas 88 cepas de enterobactérias, sendo 43 E. coli e 45 cepas de Salmonella spp., de origem hospitalar e da comunidade (principalmente alimentos), isoladas na cidade do Rio de Janeiro. A expressão de ESBL foi observada em sete cepas de E. coli (7/43, 16,3%) e em uma cepa de Salmonella Typhimurium (1/45, 2,3%) e as enzimas foram identificadas como variantes de CTX-M e SHV-5, respectivamente. Entre as cepas de E. coli, a enzima CTX-M-2 foi a mais frequente (n = 4), sendo detectada em cepas isoladas de swab retal de pacientes hospitalizados, enquanto as enzimas CTX-M-59 (uma variante de CTX-M) (n = 1) e CTX-M-9 (n = 2) foram identificadas em cepas isoladas a partir de espécimes clínicos. Salmonella Typhimurium produtora de SHV-5 foi isolada do ambiente hospitalar (fórmula infantil). As cepas de E. coli produtoras das enzimas CTX-M pertenceram a grupos filogenéticos (A, B1, D) e STs (ST34, ST69, ST101) diferentes, sendo os genes blaCTX-M identificados em plasmídeos com tipo de replicon IncA/C de cerca de 150 kb (blaCTX-M-2, blaCTX-M-9, blaCTX-M-59) ou 80 kb (blaCTX-M-2). A cepa de S. Typhimurium produtora de SHV-5 pertenceu a um único clone (A-ST19) e o gene blaSHV-5 foi identificado em plasmídeo com o replicon IncL/M com aproximadamente 55Kb. Foi identificado pela primeira vez no Brasil o ST313 em um clone de S. Typhimurium (D-ST313), comumente associado com doenças invasivas severas, particulamente no continente africano. Genes que codificam para a resistência aos antimicrobianos não-beta-lactâmicos e integrons classe 1 foram identificados entre as cepas de E. coli e de Salmonella spp. multirresistentes produtoras ou não de ESBLs. Em conclusão: i) nossos resultados referentes à E. coli confirmaram a disseminação de enzimas CTX-M (principalmente variantes do grupo CTX-M-2) desde, pelo menos, o ano de 2000, em hospitais no Rio de Janeiro; demonstraram a implicação dos plasmídeos IncA/C na disseminação de genes blaCTX-M; indicaram a possível evolução intra-plasmídeo de blaCTX-M-59 a partir de blaCTX-M-2; a observação da diversidade e multiplicidade de plasmídeos poderiam fornecer plataformas genéticas para a dispersão de diferentes genes e/ou elementos de resistência aos antimicrobianos; ii) em relação à Salmonella spp. este estudo descreveu, pela primeira vez, o isolamento, a partir de fórmula infantil, de uma cepa de S. Typhimurium produtora de ESBL; foi demonstrada a associação do gene blaSHV-5 com plasmídeo do tipo IncL/M, que é considerado epidêmico; foi identificado o clone D-ST313 de S. Typhimurium, que está associado a doenças invasivas severas no continente africano, que reuniu cepas isoladas exclusivamente do ambiente hospitalar.

Caracterização fenotípica e molecular de amostras de Enterococcus isoladas em um hospital universitário da cidade do Rio de Janeiro

Os enterococos estão amplamente distribuídos no ambiente. Nos seres humanos, compõem a microbiota do trato gastrintestinal, da cavidade oral e do trato geniturinário. Nas últimas décadas, esses microrganismos se tornaram importantes agentes etiológicos de infecções hospitalares. Uma característica marcante desses microrganismos é a resistência intrínseca a vários antimicrobianos utilizados habitualmente no tratamento de infecções, além de alguns fatores que tem sido relacionado à virulência de enterococos. Este estudo investigou a presença de enterococos em amostras de infecção e colonização de pacientes hospitalizados, profissionais de saúde, dietas hospitalares e manipuladores de alimentos. Foram analisadas 276 amostras de colonização, de quadros de infecção, dietas orais e manipuladores de alimento. Não foram recuperadas amostras dos profissionais de saúde. Todas as amostras foram submetidas a testes convencionais de caracterização do gênero e espécies. Testes de susceptibilidade aos antimicrobianos foram empregados pelo método de disco difusão, além da CIM para vancomicina e teicoplanina. A produção de biofilme e a expressão da gelatinase também foram avaliadas. Os genes de resistência a gentamicina, estreptomicina e vancomicina e os genes de virulência cylA, esp e fsr foram pesquisados pela técnica de PCR. O polimorfismo genético foi determinado por PFGE. A espécie E. faecalis foi a prevalente nas amostras isoladas de colonização e infecção (42,2% e 81,9%, respectivamente). E. casseliflavus (58,9%) foi a mais freqüente dentre as amostras das dietas hospitalares e E. faecium (46,7%) de manipuladores. Dentre as amostras de colonização as maiores taxas de resistência foram observadas para eritromicina (76,3%) e ciprofloxacina (53,9%). Dentre as amostras de infecção, >70% foram resistentes a eritromicina, ciprofloxacina e tetraciclina. Resistência a níveis elevados de gentamcina (HLR-GE) e estreptomicina (HLR-ST) foi detectada em 24,6% e 20,4% das amostras, respectivamente, e todas foram portadoras dos respectivos genes. A maioria das amostras de colonização (52,6%) e infecção (55,7%) foram multirresistentes. A taxa para resistência a níveis elevados de vancomicina foi de 5,2% e todas eram portadoras do gene vanA. Em relação a formação de biofilme, 70,2% foram produtoras, com uma maior freqüência dentre as de infecção. A expressão de gelatinase foi detectada em 28,9% e 44,3% das amostras de colonização e infecção, respectivamente. Nenhuma das amostras isoladas das dietas hospitalares e de manipuladores expressou gelatinase. Nas amostras pertencentes as espécies E. faecalis e E. faecium (n=109) 16,5%, 51,4% e 48,6% apresentaram produtos de amplificação referentes aos genes cylA, esp e fsr, respectivamente. A análise do polimorfismo genético revelou uma extensa diversidade dentre as amostras pertencentes as espécies E. faecalis e E. faecium, não acarretando um perfil eletroforético prevalente. Entretanto, foi observado um perfil único dentre as amostras de E. gallinarum resistentes a vancomicina (vanA). Este estudo mostrou que amostras de enterococos isoladas de diferentes fontes, não só de quadros infecciosos, podem representar um risco para a população, apontando para uma maior reflexão quanto ao papel desses microrganismos nas infecções humanas, particularmente no ambiente hospitalar.

Enterococcus faecium: caracterização molecular de amostras isoladas no período anterior e posterior a emergência da resistência à vancomicina no Estado do Rio de Janeiro

Nas últimas décadas, Enterococcus resistentes à vancomicina tem se destacado no cenário hospitalar em todo mundo. A emergência da resistência à vancomicina no Estado do Rio de Janeiro foi registrada em 2000, na espécie Enterococcus faecalis. Em seguida, Enterococcus faecium passou a ser prevalente. O objetivo deste estudo foi avaliar a diversidade genética das amostras de E. faecium sensíveis (VSEfm) e resistentes (VREfm) à vancomicina, isoladas em diferentes instituições de saúde do Estado do Rio de Janeiro no período de 1993 a 2008. As amostras bacterianas foram avaliadas por metodologia de eletroforese em campo pulsado (PFGE), após restrição com Smal, análise do polimorfismo numérico de segmentos repetitivos (MLVA) e tipagem por sequenciamento de múltiplos loci (MLST); além da detecção de marcadores fenotípicos, como a resistência à ampicilina e à ciprofloxacina, e genotípicos, como determinantes genéticos de virulência, que estão vinculados a um complexo clonal globalmente disperso (CC17). A diversidade de Tn1546 (que alberga o conjunto gênico vanA) foi determinada por amplificação e restrição com ClaI. Um grupo clonal prevalente foi observado pela metodologia de PFGE e agrupou amostras isoladas, principalmente, no período de 2004 a 2006, estando disseminado por diversas instituições de saúde do Estado, indicando transmissão inter- e intra-hospitalar. A avaliação por MLVA identificou dois MTs prevalentes dentre as amostras VREfm: MT12 relacionado à maioria das amostras dos principais grupos clonais identificados por PFGE e, o MT159 que apresentou frequência aumentada no ano de 2008. A análise por MLST destacou o ST78 associado aos principais grupos clonais definidos por PFGE, bem como, ao MT12. Também foi observada correlação entre o ST412 associado ao grupo clonal formado por apenas amostras de 2008 e o MT159. Foi notório por MLST que as amostras VREfm do Estado do Rio de Janeiro, no período do estudo, estiveram relacionadas CC17, juntamente com algumas amostras VSEfm. Entretanto, os principais marcadores de resistência e de virulência, característicos de CC17, estiveram mais relacionados as amostras VREfm do que as VSEfm, como resistência à ampicilina e à ciprofloxacina; e a presença do gene esp e do alelo purK1. A identificação de VSEfm pertencentes ao CC17 sugerem que amostras já adaptadas ao ambiente hospitalar, podem ter adquirdo o determinante de resistência vanA, facilitando a emergência de amostras de VREfm. Adicionalmente, nossos dados sugerem uma modificação no cenário de amostras VREfm no Rio de Janeiro. Pois a dominância de um grupo clonal prevalente (PFGE- X; MT12; ST78) pode estar sendo substituída pela possível emergência de um novo grupo clonal, que foi característico de amostras mais recentes (PFGE-XV; MT159; ST412), apontando assim, para um novo curso na epidemiologia dos E. faecium no Estado. Um perfil de restrição prevalente de Tn1546 idêntico ao protótipo foi observado, apontando que a disseminação da resistência à vancomicina ocorreu por também por transferência horizontal. Entretanto, alterações do tipo deleção e presença de elementos de inserção com aproximadamente 2 kb foram observadas em um número reduzido das amostras. A incongruência no genótipo vanA, em relação ao fenótipo, foi observado para uma amostra. Considera-se fundamental o acompanhamento da disseminação de VREfm, particularmente diante da elevada frequência de amostras pertencentes a um complexo clonal que conjuga multirresistência com virulência, com elevado potencial de adaptabilidade e disseminação.

Análise dos aspectos biológicos e epidemiológicos de cepas de Escherichia coli associadas à infecção do trato urinário (ITU)

A invasão de bactérias no trato urinário caracteriza a infecção do sistema urinário. A Escherichia coli é o principal microrganismo associado a esta infecção devido a sua importância em causar ITU, recebeu a denominação de UPEC (Escherichia coli uropatogênica). No presente trabalho pesquisamos em 50 cepas de UPEC, inicialmente isolados de urina de pacientes ambulatoriais com infecções sintomática ou assintomática, a presença de 7 fatores de virulência, através das técnicas de PCR simples e multiplex para verificação dos genes que codificam adesinas P (pap) , fímbria S (sfa), adesina afimbrial (afa), sideroforo (aerobactina- aer), toxinas fator necrotizante citotóxico (cnf) e alfa-hemolisinas (hly), proteína de membrana (traT); ilhas de patogenicidade (virulência) através do marcador PAI. O marcador pCVD432 de EAEC também foi pesquisado nestas amostras. O método difusão em disco foi o utilizado para a determinação dos testes de susceptibilidade aos antimicrobianos. Podemos observar duas faixas etárias de maior incidência de ITU entre as mulheres: 19 a 35 anos, e acima de 50 anos. Sessenta e oito por cento das amostras apresentaram pelo menos um fator de virulência, onde os genes traT (54%) e aer (34%) foram os mais prevalentes. A sequência pCVD432 foi detectado em 6 amostras. No entanto, no ensaio de adesão em células Hep-2, doze amostras não apresentaram aderência (NA 24%). Nas 38 cepas restantes, 24 (48%) apresentaram aderência agregativa (AA). Observamos aderência sem padrão típico (SPT) em 48% das amostras, tendo sido dividido em discreto (SPT-D 22%), moderado (SPT-M 18%) e intenso (SPT-I 8%). Notamos os seguintes perfis de resistência para os antimicrobianos testados: ampicilina (44%), gentamicina (8%), nitrofurantoína (2%), norfloxacino (18%) e sulfametozaxol-trimetoprima (34%).

Effects of probiotics and antibiotics on biofilms

Experiments were conducted to study the effects of probiotics and antibiotics on 3-months old biofilms formed on three different substrates, namely glass, granite and fiberglass reinforced plastic. The variations in heterotrophic bacterial populations associated with biofilms were monitored for a period of one month after one-time application of the probiotic Biogreen (Gee Key Marine Pvt. Ltd, Chennai) at 0.2 mg lˉ¹ and the antibiotic tetracycline at 1.0 mg lˉ¹. The variations in heterotrophic bacterial populations associated with biofilms were compared with that of control to analyse the effects of probiotics and antibiotics on biofilms. The observations showed that the biofilm formation and succession in aquatic environment is substrate dependent and that the resistance to antibiotics also depends on the substrate. The probiotics did not show significant effect on biofilms.

Distribution of drug resistant luminous bacteria in penaeid shrimp grow-out ponds

Distribution of luminous bacteria (LB) in penaeid shrimp grow-out pond water in semiintensive seawater farming system and their resistance to 15 antibacterials were investigated. Total viable counts and luminous bacterial counts in pond water ranged from 2.00xl03 to 1.35xl04/ml and l.OOxl01 to 8.00Xl02/ml, respectively. The percentage composition of LB in the total viable population increased significantly with period of culture. Five species of LB such as Vibrio fischeri, V. harveyi, V. orientalis, V. splendidus 1 and Photobacterium leiognathi were encountered. V. harveyi was the dominant species, constituting >80% of the total LB. Multiple antibiotic resistance was more common in these LB. Pond water isolates showed resistance to at least four antibacterial agents.

Maximins S, a novel group of antimicrobial peptides from toad Bombina maxima

Amphibian skin secretions are rich in antimicrobial peptides acting as important components of innate defense system against invading microorganisms. A novel type of peptide, designated as maximin S, was deduced by random sequencing of 793 clones from a constructed Bombina maxima skin cDNA library. The putative primary structures of maximin S peptides can be grouped into five species, in which maximin S I has 14 amino acid residues and the rest of maximin S peptides (S2-S5) all have 18 amino acid residues. Unlike most of the amphibian antimicrobial peptides so far identified, the newly characterized four maximin S precursors are composed of maximin S I and different combinations of tandem repeated maximin S2-S5 linked by internal peptides. Except maximin S I, the predicted secondary structures of maximin S2-S5 show a similar amphipathic alpha-helical structure. MALDI-TOF mass spectrometry analysis of partially isolated skin secretions of the toad indicates that most of the deduced maximin S peptides are expressed. Two deduced maximin S peptides (S1, S4) were synthesized and their antimicrobial activities were tested. Maximin S4 only had an antibiotic activity against mycoplasma and had no antibacterial or antifungal activity toward tested strains. Maximin S1 had no activity under the same conditions. (C) 2004 Elsevier Inc. All rights reserved.

Improved handling and preservation of freshwater giant prawn, Macrobrachium rosenbergii for producing safe and wholesome products

Studies were undertaken to evaluate the quality changes in freshwater giant prawn, Macrobrachium rosenbergii during various storage conditions of handling and preservation and producing safe and quality products. The samples kept in ice immediately after catch with head-on and head-less condition were found to be acceptable for 6 days and 7 days, respectively. Delaying of icing considerably shortened the shelf-life. The pH value increased from 6.36 to 8.0 after 10 days in ice. The initial average TVB-N value of sample increased from below 10 mg/100 g to 25 mg/100 g with the lapse of storage period. The Ca++ ATPase activity in presence of 0.1M KCl slightly decreased at the end of 10 days of ice storage. Immediately after harvest, initial aerobic plate count (APC) was 2.88x10^6 CFU/g which gradually increased to 1.12x10^8 CFU/g after 6 days in ice storage and showed early signs of spoilage. Initial bacterial genera in the prawn iced at 0 hours were comprised of Coryneform (22.21 %), Bacillus (7.40%), Micrococcus (11.11 %), Achromobacter (48.14%), Flavobacterium/Cytophaga (7.40%), Pseudomonas (3.70%) and Aeromonas (3.70%). During ice storage Coryneforms and Bacillus were always dominating along with less prominent ones - Micrococcus, Achromobacter and Flavobacterium. Studies were conducted on the stability of myofibrillar protein of M. rosenbergii under different storage and pH conditions. The influence of a wide range of pH on the remaining Ca++ ATPase activity of M. rosenbergii muscle myofibrils after storage at -20°C for 2 days, at 0°C for 2 days and at 35°C for 30 minutes demonstrated that ATPase activities were lower in acidic and alkaline pH regions and the activity remained relatively high. Mg++ ATPase activities both in presence and absence of Ca++ remained high at neutral pH compared to those of acidic and alkaline region. The solubility of myofibrillar protein decreased gradually both in acidic and alkaline pH regions. The study also examined the bacteriological quality of freshly harvested M. rosenbergii, pond sediment and pond water from four commercial freshwater prawn farms at Fulpur and Tarakanda upazilas in the district of Mymensingh. The study included aerobic plate count (APC), total coliform count, detection, isolation and identification of suspected public health hazard bacteria and their seasonal variation, salt tolerance test, antibiotic sensitivity test of the isolates and washing effect of chlorinated water on the bacterial load in the prawn samples. APC in sediment soil and water of the farm and gill and hepatopancreas of freshly harvested prawns varied considerably among the farms and between summer and winter season. The range of coliform count in water, gill and hepatopancreas ranged between 6 - 2.8x10^2 CFU/ml, 1.2x10^2 - 3.32x10^2 CFU/g and 1.43x10^2 - 3.89 x10^3 CFU/g, respectively. No coliform was detected in pond sediment sample. Suspected health hazard bacteria isolated and identified from pond sediment, water, gill and hepatopancreas included Streptococcus, Bacillus, Escherichia coli, Klebsialla, Salmonella, Staphylococcus, Pseudomonas and Aeromonas. Bacillus, Salmonella and Staphyloccus [sic], and were found to be highly salt tolerant and capable of growing at 10% NaCl. The antibiotic discs with different concentration of antibiotics were used for the sensitivity test. The organisms were found to be most sensitive against Tetracyclin and Gentamycin.

Use of antibiotics in the preservation of prawn

Effect of incorporating chlorotetracycline (CTC) in ice up to 5 ppm level on the keeping quality of prawns has been studied. A shelf life extension by nearly six days is obtained for the CTC-iced sample over the control. The headless prawns absorbed greater amounts of CTC than whole prawns during storage in CTC-ice. Traces of the antibiotic are found in the muscle of the CTC-iced prawns even after cooking for one hour. The cause of destruction of CTC when used for prawn preservation is discussed.

Effect of furanace on the development of larval stages of Penaeus monodon Fabricius

Zoea 2(Z SUB-2 ) Mysis 1 (M SUB-1 ) and Postlarva 1 (P SUB-1 ) of P. monodon artificially spawned in closed-system concrete hatchery tanks were bioassayed for their tolerance to the antibiotic furanace. The setup consisted of four 20-liter capacity plastic basins previously conditioned for 15 days with freshwater in full sunlight. During the experiment, each basin was filled with 5 liters of seawater to which was added filtered Chaetoceros and Brachionus to give densities of 5 . 0-7 . 5 x 10 SUP-4 cells/ml and 10-20 individuals/ml, respectively. The following are the properties of the water used throughout the experiments: salinity, 26-32%; pH, 7 . 3-8 . 4; temperature, 25-30 degree C; dissolved oxygen, 4 . 5-8 . 4 ppm; nitrite, 0 . 36-0 . 99 ppm; and ammonia, 0 . 10-0 . 30 ppm. To each basin were added 50 healthy larvae of specific stages of P. monodon. After an initial acclimation of one hour in the medium, preweighed amounts of the antibiotic were added and thoroughly dissolved. The concentrations tested were 1 . 0, 2 . 0 and 3 . 0 ppm. One basin always served as control. After 24 hours of exposure, the surviving population in each basin was counted. The survivors were then examined thoroughly under the microscope for unusual behavior and morphological defects brought about by the exposure. To minimize wide variations in the medium as a result of feeding and other manipulations, the systems were all prepared at 9:00 a.m. each time, and the feeds on two instances, one at 5:00 p.m. and another at 5:00 a.m. Fifteen trials conducted with Z SUB-2 showed survival ranges of 68% to 98% with a mean of 77 . 6% in the controls; 32% to 94% with a mean of 65 . 7% at 1 ppm, and 0% to 56% with a mean of 36 . 5% at 2 ppm. There were no survivors at 3 ppm. Interpolation from the survival-dose curve gave a 24-hr LC SUB-50 of approximately 1 . 6 ppm.

The trouble with antibiotics and pesticides is...

The paper discusses the output of the meeting on the use of chemicals in aquaculture in Asia. The effects of chemical use on cultured stocks in the farm, the immediate environment through discharges and effluents, surrounding areas, farm staff, consumers and drug resistance organisms are also discussed. It also shows how an antibiotic-resistant microorganism develops as the result of indiscriminate use of antibiotics.

Effect of antibiotics on development in vitro of hamster pronucleate ova

Antibiotics are commonly added to embryo culture media, but effects on embryo development have not been examined thoroughly. Hamster ova were used to investigate whether penicillin, streptomycin or gentamicin affect embryo development in vitro. Ova were collected 10 h post activation by spermatozoa in vivo and cultured in five treatments: 1) Control: chemically-defined medium HECM-9 with no antibiotics; 2) HECM-9 with 100 IU/mL, penicillin; 3) HECM-9 with 50 mug/mL streptomycin; 4) HECM-9 with 10 mug/mL,gentamicin and 5) HECM-9 with both 100 IU/mL penicillin and 50 mug/mL streptomycin. Individually, penicillin, streptomycin and gentamicin did not affect embryo development to the 8-cell stage at 58 h post oocyte activation, or morula/blastocyst stages, or blastocysts alone at 82 h post activation. However, when penicillin and streptomycin were both present in the culture medium the percentages of 8-cell embryos at 58 h and blastocysts at 82 h were significantly lower than the control. No antibiotic treatment improved hamster embryo development in vitro. We caution against the use of penicillin and streptomycin together for hamster embryo culture, and show that it is not necessary to include any antibiotics in embryo culture media for up to 72 h if proper sterile technique is used with an oil overlay. (C) 2000 by Elsevier Science Inc.

A TPR-family membrane protein gene is required for light-activated heterotrophic growth of the cyanobacterium Synechocystis sp PCC 6803

The unicellular cyanobacterium Synechocystis sp. PCC6803 can grow heterotrophically in complete darkness, given that a brief period of illumination is supplemented every day (light-activated heterotrophic growth, LAHG), or under very weak ( < 0.5 mumol m(-2) s(-1)) but continuous light. By random insertion of the genome with an antibiotic resistance cassette, mutants defective in LAHG were generated. In two identical mutants, sll0886, a tetratricopeptide repeat (TPR)-family membrane protein gene, was disrupted. Targeted insertion of sll0886 and three downstream genes showed that the phenotype was not due to a polar effect. The sll0886 mutant shows normal photoheterotrophic growth when the light intensity is at 2.5 mumol m(-2) s(-1) or above, but no growth at 0.5 mumol m(-2) s(-1). Homologs to sll0886 are also present in cyanobacteria that are not known of LAHG. sll0886 and homologs may be involved in controlling different physiological processes that respond to light of low fluence. (C) 2003 Federation of European Microbiological Societies. Published by Elsevier Science B.V. All rights reserved.

D2-4放线菌的筛选及其抗生物质研究

利用有益微生物及其代谢产物来防治植物病害，已成为一个十分活跃并具有巨大应用前景的领域。本论文采用土壤预处理等特殊方法，从长白山不同高度的土壤中筛选出1068株放线菌。通过对峙培养法和杯碟法，筛选出D1-1等10株对蔬菜病害菌具有抑制作用的菌株。离体叶片实验中发现D2-4发酵液对黄瓜、辣椒、番茄等蔬菜真菌病害具有一定的防治效果。以水和常用化学农药作为空白和药物对照，对D2-4发酵液进行了盆栽实验，结果对番茄灰霉、辣椒根腐和黄瓜枯萎病的防治效果分别为70.65％、63.27％、65.04％，初步显示出良好的防治效果。通过单因素和均匀设计实验，优化了DZ-4菌发酵培养基的组成，考察了培养时间、接种量、菌龄等对抑菌活性的影响。确定了最佳发酵培养基成分：黄豆饼粉1.10％、葡萄糖2.71％、蔗糖1.00％、NaCl0.10％、酵母膏0.10％、发酵培养基初始pH为6.61。最佳发酵时间为96h左右，培养20～24h的种子液以7％的接种量转接有利于提高抑菌活性。经发酵培养基和发酵条件的优化，发酵液抑菌活性达到了6588 u／ml，比原始发酵培养基（3678 u／ml）活性提高了79.12％。经发酵液的预处理、离子交换层析、吸附柱层析、高效液相色谱纯化等步骤，对D2-4抗生素进行了分离纯化研究。通过纸层析、纸电泳等试验最后确定该农用抗生素为弱碱性水溶性抗生素。对D2-4抗生素纯品进行了红外吸收光谱、紫外吸收光谱等理化性质的研究。

繁茂膜海绵中放线菌的鉴定及S19抗菌素主要特性的研究

近年的研究表明，海绵微生物是某些海绵天然产物的真正产生者。因此，人们将海绵微生物作为开发海绵天然产物的重要来源之一。采用琼脂块法和液体扩散法，从分离自中国黄渤海大连海域的海绵优势种—繁茂膜海绵的28株放线菌中筛选到4株具有抗菌活性的放线菌，并对它们进行生物学鉴定。采用经典和现代分类鉴定方法，对4株具有抗菌活性的繁茂膜海绵放线菌的形态特征、培养特征、生理生化特征、细胞壁化学组分和16SrRNA序列进行了研究，得出种水平的鉴定结果：Hmp-S14为西唐氏链霉菌Streptomycessetonii；Hmp-S19为灰色链霉菌Streptomyces griseus；Hmp-S24为桔橙小单抱菌Micromonospora aurantiaca；Hmp-S26为生二素链霉菌Streptomyces ambifaciens。在四株具有抗菌活性的繁茂膜海绵放线菌中，菌株Hmp-S19的抗菌活性优于其它三株，并且与已报道的20多种灰色链霉菌菌株有不同的生理生化特性，故进一步优化其发酵条件并初步研究了S19抗菌素的理化性质。通过单因子和均匀设计实验，优化菌株Hmp-S19摇瓶发酵条件。确定最佳发酵培养基：玉米粉0.6％，葡萄糖0.1％，豆饼粉0.5％，NaCl 0.3％，KH2PO40.08％，CaCO30.08％，MgSO40.02％；最佳发酵条件：接种龄30h，接种量5％，初始pH7．0，发酵时间96h，装液量100ml／50ml，培养温度28 ℃。应用二剂量法测定519一抗菌素的相对效价，为5154μ/ml，较原始发酵培养基和发酵条件（3364μ/ml）提高了53％。通过pH纸层析和捷克八溶剂系统纸层析试验，初步判定519抗菌素为两性、非水溶性I型抗菌素。Hmp-S19发酵液经预处理、萃取、硅胶柱层析、制备薄层层析等步骤，对S19抗菌素进行分离纯化得粗制品，并进行了液 相色谱一质谱检测。