Rôle des récepteurs Toll-like et de la protéine adaptatrice MyD88 dans la régulation de l’hepcidine et le développement des hyposidérémies associées à l’inflammation

Le fer est un oligo-élément nécessaire pour le fonctionnement normal de toutes les cellules de l'organisme et joue un rôle essentiel dans de nombreuses fonctions biologiques. Cependant, le niveau de fer dans le corps doit être bien réglé, sinon la carence en fer entraine des divers états pathologiques tels que l'anémie et la diminution de l’immunité. D'autre part, une surcharge en fer potentialise la multiplication des germes, aggrave l’infection et la formation de radicaux libres ayant des effets toxiques sur les cellules et leurs composants, ce qui favorise les maladies cardio-vasculaires, l'inflammation et le cancer. L'hepcidine (HAMP), un régulateur négatif de l'absorption du fer, induit la dégradation de la ferroportine (FPN), le seul exportateur connu de fer ce qui réduit sa libération par les macrophages et inhibe son absorption gastro-intestinale. HAMP est synthétisé principalement par les hépatocytes, mais aussi par les macrophages. Cependant, il y a très peu de données sur la façon dont HAMP est régulé au niveau des macrophages. Plus récemment, nous avons constaté que l’induction de l’hepcidin dans le foie par le polysaccharide (LPS) est dépendante de la voie de signalisation médiée par « Toll-like receptor 4 » (TLR4). Grâce au TLR4, le LPS induit l'activation des macrophages qui sécrètent de nombreuses différentes cytokines inflammatoires, y compris Interleukine 6 (IL-6), responsable de l'expression de HAMP hépatique. Dans le premier chapitre de la présente étude, nous avons étudié la régulation de HAMP dans la lignée cellulaire macrophagique RAW264.7 et dans les macrophages péritonéaux murins stimulés par différents ligands des TLRs. Nous avons constaté que TLR2 et TLR4 par l'intermédiaire de la protéine adaptatrice « myeloid differentiation primary response gene 88 » (MyD88) activent l'expression de HAMP dans les cellules RAW264.7 et les macrophages péritonéaux sauvages murins, tandis que cette expression a été supprimée dans les macrophages isolés des souris TLR2-/-, TLR4-déficiente ou MyD88-/-. En outre, nous avons constaté que la production d'IL-6 par les cellules RAW264.7 stimulées avec du LPS a été renforcée par l’ajout des quantités élevées de fer dans le milieu de culture. Au cours de l’inflammation, le niveau de HAMP est fortement augmenté. Ainsi, lorsque l'inflammation persiste, l’expression de HAMP continue à être activée par des cytokines pro-inflammatoires conduisant à une hyposidérémie. Malgré que cette dernière soit considérée comme une défense de l'hôte pour priver les micro-organismes de fer, celle ci cause un développement d'anémies nommées anémies des maladies chroniques. Ainsi, dans le deuxième chapitre de la présente étude, nous avons étudié l'implication des TLRs et leurs protéines adaptatrices MyD88 et TIR-domain-containing adapter-inducing interferon-β (TRIF) dans le développement des hyposidérémies. En utilisant des souris déficientes en MyD88 et TRIF, nous avons montré que les voies de signalisations MyD88 et TRIF sont essentielles pour l’induction de HAMP par le LPS. Malgré l'absence de HAMP, les souris déficientes ont été capables de développer une hyposidérémie, mais la réponse des souris déficientes en MyD88 a été très légère, ce qui indique l'exigence de cette protéine pour assurer une réponse maximale au LPS. En outre, nous avons constaté que la signalisation MyD88 est nécessaire pour le stockage du fer au niveau de la rate, ainsi que l'induction de lipocaline 2 (LCN2), qui est une protéine impliquée dans la fixation du fer pour limiter la croissance bactérienne. Indépendamment de MyD88 ou TRIF, l'activation de TLR4 et TLR3 a conduit, au niveau de la rate, à une diminution rapide de l’expression de FPN et du « Human hemochromatosis protein » (HFE) qui est une protéine qui limite la séquestration du fer cellulaire à partir de la circulation. Cependant, malgré cette baisse d’expression, le manque de la signalisation MyD88 a altéré de manière significative la réponse hyposidérémique. En établissant le rôle des TLRs et de la protéine adaptatrice MyD88 dans la diminution du taux du fer sérique au cours de la réponse inflammatoire, nous avons remarqué qu’en réponse au surcharge en fer les souris déficientes en MyD88 accumulent de manière significative plus de fer hépatique par rapport aux souris sauvages, et cela indépendamment des TLRs. Ainsi, dans le troisième chapitre de la présente étude, nous avons étudié le phénotype observé chez les souris déficientes en MyD88. Nous avons trouvé que l'expression de HAMP chez ces souris a été plus faible que celle des souris de type sauvage. Pour cela, nous avons exploré la signalisation à travers la voie du « Bone Morphogenetic Proteins 6 » (BMP6) qui est considérée comme étant la voie fondamentale de la régulation de HAMP en réponse aux concentrations du fer intracellulaires et extracellulaires et nous avons trouvé que l'expression protéique de Smad4, un régulateur positif de l'expression de HAMP, est significativement plus faible chez les souris MyD88-/- par rapport aux souris sauvages. En outre, on a montré que MyD88 interagit avec « mothers against decapentaplegic, Drosophila, homolog 4 » (Smad4) et que cette interaction est essentielle pour l’induction de HAMP à travers la voie BMP6. En conclusion, notre étude montre que l'expression de HAMP dans les macrophages est régulée principalement par TLR2 et TLR4 à travers la voie MyD88 et que l'accumulation du fer dans les macrophages peut affecter les niveaux des cytokines pro-inflammatoires. En outre, nos analyses démontrent que le développement d’hyposidérémie en réponse au LPS se produit par l'intermédiaire d’un mécanisme dépendant de MyD88 qui est dissociée de la production de cytokines et de HAMP. En plus, nos recherches montrent que MyD88 est nécessaire pour l'expression de Smad4 et cela pour garantir une réponse optimale à travers la signalisation BMP6, conduisant ainsi à une expression adéquate de HAMP. Enfin, la protéine MyD88 joue un rôle crucial dans, la régulation de HAMP au niveau des macrophages, la diminution du taux du fer sérique en réponse au LPS et le maintien de l'homéostasie du fer.

La protéine accessoire Vpu du VIH-1 inhibe l'activité antivirale des pDCs à travers un processus ILT7-dépendant

Viral protein U (Vpu) is an accessory protein of HIV‐1 that efficiently targets BST2/Tetherin, a cellular restriction factor that acts as molecular anchor impeding the release of various enveloped viruses from the cell surface. The recently discovered natural receptor of BST2 is ILT7, a molecule exclusively expressed at the surface of the professional type 1 interferon (IFN‐1) producing cells, plasmacytoid dendritic cells (pDCs). The interaction between BST2 and ILT7 has been reported to efficiently induce a repression of IFN­‐1 secretion by pDCs. Here, we investigated the impact of Vpu mediated antagonism of BST2, in regards to this newly described immune function of BST2. Using a system of CD4+ T cell lines infected with wild type or Vpu‐deficient HIV-­1 cultured with peripheral blood mononuclear cells or purified pDCs, we report that the presence of Vpu efficiently reduces IFN-­1 production from sensing pDCs. Furthermore, we observed that this Vpu effect is dependent on the availability of BST2 molecules at the surface of the infected cells, since the Vpu's immunoregulation is abrogated when blocking any potential BST2 trans interaction with anti­‐BST2 antibodies. Similarly, depleting ILT7 from pDCs by means of small interfering RNA treatment equally negates the downregulation of pDC IFN-­1 secretion by Vpu. Finally, the use of recombinant soluble ILT7 competes with pDC‐bound ILT7 for the free BST2 and similarly results in high IFN-­1 production, causing an identical phenotype. Overall, our results demonstrate that Vpu heightens ILT7 activation and subsequent repression of IFN‐1 production by pDCs in response to HIV­‐1 infected CD4+ T cells by promoting it's trans interaction with infected T cell bound BST2, through a yet uncharacterized mechanism. By allowing efficient particle release and restraining pDCs antiviral functions, Vpu exerts a double role on BST2 that seems crucial for the replication and dissemination of HIV‐1.

Caractérisation de stratégies stimulant l’immunité cellulaire par l’étude de la présentation antigénique d’une nanoparticule vaccinale et du blocage d’un mécanisme d’immunosuppression

Il existe plusieurs défis au développement d’une thérapie visant à stimuler l’immunité cellulaire. Dans la prévention contre certains virus et en immunothérapie du cancer, l’induction de lymphocytes T spécifiques est cependant primordiale. Dans la première partie de l’étude, nous avons porté notre attention sur la compréhension de la présentation croisée par le complexe majeur d’histocompatibilité de classe I (CMH I) médiée par des particules pseudo-virales (VLP) composées de la protéine de surface de potexvirus à laquelle nous avons ajouté un épitope de la protéine M1 du virus de l’influenza ou un épitope de la protéine gp100 du mélanome. Cette VLP se caractérise par sa capacité à stimuler, sans l’aide d’adjuvant, le système immunitaire et de présenter de façon croisée l’épitope inséré dans sa protéine de surface et ce, indépendamment de l’activité du protéasome. Nous avons, tout d’abord, comparé les propriétés de présentation antigénique croisée des VLP formées du virus de la mosaïque de la malva (MaMV) à celles des VLP du virus de la mosaïque de la papaye (PapMV). Les résultats confirment que ces propriétés sont partagées par plusieurs membres de la famille des potexvirus malgré des divergences de séquences (Hanafi et al. Vaccine 2010). De plus, nous avons procédé à des expériences pour préciser le mécanisme menant à la présentation de l’épitope inséré dans les VLP de PapMV. Les résultats nous confirment une voie vacuolaire dépendante de l’activité de la cathepsine S et de l’acidification des lysosomes pour l’apprêtement antigénique. L’induction de l’autophagie par les VLP semble également nécessaire à la présentation croisée par les VLP de PapMV. Nous avons donc établi un nouveau mécanisme de présentation croisée vacuolaire dépendant de l’autophagie (Hanafi et al. soumis Autophagy). En second lieu, en immunothérapie du cancer, il est aussi important de contrôler les mécanismes d’évasion immunitaire mis en branle par la tumeur. Nous avons spécifiquement étudié l’enzyme immunosuppressive indoleamine 2,3-dioxygénase (IDO) (revue de la littérature dans les tumeurs humaines; Hanafi et al. Clin. Can. Res 2011) et son inhibition dans les cellules tumorales. Pour ce faire, nous avons tenté d’inhiber son expression par la fludarabine, agent chimiothérapeutique précédemment étudié pour son activité inhibitrice de l’activation de STAT1 (signal transducers and activators of transcription 1). Étonnamment, nos résultats ont montré l’inhibition d’IDO dans les cellules tumorales par la fludarabine, indépendamment de l’inhibition de la phosphorylation de STAT1. Nous avons démontré que le mécanisme d’action dépendait plutôt de l’induction de la dégradation d’IDO par le protéasome (Hanafi et al. PlosOne 2014). Les travaux présentés dans cette thèse ont donc portés autant sur la compréhension d’une nouvelle plateforme de vaccination pouvant médier l’activation de lymphocytes T CD8+ cytotoxiques et sur le contrôle d’une immunosuppression établie par les cellules tumorales pour évader au système immunitaire. Ces deux grandes stratégies sont à considérer en immunothérapie du cancer et la combinaison avec d’autres thérapies déjà existantes pourra permettre une meilleure réponse clinique.

Nouvelle approche immunothérapeutique afin de traiter le neuroblastome réfractaire chez l’enfant

Malgré plusieurs chimiothérapies suivies d’une transplantation et d’une immunothérapie, 40% des patients avec un neuroblastome (NB) à haut risque subissent une progression de la maladie ou une rechute. L’échec de ces traitements est attribué à la présence de cellules initiatrices de tumeur (TIC) qui expriment le marqueur CD133 et qui sont souvent résistantes aux agents chimiothérapeutiques. Les cellules Natural Killer (NK), qui possèdent un effet anti-tumoral, peuvent être utilisées dans le cadre du développement de nouvelles approches immuno-thérapeutiques. Nous posons l’hypothèse que les cellules NK activées éliminent efficacement les TIC et contribuent à la réduction des risques de rechute. De plus, il est possible d’augmenter l’effet anti-tumoral des cellules NK contre le NB. L’activité cytotoxique des cellules NK est augmentée par des cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC) activées. A la suite de la stimulation de leurs récepteurs Toll-like les pDC produisent de grandes quantités d'interféron-alpha (IFN-α). Nous avons étudié les propriétés lytiques des cellules NK contre des lignées cellulaires de NB à la suite de leur activation par l’IFN-α ou des pDC activées. Nos résultats révèlent une augmentation de l’activité cytolytique des cellules NK contre ces lignées en réponse à une stimulation par les pDC activées. De plus, les cellules de NB CD133+ ou celles résistantes à l’immunothérapie dirigée contre le GD2 sont sensibles à la lyse médiée par les cellules NK stimulées par les pDC. Nous avons examiné les mécanismes cellulaires impliqués dans la lyse des cellules de NB. Nous montrons que cette cytotoxicité est médiée en partie par TRAIL induisant l'apoptose et en partie par la libération des granules cytotoxiques. Ainsi, ces résultats permettent de proposer une nouvelle approche immuno-thérapeutique complémentaire au traitement par l’anticorps anti-GD2 pour les patients atteints de NB à haut risque.

L’immunothérapie orale pour le traitement des allergies alimentaires multiples

La prévalence des allergies alimentaires IgE-médiées aurait triplé au cours de la dernière décennie avec des études Nord-Américaines atteignant les 8% chez les enfants. Quoiqu’il n’y ait à ce jour aucun traitement curatif pour les allergies alimentaires, l’immunothérapie oral (OIT) constitue une nouvelle approche expérimentale prometteuse. Cette dernière consiste en l’administration de doses progressive d’allergènes par voie orale sur une période prolongée dans le but d’instaurer un état de désensibilisation et possiblement une tolérance orale soutenue. Cette approche a été démontrée sécuritaire et permettrait la désensibilisation à haute dose de plus de 80% des participants allergiques aux arachides, lait ou œufs. Dans cette thèse, nous présentons 2 études de phase 1 portant sur des protocoles d’OIT, destinés à optimiser l’efficience du traitement chez les sujets avec allergies alimentaires multiples. Près de 30% des enfants avec allergie alimentaire sont allergiques à plus d’un aliment, une proportion qui augmente à 70% lorsqu’on considère les cas les plus sévères. Ces enfants sont à risque augmenté de réactions accidentelles et souffrent d’un impact plus grand sur leur qualité de vie. Dans la première étude, en créant un mélange individualisé avec un ratio stochiométrique 1:1 entre les protéines des aliments allergiques de l’enfant, nous démontrons qu’il est possible de désensibiliser jusqu’à 5 aliments simultanément avec un profil d’innocuité similaire à une monothérapie. Dans la seconde étude, nous utilisons un traitement à l’omalizumab, un anticorps monoclonal anti-IgE, pour permettre une désensibilisation orale multi-allergénique fortement accélérée. Lorsque comparé à l’approche sans omalizumab, ce protocole s’associe à une nette diminution du temps requis pour atteindre les doses d’entretien, passant d’une médiane de 21 à 4 mois, sans affecter le profil d’innocuité. Alors que ces études fournissent des approches cliniques raisonnables pour désensibiliser la population multi-allergique, plusieurs questions persistent, notamment en ce qui a trait à l’induction de tolérance permanente. Une barrière majeure à cet égard réside dans notre piètre compréhension des mécanismes sous-jacents à l’immunothérapie. Prenant avantage d’échantillons cliniques bien caractérisés provenant des essais cliniques ci-haut mentionnés, nous utilisons les nouvelles technologies de séquençage TCR pour suivre la distribution clonale des lymphocytes T spécifiques aux arachides durant une immunothérapie orale. Nous démontrons que l’OIT s’associe à des changements significatifs dans les fréquences des clones spécifiques, suggérant un processus d’épuisement clonal et de remplacement. Nous démontrons par ailleurs que le test de prolifération lymphocytaire, traditionnellement utilisé pour évaluer la réponse cellulaire allergique, est dominé par une distribution polyclonale hautement non-spécifique. Cette observation a des implications majeures considérant que la plupart de la littérature actuelle sur la réponse T se base sur cette technique. En somme, cette thèse jette les bases pour des programmes de recherche translationnelle pour optimiser et personnaliser les protocoles cliniques actuels et développer de nouvelles avenues d’investigation et de traitement pour améliorer la prise en charge des sujets avec allergies alimentaires.

La modulation du métabolisme cellulaire par l'E3 Ubiquitine Ligase MARCH-1

La relocalisation et la dégradation médiée par ubiquitination sont utilisées par la cellule pour contrôler la localisation et l’expression de ses protéines. L’E3 ubiquitine ligase MARCH1 est impliqué dans la régulation post-traductionnelle de CMH-II et de CD86. Dans ce mémoire, on propose un rôle additionnel à MARCH1. Nos résultats expérimentaux nous portent à croire que MARCH1 pourrait moduler le métabolisme cellulaire en favorisant la relocalisation et la dégradation d’enzymes impliquées dans la glycolyse. La grande majorité des cellules utilise la phosphorylation oxydative pour générer de l’ATP en présence d’oxygène. Dans un environnement hypoxique, cette dernière est non fonctionnelle et la cellule doit utiliser la glycolyse anaérobique pour produire son ATP. Une cellule cancéreuse à des besoins énergétiques supérieurs en raison de l’augmentation de sa biomasse et de sa prolifération incontrôlée. Pour subvenir à ces besoins, elle maximise sa production d’énergie en modifiant son métabolisme; c’est l’effet Warburg. On retrouve dans les cellules immunitaires des modifications similaires au métabolisme cellulaire suite à un signal d’activation. Ici, nous montrons que la respiration mitochondriale maximale, la réserve respiratoire et la glycolyse maximale sont diminuées dans les cellules présentatrice d’antigènes qui expriment MARCH1. Nous avons montré que MARCH1 était localisable au niveau de la mitochondrie, ce qui lui permet d’interagir avec les enzymes de la glycolyse. Finalement, nous avons quantifié l’expression de Eno1 et de LDHB par Western Blot, pour montrer une augmentation de l’expression de ces enzymes en absence de MARCH1. À la lumière de ces résultats, nous discutons des avantages que procure la diminution de l’expression de MARCH1 dans un contexte inflammatoire, suite à l’activation des cellules présentatrices d’antigènes. Ce phénomène permettrait une présentation antigénique plus efficace, une augmentation de la production d’énergie et une meilleure résistance aux ROS produits lors de la réponse inflammatoire.

Rôle du microenvironnement apoptotique tissulaire et du MFG-E8 dans la modulation de la réponse inflammatoire

L’inflammation fait partie des processus réactionnels de défense dont dispose l’organisme en réponse aux agressions, assurant l’intégrité de l’hôte. En réponse au dommage tissulaire, plusieurs médiateurs inflammatoires interviennent dans le processus de l’inflammation. Lors de ces dommages, des signaux de dangers provenant de cellules endommagées sont relâchés dans l’environnement tissulaire, pouvant causer des dommages cellulaires et tissulaires. Les macrophages, tout comme d’autres cellules, peuvent être activés par ces signaux de danger, menant à la sécrétion de molécules telles que des cytokines et des chimiokines pouvant modifier le microenvironnement tissulaire. Les insultes au tissu sain peuvent entrainer la mort cellulaire telle que l’apoptose. Les molécules pouvant être relâchées lors de celle-ci contribuent au microenvironnement, notamment de par l’influence de celles-ci sur le macrophage. Parmi ces médiateurs, nous avons identifié le Milk Fat Globule-Epidermal growth factor 8 (MFG-E8), un acteur important dans la résolution de l’inflammation, comme étant relâché spécifiquement par les cellules apoptotiques. Nous avons émis l’hypothèse que le microenvironnement apoptotique tissulaire, via la relâche de MFG-E8, module le phénotype du macrophage, modifiant le microenvironnement, la réponse inflammatoire ainsi que le devenir de l’insulte tissulaire. Nos objectifs sont 1) de caractériser ce microenvironnement apoptotique tissulaire et la cinétique de relâche du MFG-E8 par les cellules apoptotiques, 2) d’en évaluer son rôle dans la modulation du phénotype du macrophage ainsi que 3) d’en étudier, in vivo, son influence sur l’environnement inflammatoire et le devenir tissulaire. Dans le premier article présenté, nous avons démontré que les cellules endothéliales apoptotiques relâchent le MFG-E8 de façon Caspase-3 dépendante. La stimulation des macrophages par l’environnement conditionné par les cellules endothéliales apoptotiques mène à l’adoption d’un profil macrophagien davantage anti-inflammatoire et moindrement pro-inflammatoire. Ce phénotype est réduit par l’inhibition de la Caspase-3 et il dépend de la présence de MFG-E8. De plus, le potentiel du MFG-E8 à la reprogrammation du macrophage pro-inflammatoire a été démontré via un modèle expérimental de péritonite. Ce changement phénotypique médié par MFG-E8 implique une signalisation STAT3. Ayant démontré que les cellules épithéliales apoptotiques, à l’instar des cellules endothéliales apoptotiques, relâchent elles aussi de façon apoptose-dépendante le MFG-E8, nous avons étudié plus exhaustivement un modèle in vivo riche en apoptose épithéliale, l’obstruction urétérale unilatérale. Dans ce deuxième article présenté, nous rapportons l’implication bénéfique de MFG-E8 dans ce modèle de pathologie rénale obstructive. Nous avons constaté que la présence ou l’administration de MFG-E8 réduit le dommage tissulaire et la fibrose. La protection conférée par MFG-E8 est médiée via la modulation de l’activation de l’inflammasome. De plus, nos résultats illustrent l’importance du phénotype anti-inflammatoire du macrophage médié par le MFG-E8 dans la régulation négative de l’activation de l’inflammasome rénal et du dommage tissulaire. Cette thèse présente la première description de la relâche Caspase-3-dépendante de MFG-E8 par les cellules apoptotiques. Elle démontre également l’importance du MFG-E8 dans le microenvironnement apoptotique inflammatoire dans l’atténuation du phénotype pro-inflammatoire du macrophage. De plus, nous avons démontré son rôle protecteur dans des modèles in vivo de transplantation aortique et de réparation tissulaire, de même que dans un modèle de maladie rénale chronique où nous avons montré que cette protection conférée par MFG-E8 est médiée par la régulation négative de l’inflammasome tissulaire. Nos résultats suggèrent ainsi que le MFG-E8 pourrait être considéré comme un interrupteur inflammatoire et ainsi comme une cible potentielle dans la modulation de maladies inflammatoires.

Effect of Pyridoxine on Growth, Metabolism and Cellular Activity of Macrobrachium rosenbergii

Effect of pyridoxine on growth, metabolism and cellular activity of freshwater prawn Macrobrachiuni rosenbergii was studied. Postlarvae (PL-10) of M. rosenbergii were fed with clam meat containing various concentrations of pyridoxine. After 30 days RNA and DNA of the abdominal tissues were estimated. Length, weight and RNA to DNA ratio increased significantly with increasing concentrations of pyridoxine. The effect of pyridoxine on the metabolic enzyme, malate dehydrogenase, was also studied. Vmax showed a significant decrease and the (Km) showed a significant increase in experimental groups compared to control.

Cellular and humoral factors involved in defense mechanisms of Fenneropenaeus indicus (H. Milne Edwards, 1837)

The present investigation revealed three types of circulating haemocytes in the haemolymph of F. indicus: hyalinocytes, small-granule haemocytes, and large-granule haemocytes. Intermediate stages indicate the maturing process of a single cell. The presence of enzymes such as peroxidase, phenoloxidase and acid phosphatase in the haemocytes, and the substantial production of oxygen radicals during phagocytosis show that the haemocytes are capable of mounting a fme cellular defense mechanism. The enzyme activities of the serum and the presence of agglutinins in the serum, which may act as opsonins, agglutinate foreign particles and augment phagocytosis, confirm the presence of a superior humoral immune system in F. indicus.Bacterial infection caused considerable variations in the cellular and humoral factors, such as the number of circulating cells and haemagglutinating activity, especially in the initial hours of infection. The total haemocyte count, haemagglutination titer and phenoloxidase enzyme showed significant reductions on bacterial presence and could be used as indicators of bacterial infection.The number of circulating cells showed drastic fluctuation on exposure to pollutants. Nuvan at low concentrations was able to produce changes in the haemolymph factors and in the tissue organization, which implies that the animal is under stress and is easily prone to infections. Exposure to nuvan resulted in significant variation in all of the cellular and humoral factors, especially, the total haemocyte count, percentage of small granule haemocytes, phagocytic activity and the haemagglutinating activity, which might be good indicators of pesticide pollution. Heavy metal exposure caused significant increase in total haemocyte count and reduction in phenoloxidase enzyme activity Even changes in the physio-chemical parameters, such as salinity caused fluctuations in the defense factors, indicating stress in this euryhaline species. The dietary incorporation of a commercial immunostimulant containing P-l,3 glucan resulted in stimulation of some of the humoral defense factors of F indicus, but was time dependent. The modulations, on exposure to various external factors, in the cellular and humoral factors, especially, total haemocyte count, phagocytic activity, haemagglutinating activity and the phenoloxidase and acid phosphatase enzymes suggest that these parameters could be used as indicators of the health status of F indicus, which assist in better monitoring and effective health management of this important cultured species.

Truncated VP28 as oral vaccine candidate against WSSV infection in shrimp: An uptake and processing study in the midgut of Penaeus monodon

Several oral vaccination studies have been undertaken to evoke a better protection against white spot syndrome virus (WSSV), amajor shrimp pathogen. Formalin-inactivated virus andWSSV envelope protein VP28 were suggested as candidate vaccine components, but their uptake mechanism upon oral delivery was not elucidated. In this study the fate of these components and of live WSSV, orally intubated to black tiger shrimp (Penaeus monodon) was investigated by immunohistochemistry, employing antibodies specific for VP28 and haemocytes. The midgut has been identified as the most prominent site of WSSV uptake and processing. The truncated recombinant VP28 (rec-VP28), formalin-inactivated virus (IVP) and live WSSV follow an identical uptake route suggested as receptor-mediated endocytosis that starts with adherence of luminal antigens at the apical layers of gut epithelium. Processing of internalized antigens is performed in endo-lysosomal compartments leading to formation of supra-nuclear vacuoles. However, the majority of WSSV-antigens escape these compartments and are transported to the inter-cellular space via transcytosis. Accumulation of the transcytosed antigens in the connective tissue initiates aggregation and degranulation of haemocytes. Finally the antigens exiting the midgut seem to reach the haemolymph. The nearly identical uptake pattern of the different WSSV-antigens suggests that receptors on the apical membrane of shrimp enterocytes recognize rec-VP28 efficiently. Hence the truncated VP28 can be considered suitable for oral vaccination, when the digestion in the foregut can be bypassed

Fluorescent Superparamagnetic Iron Oxide Core–Shell Nanoprobes for Multimodal Cellular Imaging

Multimodal imaging agents that combine magnetic and fluorescent imaging capabilities are desirable for the high spatial and temporal resolution. In the present work, we report the synthesis of multifunctional fluorescent ferrofluids using iron oxide as the magnetic core and rhodamine B as fluorochrome shell. The core–shell structure was designed in such a way that fluorescence quenching due to the inner magnetic core was minimized by an intermediate layer of silica. The intermediate passive layer of silica was realized by a novel method which involves the esterification reaction between the epoxy group of prehydrolysed 3-Glyidoxypropyltrimethoxysilane and the surfactant over iron oxide. The as-synthesized ferrofluids have a high saturation magnetization in the range of 62–65 emu/g and were found to emit light of wavelength 640 nm ( excitation = 446 nm). Time resolved life time decay analysis showed a bi-exponential decay pattern with an increase in the decay life time in the presence of intermediate silica layer. Cytotoxicity studies confirmed the cell viability of these materials. The in vitro MRI imaging illustrated a high contrast when these multimodal nano probes were employed and the R2 relaxivity of these ∗Author to whom correspondence should be addressed. Email: smissmis@gmail.com sample was found to be 334 mM−1s−1 which reveals its high potential as a T2 contrast enhancing agent

Characterization of the role of Drosophila JAK/STAT signalling in cellular proliferation

Der Janus Kinase / signal transducer and activator of transcription (JAK/STAT) Signal- transduktionsweg wird für viele Entwicklungsvorgänge benötigt und spielt eine zentrale Rolle bei der Hämatopoese und bei der Immunantwort. Obwohl der JAK/STAT-Signalweg in den vergangenen Jahren Gegenstand intensiver Forschung war, erschwert die Redundanz des Signalwegs bei Wirbeltieren genetische Untersuchungen zur Identifizierung derjenigen Mechanismen, die den JAK/STAT-Signalweg regulieren. Der JAK/STAT-Signaltransduktionsweg ist evolutionär konserviert und ebenfalls bei der Taufliege Drosophila melanogaster vorhanden. Im Gegensatz zu Wirbeltieren ist der Signaltransduktionsweg von Drosophila weniger redundant und beinhaltet folgende Hauptkomponenten: den Liganden Unpaired (Upd), den Transmembranrezeptor Domeless (Dome), die einzige JAK-Tyrosinkinase Hopscotch (hop), sowie den Transkriptionsfaktor STAT92E. In der vorliegenden Arbeit wird die Rolle des JAK/STAT-Signalwegs bei der zellulären Proliferation mithilfe der Modellsysteme der Flügel- und der Augen-Imaginalscheiben von Drosophila charakterisiert. "Loss-of-function"- und "Gain-of-function"-Experimente zur Verminderung beziehungs-weise Erhöhung der Signalaktivität zeigten, dass der JAK/STAT-Signalweg eine Rolle bei der zellulären Proliferation der Flügel-Imaginalscheiben spielte, ohne die Zellgröße oder Apoptose zu verändern. Bei der Flügelentwicklung während des zweiten und des frühen dritten Larvalstadiums war die Aktivität des JAK/STAT-Signalwegs sowohl notwendig für die zelluläre Proliferation als auch hinreichend, um Überproliferation anzutreiben. Allerdings änderte sich während der späten dritten Larvalstadien die JAK/STAT-Signalaktivität, sodass endogene STAT92E-Mengen einen anti-proliferativen Effekt im gleichen Gewebe aufwiesen. Weiterhin reichte die ektopische Aktivierung des JAK/STAT-Signalwegs zu diesem späten Entwicklungszeitpunkt aus, um die Mitose zu inhibieren und die Zellen in der Phase G2 des Zellzyklus zu arretieren. Diese Ergebnisse legen den Schluss nahe, dass der JAK/STAT-Signalweg sowohl pro-proliferativ in frühen Flügelscheiben als auch anti-proliferativ zu späten Stadien der Flügelscheiben-Entwicklung wirken kann. Dieser späte anti-proliferative Effekt wurde durch einen nicht-kanonischen Mechanismus der STAT92E-Aktivierung vermittelt, da späte hop defiziente Zellverbände im Vergleich zu Wildtyp-Zellen keine Veränderungen im Ausmaß der zellulären Proliferation aufwiesen. Ferner konnte gezeigt werden, dass eine während der Larvalstadien exprimierte dominant-negative und im N-Terminus deletierte Form von STAT92E (?NSTAT92E) nicht für den anti-proliferativen Effekt verantwortlich ist. Diese Tatsache ist ein weiteres Indiz dafür, dass das vollständige STAT92E den späten anti-proliferativen Effekt verursacht. Um Modulatoren für die von JAK/STAT vermittelte zelluläre Proliferation zu identifieren, wurde ein P-Element-basierter genetischer Interaktions-Screen in einem sensibilisierten genetischen Hintergrund durchgeführt. Insgesamt wurden dazu 2267 unabhängige P-Element-Insertionen auf ihre Wechselwirkung mit der JAK/STAT-Signalaktivität untersucht und 24 interagierende Loci identifiziert. Diese Kandidaten können in folgende Gruppen eingeordnet werden: Zellzyklusproteine, Transkriptionsfaktoren, DNA und RNA bindende Proteine, ein Mikro-RNA-Gen, Komponenten anderer Signaltransduktionswege und Zelladhäsionsproteine. In den meisten Fällen wurden mehrere Allele der interagierenden Kandidatengene getestet. 18 Kandidatengene mit übereinstimmend interagierenden Allelen wurden dann zur weiteren Analyse ausgewählt. Von diesen 18 Kandidaten-Loci wurden 7 mögliche JAK/STAT-Signalwegskomponenten und 6 neue Zielgene des Signalwegs gefunden. Zusammenfassend wurde das Verständnis um STAT92E verbessert. Dieses Protein hat die gleiche Funktion wie das STAT3-Protein der Wirbeltiere und treibt die zelluläre Proliferation voran. Analog zu STAT1 hat STAT92E aber auch einen anti-proliferativen Effekt. Ferner wurden 24 mögliche Modulatoren der JAK/STAT-Signalaktivität identifiziert. Die Charakterisierung dieser Wechselwirkungen eröffnet vielversprechende Wege zu dem Verständnis, wie JAK/STAT die zelluläre Proliferation reguliert und könnte bei der Entwicklung von neuartigen therapeutischen Targets zur Behandlung von Krebskrankheiten und Entwicklungsstörungen beitragen.

A molecular and cellular analysis of the circadian system of the cockroach Rhyparobia (Leucophaea) maderae

Circadiane Schrittmacher koordinieren die täglichen Rhythmen in Physiologie und Verhalten in lebenden Organismen. Die Madeira Schabe Rhyparobia maderae (Synonym: Leucophaea maderae) ist ein gut etabliertes Modell, um die neuronalen Mechanismen der circadianen Rhythmen bei Insekten zu studieren. Die akzessorische Medulla (AME) in den optischen Loben des Gehirns wurde als das circadiane Schrittmacherzentrum der Madeira Schabe identifiziert, das circadiane Rhythmen in der Laufaktivität steuert. Über die Neurotransmitter der Eingangswege in das circadiane System der Madeira Schabe ist noch nicht viel bekannt. Das Hauptziel dieser Arbeit war es, mögliche Eingangssignale in die innere Uhr der Madeira Schabe zu bestimmen. An primären Zellkulturen von AME-Neuronen wurden Calcium-Imaging Experimente durchgeführt, um die Neurotransmitter-abhängigen Veränderungen in der intrazellulären Calcium-Konzentration zu messen. Darüber hinaus wurde die Signalkaskade des Neuropeptids Pigment Dispersing Factor (PDF), dem wichtigsten Kopplungsfaktor in circadianen Schrittmachern von Insekten, in Calcium-Imaging und Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) Experimenten untersucht. Acetylcholin (ACh) erhöht die intrazelluläre Calcium-Konzentration in der Mehrzahl der circadianen Schrittmacherneurone der Madeiraschabe. Applikation von GABA, Serotonin und Octopamin erhöhten oder reduzierten die intrazelluläre Calcium-Konzentration in den AME-Neuronen, während Histamin und Glutamat die intrazelluläre Calcium-Konzentration ausschließlich reduzierten. Pharmakologische Experimente zeigten, dass die AME-Neurone ACh über ionotrope nikotinische ACh-Rezeptoren detektierten, während GABA über ionotrope GABAA-Rezeptoren und metabotrope GABAB-Rezeptoren detektiert wurde. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die circadiane Aktivität der Schabe durch verschiedene Eingänge, einschließlich ACh, GABA, Glutamat, Histamin, Octopamin und Serotonin, moduliert wird. Bei den FRET Studien wurde ein Proteinkinase A (PKA)-basierter FRET Sensor zur Detektion von cyclischem AMP (cAMP) verwendet. Es wurde gezeigt, dass PDF über Adenylylcyclase-abhängige und -unabhängige Signalwege wirken kann. Zusätzlich wurden Laufrad-Assays durchgeführt, um Phasenverschiebungen im Rhythmus der circadianen Laufaktivität zu detektieren, nachdem der Neurotransmitter Histamin zu verschiedenen circadianen Zeiten injiziert wurde. Histamin-Injektionen durch die Komplexaugen der Schabe ergaben eine biphasische Phasenantwortkurve (phase response curve) mit Phasenverzögerungen in der Laufaktivität am späten subjektiven Tag und am Beginn der subjektiven Nacht und Phasenbeschleunigungen in der späten subjektiven Nacht. Schließlich wurde eine extrazelluläre Ableittechnik an lebenden Schaben etabliert, die gleichzeitige Langzeit-Ableitungen von der AME, des Komplexauges (Elektroretinogramm = ERG), und der Beinmuskulatur (Elektromyogramm = EMG) für mehrere Tage ermöglichte. Diese Methode bietet einen Ausgangspunkt für weitere elektrophysiologische Untersuchungen des circadianen Systems der Schabe, in denen Substanzen (z.B. Neurotransmitter und Neuropeptide) analysiert werden können, die einen Einfluss auf den circadianen Rhythmus in der Laufaktivität haben

Apatite-Polymer Composite Particles for Controlled Delivery of BMP-2: In Vitro Release and Cellular Response

Bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) has the ability to induce osteoblast differentiation of undifferentiated cells, resulting in the healing of skeletal defects when delivered with a suitable carrier. We have applied a versatile delivery platform comprising a novel composite of two biomaterials with proven track records – apatite and poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) – to the delivery of BMP-2. Sustained release of this growth factor was tuned with variables that affect polymer degradation and/or apatite dissolution, such as polymer molecular weight, polymer composition, apatite loading, and apatite particle size. The effect of released BMP-2 on C3H10T1/2 murine pluripotent mesenchymal cells was assessed by tracking the expression of osteoblastic makers, alkaline phosphatase (ALP) and osteocalcin. Release media collected over 100 days induced elevated ALP activity in C3H10T1/2 cells. The expression of osteocalcin was also upregulated significantly. These results demonstrated the potential of apatite-PLGA composite particles for releasing protein in bioactive form over extended periods of time.