Génération d'une souris dépourvue du gène VIT32 de manière conditionnelle: étude du phénotype rénal chez les souris dépourvues de RGS2

Résumé Dans le rein, la vasopressine possède un rôle essentiel dans la régulation fine du transport d'eau et participe au contrôle de la réabsorption du sodium. Cette action est conduite par l'activation du récepteur à la vasopressine V2R situé dans l'anse de Henle, dans le tubule connecteur et dans le canal collecteur du néphron des rongeurs et conduit à la formation d'AMPc entraînant un mécanisme d'action caractérisé par deux phases distinctes. Le premier effet de la vasopressine est non génomique et a lieu rapidement après l'activation du récepteur, la deuxième phase est plus tardive et possède la caractéristique de moduler la transcription d'un réseau de gènes. Parmi ces gènes, plusieurs sont directement impliqués dans le transport d'eau et de sodium, comme l'Aqp2 et 3, ENaC et la Na,K-ATPase. L'identification des effets de la voie de signalisation de la vasopressine représente un point crucial pour la compréhension des mécanismes moléculaires de la réabsorption de l'eau et du sodium dans le néphron. L'analyse en série de l'expression de gènes (SAGE) réalisée en 2001 dans notre laboratoire a permis de caractériser le transcriptome dépendant de la vasopressine dans la lignée cellulaire mpkCCDc14,a dérivée du canal collecteur cortical (CCD) de souris. Deux des transcrits induits par la vasopressine (VIT) ont fait l'objet des études de ce travail de thèse. Le premier est VIT32 (Vasopressin induced transcript 32) qui code pour une protéine ne possédant aucune homologie avec des domaines protéiques dont la fonction est connue. Dans le système d'expression de l'ovocyte de Xenopus laevis, VIT32 induit la maturation des ovocytes et diminue le courant sensible à l'amiloride de manière dépendante de la voie des MAPK. Dans les mpkCCDc14, l'inhibition de la voie des MAPK diminue le courant sodique en diminuant l'activité de la Na,K-ATPase, mais sans modifier le courant d'ENaC. Ainsi la voie de signalisation des MAPK peut avoir des cibles différentes suivant le système dans lequel elle est étudiée. C'est pourquoi nous avons décidé de poursuivre l'étude de VIT32 dans un contexte physiologique en créant une souris dépourvue du gène codant pour VIT32 de manière conditionnelle (conditional knockout). La première partie de cette thèse a donc consisté à générer cette souris. Le deuxième transcrit induit par la vasopressine qui a été étudié dans cette thèse est RGS2 (Regulator of G protein Signaling 2). In vitro, il a été montré que RGS2 inhibe des voies de signalisation dépendantes de récepteurs couplés à des protéines Gq et Gs. Dans notre étude, nous avons montré que dans le néphron de rein de souris, RGS2 est colocalisé avec V2R. In vivo, la vasopressine sécrétée lors d'une restriction en eau imposée à des souris augmente l'expression de RGS2. De plus, l'accumulation d'AMPc engendrée par l'action de la vasopressine sur les canaux collecteurs est significativement plus grande chez les souris dépourvues de RGS2 (rgs2 -/-). Cette induction de la signalisation de la vasopressine est corrélée à une augmentation de la réabsorption d'eau chez les souris rgs2 -/-. Ainsi RGS2 serait impliqué dans le rétrocontrôle négatif de la voie de signalisation de la vasopressine. Abstract In the kidney, vasopressin plays a key role in the control of water balance and participates in salt reabsorption. These actions are induced by the activation of V2 vasopressin receptor (V2R) located in the loop of Henle, in the connecting tubule and in the collecting duct leading to an increase in intracellular cAMP levels. The V2R-mediated vasopressin action elicits a rapid, non-genomic effect, during which water and salt reabsorption is rapidly increased and a late or genomic effect characterised by the long-term regulation of water and salt reabsorption through the transcriptional activation of a gene network that includes Aqp2, Aqp3, ENaC and Na,K-ATPase. Serial analysis of gene expression (SAGE) performed in 2001 in our laboratory characterised the vasopressin induced transcripts (VIT) in the mpkCCDc14 cell line. Two of them are studied in this thesis. The first one is VIT32 (Vasopressin induced transcript 32) that encodes a protein that has no homology with any protein domain of known function. In the Xenopus laevis oocyte, VIT32 induces oocyte maturation and downregulates the ENaC amiloride sensitive current via the activation of the MAPK pathway. In mpkCCDc14 cell line, the MAPK pathway inhibition leads to a decrease of Na,K-ATPase activity without affecting ENaC current. Therefore, the MAPK pathway can act on different targets depending on the cellular context. Thus, we decided to investigate the function of VIT32 in its physiological environment by performing a conditional knockout mouse of VIT32. The first part of this thesis consisted in generating this mouse. The second studied vasopressin induced transcript is RGS2 (Regulator of G protein Signaling 2). In vitro, RGS2 has been shown to inhibit Gq and Gs protein-coupled receptor pathway. In our study we show that RGS2 is co-localized with V2R in the mouse nephron. In vivo, vasopressin secreted during water restriction up-regulates RGS2 expression. Moreover, vasopressin-dependant accumulation of CAMP is significantly increased in the cortical collecting duct of RGS2 knockout mice. This increase is correlated with an increase in water reabsorption. RGS2 could be involved in the negative feedback regulation of V2R signalling. Résumé tout public Le corps humain est composé d'environ 60% d'eau répartie à l'intérieur et à l'extérieur des cellules de notre organisme. Les cellules, unités fondamentales du vivant, puisent l'oxygène et les nutriments indispensables à leur fonctionnement dans le liquide extracellulaire. La composition du milieu doit être constante, car les variations peuvent perturber considérablement et parfois fatalement la fonction des cellules. Ainsi les organismes pluricellulaires ont développé des mécanismes permettant de contrôler la constance du milieu extracellulaire afin de maintenir l'état d'équilibre nommé homéostasie. Le rein joue un rôle majeur dans cette homéostasie grâce à sa capacité de réabsorber l'eau et les solutés en fonction des besoins de l'organisme. Cette fonction du rein est régulée par différentes hormones comme la vasopressine, qui permet de contrôler la réabsorption fine de l'eau et des solutés. Dans leurs membranes, les cellules possèdent des récepteurs leur permettant de répondre aux signaux extracellulaires comme le sont entre autres les hormones. Ainsi les cellules sensibles à la vasopressine possèdent un récepteur nommé V2R qui permet d'intégrer les signaux de la vasopressine en déclenchant tout une cascade d'événements conduisant à une modification de l'expression de certaines protéines impliquées directement ou non dans la réabsorption de l'eau et des solutés. Une étude précédente élaborée au sein de notre laboratoire a permis de répertorier les protéines dont l'expression est augmentée par de la vasopressine. Deux de ces protéines ont fait l'objet des études de cette thèse. La première protéine induite par la vasopressine est VIT32 (Vasopressin induced transcript 32). Cette protéine est entre autres impliquée dans la réabsorption du sodium, mais la fonction précise de VIT32 dans ce transport n'a pas pu être déterminée. Une des approches possibles pour l'étude de la fonction d'une protéine est de supprimer son expression chez la souris et d'étudier les conséquences de son absence. Ces souris sont appelées des souris knockout, puisque la protéine en question ne peut plus agir. La première partie de cette thèse a donc consisté à générer une souris dépourvue du gène de VIT32. La deuxième protéine étudiée est RGS2 (Regulator of G protein Signaling 2). Cette protéine inhibe certaines voies de signalisation activées par différentes hormones. Dans cette partie du travail de thèse, nous avons pu mettre en évidence que RGS2 agit comme un inhibiteur de la voie de signalisation de la vasopressine. En modifiant cette signalisation, RGS2 serait donc un médiateur du contrôle de la réabsorption d'eau dans les cellules du rein sensibles à la vasopressine.

Quadrant/octant sequencing and the role of coherent structures in bed load sediment entrainment

To permit the tracking of turbulent flow structures in an Eulerian frame from single-point measurements, we make use of a generalization of conventional two-dimensional quadrant analysis to three-dimensional octants. We characterize flow structures using the sequences of these octants and show how significance may be attached to particular sequences using statistical mull models. We analyze an example experiment and show how a particular dominant flow structure can be identified from the conditional probability of octant sequences. The frequency of this structure corresponds to the dominant peak in the velocity spectra and exerts a high proportion of the total shear stress. We link this structure explicitly to the propensity for sediment entrainment and show that greater insight into sediment entrainment can be obtained by disaggregating those octants that occur within the identified macroturbulence structure from those that do not. Hence, this work goes beyond critiques of Reynolds stress approaches to bed load entrainment that highlight the importance of outward interactions, to identifying and prioritizing the quadrants/octants that define particular flow structures. Key Points <list list-type=''bulleted'' id=''jgrf20196-list-0001''> <list-item id=''jgrf20196-li-0001''>A new method for analysing single point velocity data is presented <list-item id=''jgrf20196-li-0002''>Flow structures are identified by a sequence of flow states (termed octants) <list-item id=''jgrf20196-li-0003''>The identified structure exerts high stresses and causes bed-load entrainment

An activator/repressor dual system allows tight tetracycline-regulated gene expression in budding yeast

We have developed an activator/repressor expression system for budding yeast in which tetracyclines control in opposite ways the ability of tetR-based activator and repressor molecules to bind tetO promoters. This combination allows tight expression of tetO-driven genes, both in a direct (tetracycline-repressible) and reverse (tetracycline-inducible) dual system. Ssn6 and Tup1, that are components of a general repressor complex in yeast, have been tested for their repressing properties in the dual system, using lacZ and CLN2 as reporter genes. Ssn6 gives better results and allows complete switching-off of the regulated genes, although increasing the levels of the Tup1-based repressor by expressing it from a stronger promoter improves repressing efficiency of the latter. Effector-mediated shifts between expression and non-expression conditions are rapid. The dual system here described may be useful for the functional analysis of essential genes whose conditional expression can be tightly controlled by tetracyclines.

Data-division-specific robustness and power of randomization tests for ABAB designs

This study deals with the statistical properties of a randomization test applied to an ABAB design in cases where the desirable random assignment of the points of change in phase is not possible. In order to obtain information about each possible data division we carried out a conditional Monte Carlo simulation with 100,000 samples for each systematically chosen triplet. Robustness and power are studied under several experimental conditions: different autocorrelation levels and different effect sizes, as well as different phase lengths determined by the points of change. Type I error rates were distorted by the presence of autocorrelation for the majority of data divisions. Satisfactory Type II error rates were obtained only for large treatment effects. The relationship between the lengths of the four phases appeared to be an important factor for the robustness and the power of the randomization test.

Conditioning of multiple-point statistics facies simulations to tomographic images

Geophysical tomography captures the spatial distribution of the underlying geophysical property at a relatively high resolution, but the tomographic images tend to be blurred representations of reality and generally fail to reproduce sharp interfaces. Such models may cause significant bias when taken as a basis for predictive flow and transport modeling and are unsuitable for uncertainty assessment. We present a methodology in which tomograms are used to condition multiple-point statistics (MPS) simulations. A large set of geologically reasonable facies realizations and their corresponding synthetically calculated cross-hole radar tomograms are used as a training image. The training image is scanned with a direct sampling algorithm for patterns in the conditioning tomogram, while accounting for the spatially varying resolution of the tomograms. In a post-processing step, only those conditional simulations that predicted the radar traveltimes within the expected data error levels are accepted. The methodology is demonstrated on a two-facies example featuring channels and an aquifer analog of alluvial sedimentary structures with five facies. For both cases, MPS simulations exhibit the sharp interfaces and the geological patterns found in the training image. Compared to unconditioned MPS simulations, the uncertainty in transport predictions is markedly decreased for simulations conditioned to tomograms. As an improvement to other approaches relying on classical smoothness-constrained geophysical tomography, the proposed method allows for: (1) reproduction of sharp interfaces, (2) incorporation of realistic geological constraints and (3) generation of multiple realizations that enables uncertainty assessment.

Targeted inactivation of hypocretin receptors in dopaminergic and noradrenergic systems alters brain activity in wakefulness

Since the discovery of hypocretins/orexins (Hcrt/Ox) in 1998, several narcoleptic mouse models, such as Hcrt-KO, Hcrtrl-KO, Hcrtr2-KO and double receptors KO mice, and orexin-ataxin transgenic mice were generated. The available Hcrt mouse models do not allow the dissection of the specific role of Hcrt in each target region. Dr. Anne Vassalli generated loxP-flanked alleles for each Hcrt receptor, which are manipulated by Cre recombinase to generate mouse lines with disrupted Hcrtrl or Hcrtr2 (or both) in cell type-specific manner. The role of noradrenaline (NA) and dopamine (OA) in ttie regulation of vigilance states is well documented. The purpose of this thesis is to explore the role of the Hcrt input into these two monoaminergic systems. Chronic loss of Hcrtrl in NA neurons consolidated paradoxical sleep (PS), and altered wakefulness brain activity in baseline, during the sleep deprivation (SD), and when mice were challenged by a novel environment, or exposed to nest-building material. The analysis of alterations in the sleep EEG delta power showed a consistent correlation with the changes in the preceding waking quality in these mice. Targeted inactivation of Hcrt input into DA neurons showed that Hcrtr2 inactivation present the strongest phenotype. The loss of Hcrtr2 in DA neurons caused modified brain activities in spontaneous wakefulness, during SD, and in novel environmental conditions. In addition to alteration of wakefulness quality and quantity, conditional inactivation of Hcrtr2 in DA neurons caused an increased in time spent in PS in baseline and a delayed and less complete PS recovery after SD. In the first 30 min of sleep recovery, single (i.e. for Hcrtrl or Hcrtr2) conditional knockout receptor mice had opposite changes in delta activity, including an increased power density in the fast delta range with specific inactivation of Hcrtr2, but a decreased power density in the same range with specific inactivation of Hcrtrl in DA cells. These studies demonstrate a complex impact of Hcrt receptors signaling in both NA and DA system, not only on quantity and quality of wakefulness, but also on PS amount regulation as well as on SWS delta power expression. -- Depuis la découverte des hypocrétines/orexines (Hcrt/Ox) en 1998, plusieurs modèles de souris, narcoleptiques telles que Hcrt-KO, Hcrtr2-KO et récepteurs doubles KO et les souris transgéniques orexine-ataxine ont été générés. Les modèles de souris Hcrt disponibles ne permettaient pas la dissection du rôle spécifique de l'Hcrt dans chaque noyau neuronal cible. Notre laboratoire a généré des allèles loxP pour chacun des 2 gènes codant pour les récepteurs Hcrtr, qui sont manipulés par recombinase Cre pour générer des lignées de souris avec Hcrtrl inactivé, ou Hcrtr2 inactivé, (ou les deux), spécifiquement dans un type cellulaire particulier. Le rôle de la noradrénaline (NA) et la dopamine (DA) dans la régulation des états de vigilance est bien documentée. Le but de cette thèse est d'étudier le rôle de l'afférence Hcrt dans ces deux systèmes monoaminergiques au niveau de l'activité cérébrale telle qu'elle apparaît dans l'électroencéphalogramme (EEG). Mon travail montre que la perte chronique de Hcrtrl dans les neurones NA consolide le sommeil paradoxal (PS), et l'activité cérébrale de l'éveil est modifiée en condition spontanée, au cours d'une experience de privation de sommeil (SD), et lorsque les souris sont présentées à un nouvel environnement, ou exposées à des matériaux de construction du nid. Ces modifications de l'éveil sont corrélées à des modifications de puissance de l'activité delta du sommeil lent qui le suit. L'inactivation ciblée des Hcrtrs dans les neurones DA a montré que l'inactivation Hcrtr2 conduit au phénotype le plus marqué. La perte de Hcrtr2 dans les neurones DA mène à des modification d'activité cérébrale en éveil spontané, pendant SD, ainsi que dans des conditions environnementales nouvelles. En plus de l'altération de la qualité de l'éveil et de la quantité, l'inactivation conditionnelle de Hcrtr2 dans les neurones DA a provoqué une augmentation du temps passé en sommeil paradoxal (PS) en condition de base, et une reprise retardée et moins complète du PS après SD. Dans les 30 premières minutes de la récupération de sommeil, les modèles inactivés pour un seul des récepteurs (ie pour Hcrtrl ou Hcrtr2 seulement) montrent des changements opposés en activité delta, en particulier une densité de puissance accrue dans le delta rapide avec l'inactivation spécifique de Hcrtr2, mais une densité de puissance diminuée dans cette même gamme chez les souris inactivées spécifiquement en Hcrtrl dans les neurones DA. Ces études démontrent un impact complexe de l'inactivation de la neurotransmission au niveau des récepteurs d'Hcrt dans les deux compartiments NA et DA, non seulement sur la quantité et la qualité de l'éveil, mais aussi sur la régulation de quantité de sommeil paradoxal, ainsi que sur l'expression de la puissance delta pendant le sommeil lent.

Market Index Biases and Minimum Risk Indices

Markets, in the real world, are not efficient zero-sum games where hypotheses of the CAPM are fulfilled. Then, it is easy to conclude the market portfolio is not located on Markowitz"s efficient frontier, and passive investments (and indexing) are not optimal but biased. In this paper, we define and analyze biases suffered by passive investors: the sample, construction, efficiency and active biases and tracking error are presented. We propose Minimum Risk Indices (MRI) as an alternative to deal with to market index biases, and to provide investors with portfolios closer to the efficient frontier, that is, more optimal investment possibilities. MRI (using a Parametric Value-at-Risk Minimization approach) are calculated for three stock markets achieving interesting results. Our indices are less risky and more profitable than current Market Indices in the Argentinean and Spanish markets, facing that way the Efficient Market Hypothesis. Two innovations must be outlined: an error dimension has been included in the backtesting and the Sharpe"s Ratio has been used to select the"best" MRI

GATA2 is required for lymphatic vessel valve development and maintenance.

Heterozygous germline mutations in the zinc finger transcription factor GATA2 have recently been shown to underlie a range of clinical phenotypes, including Emberger syndrome, a disorder characterized by lymphedema and predisposition to myelodysplastic syndrome/acute myeloid leukemia (MDS/AML). Despite well-defined roles in hematopoiesis, the functions of GATA2 in the lymphatic vasculature and the mechanisms by which GATA2 mutations result in lymphedema have not been characterized. Here, we have provided a molecular explanation for lymphedema predisposition in a subset of patients with germline GATA2 mutations. Specifically, we demonstrated that Emberger-associated GATA2 missense mutations result in complete loss of GATA2 function, with respect to the capacity to regulate the transcription of genes that are important for lymphatic vessel valve development. We identified a putative enhancer element upstream of the key lymphatic transcriptional regulator PROX1 that is bound by GATA2, and the transcription factors FOXC2 and NFATC1. Emberger GATA2 missense mutants had a profoundly reduced capacity to bind this element. Conditional Gata2 deletion in mice revealed that GATA2 is required for both development and maintenance of lymphovenous and lymphatic vessel valves. Together, our data unveil essential roles for GATA2 in the lymphatic vasculature and explain why a select catalogue of human GATA2 mutations results in lymphedema.

Vinouden huomioiva arvopapereiden hinnoittelumalli ja sen empiirinen testaaminen Suomen markkinoilla

Tutkimuksen tarkoituksena on tutkia osaketuottojen jakauman vinoutta ja sen mahdollisia vaikutuksia osakkeiden hinnoitteluun Suomen markkinoilla. Aineistona käytetään kuutta portfoliota jotka on muodostettu Suomen markkinoilla noteerattavista osakkeista ajanjaksolla 1.1.1987–31.12.2004. Osakkeet on jaettu portfolioihin markkina-arvon mukaan. Empiiriset tulokset osoittavat, että osaketuotot Suomen markkinoilla ovat positiivisesti vinoja mutta pääosin eivät merkitsevästi. Teoreettisen taustan perusteella olisi ollut odotettavaa, että vinoutta olisi ollut enemmän. Regressioanalyysillä ja kahta artikkelia replikoiden tutkittiin perinteisen ja vinouden sisältäviä CAPM-malleja. Odotettavissa oli, että perinteinen CAPM-malli suoriutuu huonommin kuin vinouden sisältävä. Regressio-analyysillä testatessa molemmat mallit suoriutuivat hyvin tuottojen selittämisessä, mutta vakiotermien perusteella kolmimomenttinen malli suoriutuisi paremmin. Regressiomallin ja artikkelin perusteella saadut betat olivat yhteneväisiä. Regressiomallin ja artikkelin perusteella saaduissa gam-moissa oli kuitenkin eroja ja niiden perusteella ei voida tehdä johtopäätöksiä. Regressiomalli näyttäisi kuitenkin huomioivan vinouden.

Empirical study of correlated survival times for recurrent events with proportional hazards margins and the effect of correlation and censoring.

Background: In longitudinal studies where subjects experience recurrent incidents over a period of time, such as respiratory infections, fever or diarrhea, statistical methods are required to take into account the within-subject correlation. Methods: For repeated events data with censored failure, the independent increment (AG), marginal (WLW) and conditional (PWP) models are three multiple failure models that generalize Cox"s proportional hazard model. In this paper, we revise the efficiency, accuracy and robustness of all three models under simulated scenarios with varying degrees of within-subject correlation, censoring levels, maximum number of possible recurrences and sample size. We also study the methods performance on a real dataset from a cohort study with bronchial obstruction. Results: We find substantial differences between methods and there is not an optimal method. AG and PWP seem to be preferable to WLW for low correlation levels but the situation reverts for high correlations. Conclusions: All methods are stable in front of censoring, worsen with increasing recurrence levels and share a bias problem which, among other consequences, makes asymptotic normal confidence intervals not fully reliable, although they are well developed theoretically.

Post-transcriptional regulation of circadian gene expression by miRNAs

La grande majorité des organismes vivants ont développé un système d'horloges biologiques internes, appelées aussi horloges circadiennes, contrôlant l'expression de gênes impliqués dans de nombreux processus moléculaires et comportementaux. Au cours de la dernière décennie, des analyses « microarray » et séquençages à haut débit sur divers tissus de mammifères, indiquent que jusqu'à 20% du transcriptome serait sous contrôle circadien. Il était jusqu'à présent admis que la majorité des ARNm ayant une accumulation rythmique était générée par une transcription qui était elle-même rythmique. Toutefois, de récentes études ont suggéré qu'une proportion considérable des ARNm cycliques serait en fait générée par des mécanismes post-transcriptionnelles, incluant une régulation par micro-ARN (miARN). Lorsque j'ai débuté mon travail de thèse, l'influence des miARN sur l'expression des gènes circadiens, au niveau pangénomique, était encore méconnue. Par l'utilisation d'un modèle murin, dont la biogenèse des miARN a été spécifiquement désactivée au niveau des cellules hépatiques (knockout conditionnel pour Dicer), je me suis donc intéressée au rôle que jouaient ces molécules régulatrices sur la rythmicité de l'expression génique dans le foie. Des séquençages sur l'ensemble du transcriptome révèlent que l'horloge interne du foie est étonnement résistante à la perte totale des miARN. Nous avons cependant trouvé que les miARN agissent de façon importante sur la régulation de l'expression des gènes contrôlés par l'horloge moléculaire. La corégulation par les miARN, affectant jusqu'à 30% des gènes transcrits de façon rythmiques, conduit ainsi à une modulation de phase et d'amplitude du rythme de l'abondance des ARNm. En revanche, seuls peu de transcrits dépendent uniquement des miARN pour la rythmicité de leur accumulation. Enfin, mon travail met en évidence plusieurs miARN spécifiques, qui semblent préférentiellement moduler l'expression des gènes cycliques et permet l'identification de voies hépatiques particulièrement sujettes à une double régulation par les miARN et l'horloge biologique interne. La première masse d'analyses a essentiellement porté sur le rôle que jouent les miARN au niveau de l'expression des gènes contrôlés par l'horloge interne. Dans deux études de suivi, je me suis penchée sur deux aspects supplémentaires et complémentaires de la manière dont les miARN et l'oscillation de l'expression des gènes interagissent. Dans les hépatocytes murins, spécifiquement privés de Dicer, je me suis demandée si un phénotype horloge avait pu être masqué, dû à un entraînement stable de l'horloge du foie par l'horloge maîtresse du cerveau. J'ai donc commencé une série d'expériences ambitieuses (impliquant la mesure de la rythmicité du foie in vivo, chez l'animal vivant) afin de déséquilibrer l'entrainement de l'horloge hépatique via l'utilisation d'un protocole nutritionnel spécifique. Les premiers résultats suggèrent que dans des conditions où l'animal subit une restriction alimentaire pendant la journée, les miARN sont importants dans la cinétique d'adaptation des organes périphériques à un nouvel horaire de sustentation. Dans une deuxième ligne de recherche, j'ai plus profondément étudié quels seraient les miARN responsables des rythmes post-transcriptionnels des ARNm, en utilisant le séquençage de « small » ARN sur 24h. L'analyse est en cours et se poursuivra après l'obtention de mon diplôme. De façon générale, mon travail révèle d'importants et nouveaux rôles des miARN dans la modulation de l'expression circadienne des gènes hépatiques. De plus, le set de données générées dans l'étude déjà publiée, peut dorénavant servir de ressource valable pour de prochaines investigations sur le rôle physiologique que les miARN jouent au niveau du foie. -- Most living organisms have developed internal timing systems, called circadian clocks, to drive the rhythmic expression of genes involved in many molecular and behavioral processes. Over the last decade, microarray analyses and high- throughput sequencing from various mammalian tissues have indicated that up to 20% of the transcriptome are under circadian control. It was generally assumed that the majority of rhythmic mRNA accumulation is generated by rhythmic transcription. However, recent studies have suggested that a considerable proportion of mRNA cycling may actually be generated by post-transcriptional mechanisms, including by microRNAs. When I started my thesis work, it was still unknown how miRNAs influence circadian gene expression in a genome-wide fashion. Using a mouse model in which miRNA biogenesis can be inactivated in hepatocytes (conditional Dicer knockout mouse), I have thus addressed the role that these regulatory molecules play in rhythmic gene expression in the liver. Whole transcriptome sequencing revealed that the hepatic core clock was surprisingly resilient to total miRNA loss. However, we found that miRNAs acted as important regulators of clock-controlled gene expression. Co- regulation by miRNAs, which affected up to 30% of rhythmically transcribed genes, thus led to the modulation of phases and amplitudes of mRNA abundance rhythms. By contrast, only very few transcripts were strictly dependent on miRNAs for their rhythmic accumulation. Finally, my work highlights several specific miRNAs that appear to preferentially modulate cyclic gene expression, and identifies pathways in the liver that are particularly prone to dual regulation through miRNAs and the clock. The first bulk of analyses mainly dealt with the role that miRNAs play at the level of rhythmic clock output gene expression. In two follow-up studies I further delved into two additional, complementary aspects of how miRNAs and gene expression oscillations interact. First, I addressed whether a core clock phenotype in the hepatocyte-specific Dicer knockout could have been masked due to the stable entrainment of the liver clock by the animals' master clock in the brain. I thus started a series of ambitious experiments (involving the in vivo recording of liver rhythms in live animals) to bring the stable entrainment of the liver clock out of equilibrium using specific feeding protocols. My first results suggest that under conditions when animals are challenged by food restriction to daytime, miRNAs are important for the kinetics of adapting to unusual mealtime in peripheral tissue. In a second line of research, I have more carefully investigated which miRNAs are responsible for post- transcriptional mRNA rhythms using small RNA sequencing around-the-clock. The analyses are ongoing and will be continued after my graduation. Overall, my work uncovered important and novel roles of miRNA activity in shaping hepatic circadian gene expression; moreover, the datasets collect in the published studies can serve as a valuable resource for further investigations into the physiological roles that miRNAs play in liver. -- L'alternance du jour et de la nuit dirige depuis longtemps la vie quotidienne des êtres humains et de la plupart des organismes sur terre. Ce cycle de 24 heures façonne beaucoup de changements comportementaux et physiologiques tels que la vigilance, la température corporelle et le sommeil. Les rythmes journaliers, appelés rythmes circadiens, sont dirigés par des horloges biologiques tournant dans presque chaque cellule du corps. Une structure dans le cerveau agit en tant qu'horloge maitresse pour synchroniser les horloges internes entre elles et en fonction des signaux de jour/nuit extérieurs. Dans les cellules "les gènes de l'horloge" sont activés et désactivés une fois par jour ce qui déclenche des cycles dans lesquels des protéines sont produites de manière circadienne. Ces rythmes protéiques sont spécialisés pour chaque tissu ou organe et peuvent les aider à réaliser leurs tâches quotidiennes. Les rythmes circadiens peuvent être générés d'autres manières n'impliquant pas directement les composants des gènes de l'horloge. Les ARN messagers (ARNm) sont des molécules intermédiaires dans la production de protéines à partir d'ADN. Dans le foie des souris jusqu'à 20% des molécules d'ARNm sont produites suivant des rythmes circadiens. Le foie réalise des tâches essentielles dans le contrôle du métabolisme incluant celui des hydrates de carbone, des graisses et du cholestérol. Un timing précis est important afin de traiter les substances nutritives correctement lors des repas il en résulte une variation des quantités de certains ARNm et protéines coïncidant avec les repas. Les microARNs constituent une autre classe de molécules ARN de très petite taille qui régulent l'efficacité de traduction des ARNm en protéines et la stabilité des ARNm. Lors de mon travail de thèse, j'ai exploré de manière approfondie l'influence de ces petits régulateurs sur les rythmes circadiens du foie de souris. Ces expériences qui impliquaient le "Knock-out" d'un gène essentiel à la production de microARNs montrent qu'au lieu de générer les rythmes des ARNm, les microARNs les ajustent pour répondre aux besoins spécifiques du foie comme assurer leur pic au bon moment de la journée. Le ciblage de microARNs spécifiques peut révéler de nouvelles stratégies pour rectifier ces rythmes lorsque par exemple les fonctions métaboliques ne fonctionnent plus normalement. -- The rising and setting of the sun have long driven the daily schedules of humans and most organisms on the earth. This 24-hr cycle shapes many behavioural and physiological changes, such as alertness, body temperature, and sleep. These daily rhythms, which are called circadian rhythms, are dictated by biological clocks that are ticking in almost every single cell of the body. A region in the brain acts as a master clock to synchronize the internal clocks with each other and with the outside light/dark cycles. In cells, "core clock genes" are turned on and off once per day, which triggers cycles that cause some proteins to be produced in a circadian manner. The protein rhythms are specialized to a particular tissue or organ, and may help them to carry out their designated daily tasks. However, circadian rhythms might also be produced by other ways that do not involve these core clock components. Messenger RNAs (mRNAs) are intermediate molecules in the production of proteins from DNA. In the mouse liver, up to 20% of mRNA molecules are produced in circadian cycles. The liver performs essential tasks that control metabolism-including that of carbohydrates, fats, and cholesterol. Precisely timing when certain mRNAs and proteins reach peaks and troughs in their activities to coincide with mealtimes is important for nutrients to be properly processed. Other RNA molecules called microRNAs, i.e. RNAs of very small size, regulate at which rate mRNA molecules are translated into proteins. In my thesis work, I have explored at the influence of these small regulators on circadian rhythms in the mouse liver in greater detail. These experiments, which involved "knocking out" a gene that is essential for the production of microRNAs, show that rather than generating the mRNA rhythms, the microRNAs appear to adjust them to meet the specific needs of the liver, such as ensuring that they peak at the right time-of-day. Targeting specific microRNA molecules may reveal new strategies to tweak these rhythms, which could help to improve conditions when metabolic functions go wrong.

Genome-wide DNA methylation detection by MethylCap-seq and Infinium HumanMethylation450 BeadChips: an independent large-scale comparison.

Two cost-efficient genome-scale methodologies to assess DNA-methylation are MethylCap-seq and Illumina's Infinium HumanMethylation450 BeadChips (HM450). Objective information regarding the best-suited methodology for a specific research question is scant. Therefore, we performed a large-scale evaluation on a set of 70 brain tissue samples, i.e. 65 glioblastoma and 5 non-tumoral tissues. As MethylCap-seq coverages were limited, we focused on the inherent capacity of the methodology to detect methylated loci rather than a quantitative analysis. MethylCap-seq and HM450 data were dichotomized and performances were compared using a gold standard free Bayesian modelling procedure. While conditional specificity was adequate for both approaches, conditional sensitivity was systematically higher for HM450. In addition, genome-wide characteristics were compared, revealing that HM450 probes identified substantially fewer regions compared to MethylCap-seq. Although results indicated that the latter method can detect more potentially relevant DNA-methylation, this did not translate into the discovery of more differentially methylated loci between tumours and controls compared to HM450. Our results therefore indicate that both methodologies are complementary, with a higher sensitivity for HM450 and a far larger genome-wide coverage for MethylCap-seq, but also that a more comprehensive character does not automatically imply more significant results in biomarker studies.

Asymmetrical nature of the Trollius-Chiastocheta interaction: insights into the evolution of nursery pollination systems

The mutualistic versus antagonistic nature of an interaction is defined by costs and benefits of each partner, which may vary depending on the environment. Contrasting with this dynamic view, several pollination interactions are considered as strictly obligate and mutualistic. Here, we focus on the interaction between Trollius europaeus and Chiastocheta flies, considered as a specialized and obligate nursery pollination system - the flies are thought to be exclusive pollinators of the plant and their larvae develop only in T.europaeus fruits. In this system, features such as the globelike flower shape are claimed to have evolved in a coevolutionary context. We examine the specificity of this pollination system and measure traits related to offspring fitness in isolated T.europaeus populations, in some of which Chiastocheta flies have gone extinct. We hypothesize that if this interaction is specific and obligate, the plant should experience dramatic drop in its relative fitness in the absence of Chiastocheta. Contrasting with this hypothesis, T.europaeus populations without flies demonstrate a similar relative fitness to those with the flies present, contradicting the putative obligatory nature of this pollination system. It also agrees with our observation that many other insects also visit and carry pollen among T.europaeus flowers. We propose that the interaction could have evolved through maximization of by-product benefits of the Chiastocheta visits, through the male flower function, and selection on floral traits by the most effective pollinator. We argue this mechanism is also central in the evolution of other nursery pollination systems.