Papel do óxido nítrico no desenvolvimento de lesões cardíacas na fase aguda da infecção experimental pelo Trypanosoma cruzi

A doença de Chagas é causada pelo Trypanosoma cruzi e o coração é o órgão mais acometido. O óxido nítrico apresenta importante ação anti-Trypanosoma, porém, com pouca evidência de seu papel no mecanismo de lesão tecidual. O objetivo deste estudo foi analisar a contribuição do óxido nítrico no desenvolvimento da inflamação e da fibrose cardíaca na fase aguda da infecção experimental por cepas Y e Colombiana do Trypanosoma cruzi. A inflamação foi significativamente maior nos animais infectados pela cepa Colombiana, comparada com os infectados com a cepa Y, tanto nos animais C57BL/6 (3,98x1,87%; p=0,004) quanto nos animais C57BL/6 deficientes na sintase do óxido nítrico induzível (3,99x2,4%; p=0,013). O parasitismo cardíaco dos animais C57BL/6 deficientes na sintase do óxido nítrico induzível infectados pela cepa Colombiana foi significativamente maior que o destes mesmos animais infectados com a cepa Y (2,78x0,17 ninhos/mm²; p=0,004) assim como, os animais C57BL/6 infectados com a cepa Colombiana (2,78x1,33 ninhos/mm²; p=0,006) ou cepa Y (2,78x0,53 ninhos/mm²; p=0,005). Os dados reforçam o papel do óxido nítrico no controle do parasitismo e sugerem seu papel na proteção tecidual, controlando a inflamação e potencialmente diminuindo lesões cardíacas durante a fase aguda na doença de Chagas experimental.

A lesão apical em cardiopatas chagásicos crônicos: estudo necroscópico

INTRODUÇÃO: A lesão apical ventricular é típica da cardiopatia chagásica e sua presença representa risco de fenômenos tromboembólicos. O objetivo deste trabalho é avaliar a frequência de LA à necropsia de portadores de cardiopatia chagásica crônica. MÉTODOS: Análise retrospectiva de necropsias de chagásicos maiores que 17 anos. Efetuada análise estatística comparativa das variáveis clínicas e dos achados necroscópicos entre o grupo A (com lesão apical) e o grupo B (ausência de lesão apical). RESULTADOS: Estudados 51 casos: 25 no grupo A (idade média de 53 anos, 64% do sexo masculino)e 26 no B.. A LA localizava-se no ventrículo esquerdo em 80% casos. No grupo B, a média de idade foi de 56 anos e 46,1% eram do sexo masculino. A forma clínica prevalente nos dois grupos foi a miopática, mas arritmia cardíaca também esteve presente em ambos (57,9% no grupo A e 32,1% no B). Foi constatada a presença de trombos em 60% dos casos do grupo A (53,3% localizados na LA ) e 30,7% no B; CONCLUSÕES: Houve predomínio da forma miopática nos casos com LA, com média de peso cardíaco maior em relação ao B. Em ambos os grupos observamos relação diretamente proporcional entre maior peso cardíaco e presença de tromboses. Houve predomínio do número de tromboses no grupo A, mais de 50% eram localizadas na lesão, cujo diferencial clínico principal consistiu na presença maior de arritmias. A miopatia (com aumento de peso acima de 500g) foi primordial para aparecimento de tromboses.

Associação entre dissinergia miocárdica e arritmia ventricular na forma indeterminada da doença de Chagas

INTRODUÇÃO: Pacientes na forma indeterminada da doença de Chagas (FIDC) podem apresentar anormalidades contráteis segmentares, com evidências de pior prognóstico comparativamente a pacientes com estudo ecocardiográfico normal. O objetivo deste estudo foi de avaliar a associação entre a presença de anormalidade contrátil segmentar e a presença de distúrbios do ritmo cardíaco na FIDC. MÉTODOS: Foram estudados 38 pacientes na FIDC, sendo 26 pacientes sem anormalidade contrátil e 12 com presença de distúrbio contrátil ao estudo ecocardiográfico. Todos os pacientes foram submetidos a um estudo ecocardiográfico completo, incluindo o Doppler tecidual, bem como à monitorização eletrocardiográfica de 24h (Holter). RESULTADOS: Entre as diversas variáveis estudadas, foram encontradas diferenças significativas entre os dois grupos em relação à fração de ejeção (p < 0,001), dimensão sistólica do ventrículo esquerdo (p = 0,029) e tempo de contração isovolumétrica (p < 0,05) medidos pela ecocardiografia e Doppler tecidual, bem como extrassistolia ventricular isolada (p = 0,016) e em pares (p = 0,003) pela avaliação pelo Holter. CONCLUSÕES: Pacientes na FIDC que apresentam anormalidades contráteis quando avaliados pela ecocardiografia apresentam episódios mais frequentes de extrassistolia ventricular, traduzindo um maior dano morfofuncional e elétrico do coração, quando comparados a pacientes que apresentem estudo ecocardiográfico normal.

O modelo de transporte de doentes não urgentes : estudo do caso Hospital Geral de Santo António

RESUMO - Contexto: A avaliação das práticas de um hospital na utilização do transporte não urgente, mais concretamente, a análise do procedimento utilizado nas respectivas requisições de transporte não urgente, por patologia, da estrutura de custos por tipo de transporte e sua validação em termos de conformidade para respectivo pagamento. Objectivos: Os objectivos deste trabalho são a i) avaliação da adequação das práticas do transporte não urgente, do Hospital Geral de Santo António (HGSA) do Centro Hospitalar do Porto (CHP), ao normativo legal em vigor, ii) do grau de conformidade das requisições de transporte analisadas com os critérios clínicos estabelecidos, iii) mensurar os custos de transporte programado na estrutura hospitalar e avaliar a dimensão dos transportes injustificados/inadequados, no orçamento do HGSA. Metodologia: A partir da análise do normativo legal do transporte não urgente e do Regulamento Interno do HGSA, foram criadas duas matrizes, feita uma análise comparativa entre as mesmas, com o objectivo de permitir aferir do grau de conformidade do Regulamento face ao normativo legal. De 560 requisições de transporte e de 525 facturas de transporte não urgente, foi realizada uma comparação do grau de adequação das práticas do HGSA face ao estabelecido legal e clinicamente. Na vertente da análise do grau de conformidade do Regulamento face ao normativo legal foram os dois documentos comparados de acordo com os requisitos estabelecidos na Lei, tendo sido definidas as seguintes variáveis para as seguintes situações: i) situações abrangidas pelo transporte não urgente, taxa de conformidade situações abrangidas (TCSA) ii) justificações clinicas para o direito a tal tipo de transporte, taxa de conformidade justificações clinicas (TCJC) tendo, posteriormente, sido definida e calculada uma taxa global de conformidade (TCG). Na vertente do grau de adequação entre os critérios clínicos definidos e a sua aplicação prática bem como da definição da dimensão dos custos e sua representatividade no transporte injustificado/inadequado foram, para a primeira questão, criadas quatro variáveis, Transporte Justificado (TJ), Transporte Justificado mas não o meio utilizado (TJnm), Transporte Justificado mas sem sustentação clínica (TJssc) e Transporte Não Justificado (TNJ) e para a segunda questão três variáveis, o Transporte em Ambulância (TA), o Transporte em Táxi (TT) e o Transporte Publico ou Próprio (TP). Resultados: Conclui-se do presente estudo que o Regulamento Interno do CHP tem, nas duas situações em análise, um grau elevado de conformidade com o respectivo normativo legal, de acordo com a Taxa de Conformidade Global (80%). Também é possível concluir na adequação dos critérios clínicos definidos à sua aplicação prática que os mesmos se adequam em 85,7% das situações analisadas, ou seja, em 85,7% das vezes o transporte estava justificado, sendo que em 38% das vezes o transporte estava integralmente justificado, em 49% das vezes estava justificado mas não o meio utilizado e em 14% encontrava-se justificado mas sem a sustentação clinica devida. No que respeita ao tipo de transporte utilizado dos transportes justificados, 90 % foi realizado em ambulância, 8% em táxi e 2% em transporte publico ou próprio e dos transportes não justificados 92,5% foi realizado em ambulância, 2,5% em táxi e 5% em transporte publico ou próprio. No que concerne à causa clínica, nos transportes justificados, 53,3% deve-se a problemas do aparelho locomotor, 25% a alterações neurológicas, 16,3% a patologias que condicionam incapacidade funcional em repouso ou para a actividade mínima diária, 4,6% a transplante renal, 0,4% a Hemodiálise/Diálise e 0,4% a casos sociais e nos transportes injustificados, 69,2% deveu-se a alterações neurológicas e 30,8% a problemas do aparelho locomotor. O custo do transporte injustificado ascendeu a 304.172,50 € enquanto o do transporte inadequado ascendeu a 187.263 €.

Prevenção referente às modalidades alternativas de transmissão do trypanosoma cruzi no Brasil

Consideram-se habituais em doença de Chagas humana os mecanismos vetorial, transfusional e congênito de transmissão. Acidental, oral e por transplantes são ditos alternativos. Possibilidades como por outros vetores, sexual, criminal e por secreção de marsupiais são consideradas excepcionais. A prevenção dos mecanismos alternativos, incluindo o congênito, está hoje consensuada: TRANSMISSÃO CONGÊNITA: detecção precoce do caso e seu tratamento específico. Se possível começar, no pré-natal com sorologia de gestantes. Quando viável, pesquisar parasitologicamente o RN de mães reagentes, tratando-se imediatamente os que resultarem positivos. Sendo negativos, sorologia convencional aos 8 meses de vida, tratando imediatamente os que estiverem reagentes. TRANSMISSÃO ACIDENTAL: Usar treinamento e equipamentos de proteção. Se acidente, desinfecção local, sorologia convencional e inicio de tratamento específico por dez dias. Revisão da sorologia em 30 dias, seguindo-se o tratamento até a dose total, no caso de reação positiva. TRANSPLANTES DE ÓRGÃOS: sorologia prévia no doador e receptor. Sendo o primeiro positivo e o segundo negativo, evitar o transplante ou tratar especificamente o doador por 10 dias antes da cirurgia e o receptor nos dez dias subsequentes à mesma. TRANSMISSÃO ORAL: de modo geral, higiene alimentar e cozimento de carnes de possíveis reservatórios. Hoje se recomenda a detecção precoce e tratamento imediato do caso, com intensa busca ativa entre os circunstantes mais próximos do paciente.

Transplantação hepática no C. H. Porto

RESUMO - Contexto: a actividade de transplantação hepática envolve um número considerável de profissionais multidisciplinares e, possui uma alocação de verbas importante do ponto de vista do administrador hospitalar. Estudar e analisar a actividade de transplantação hepática no Centro Hospitalar do Porto (CHP), é por isso, objecto do trabalho. Objectivos: Efectuar uma análise custo/proveito do processo de transplantação hepática para o CHP nos anos de 2010, 2011 e 2012 e, caracterizar a população em estudo com o maior número de variáveis possível. Metodologia: Seleccionou-se para análise os pacientes com o Grupo de Diagnóstico Homogéneo (GDH) 480 que realizaram transplante hepático entre 1 de Janeiro de 2010 até 30 de Junho de 2012 de modo a quantificar os custos e proveitos dos 161 pacientes desde a fase pré-transplante, passando pelo internamento até aos 6 meses após a alta hospitalar da fase pós-transplante. Na análise de custos da fase pré-transplante consideraram-se os custos com recursos humanos (RH) médicos das consultas e o custo com meios complementares de diagnóstico e terapêutica (MCDT’s). Na fase de internamento considerou-se os custos relativos à cirurgia (RH e material de consumo clinico e farmacológico) e diárias de internamento. Para a fase pós-transplante contabilizou-se os custos relativos a RH médicos das consultas, o custo com MCDT’s e fármacos. O apuramento de proveitos decorreu do contrato programa da instituição, da Portaria 839-A/2009 de 31 de Julho para o cálculo pelo peso relativo do transplante hepático, pelo Despacho nº 19964/2008 de 28 de Julho para a comparticipação dos fármacos. Considerou-se ainda o incentivo à transplantação pelos Despachos nº6155/2006, de 15 de Março e nº 10485/2011, de 19 de Agosto. Resultados: Da análise global dos 161 GDH’s o verificado foi um custo total para o CHP de 7.505.518,89euro (um custo médio de 46.618,13euro por paciente). Quanto aos proveitos utilizando o contrato programa do CHP bem como os Despachos relativos ao incentivo à transplantação e à comparticipação de fármacos, existiu proveitos de 7.089.462,77euro (proveito médio de 44.033,93euro). Se o cálculo dos proveitos de internamento fosse pelo peso relativo do transplante hepático os proveitos seriam de 21.834.655,50euro (proveito médio de 135.618,98euro).

The cellular basis of a congenital heart defect Drosophila

RESUMO: Mutações em genes envolvidos na formação do coração e anomalias em qualquer etapa deste processo causam frequentemente malformações cardíacas, que representam o tipo mais comum de defeitos em neonatais, afetando cerca de 1% dos nascimentos por ano. Assim, estima-se que 20 milhões de pessoas sejam portadoras de um defeito cardíaco congénito. O coração da Drosophila melanogaster (mosca-da-fruta), denominado vaso dorsal, é um órgão relativamente simples que actua como uma bomba muscular, contraindo automaticamente para permitir a circulação da hemolinfa através do corpo. A formação do vaso dorsal na mosca é muito semelhante ao desenvolvimento do coração em vertebrados, representando por isso, um poderoso modelo para estudar a rede de genes e os padrões regulatórios relacionados com o desenvolvimento deste órgão. Anteriormente, nós identificámos um gene em Drosophila, darhgef10, fortemente expresso no coração em desenvolvimento e cuja deleção induz anormalidades cardíacas subtis mas prevalentes. Os mutantes para darhgef10 são viáveis e férteis no ambiente controlado de laboratório. Este trabalho teve como objectivos caracterizar fenotipicamente os mutantes nulos para darhgef10, determinar a localização subcelular da proteína dArhgef10 e investigar a base celular subjacente ao defeito no alinhamento dos cardioblastos observado nos mutantes. Os nossos resultados revelaram que a deleção de darhgef10 provoca uma severa redução da viabilidade, sem no entanto comprometer o tempo de desenvolvimento e a longevidade. Por outro lado, o aumento da expressão de darhgef10 em músculos, glândulas salivares e no disco imaginal do olho afeta drasticamente a integridade destes tecidos. A expressão ectópica de darhgef10 in vitro e in vivo revelou que a proteína está localiza no citoplasma com enriquecimento junto à membrana celular, com associação à actina F. Live imaging de embriões mutantes para darhgef10 revelou que os defeitos observados no coração podem estar associados a um defeito na adesão dos músculos alary e/ou das células pericardiais ao vaso dorsal. O homólogo humano de darhgef10, ARHGEF10, também é expresso no coração e está associação a uma maior susceptibilidade para a ocorrência de acidentes vasculares cerebrais aterotrombóticos, sugerindo que o que aprendemos sobre darhgef10 em Drosophila pode ter implicações do ponto de vista clínico para a saúde humana. ----------------------------- ABSTRACT: Mutations in genes controlling heart development and abnormalities in any of its steps frequently cause cardiac malformations, the most common type of birth defects in humans, affecting nearly 1% of births per year. Hence around 20 million adults are expected to live with a congenital heart defect. The Drosophila melanogaster heart, called dorsal vessel, is a relatively simple organ that acts as a muscular pump contracting automatically to allow the circulation of hemolymph. Drosophila heart formation shares many similarities with heart development in vertebrates providing a powerful system to study gene networks and regulatory pathways involved in heart development. We have previously identified a Drosophila gene, darhgef10, which is strongly expressed in the developing heart and when deleted, leads to flies with highly prevalent yet subtle heart abnormalities, compatible with unchallenged life in the laboratory. Our aims were to phenotypically characterize homozygous null darhgef10 mutants, characterize the subcellular localization of dArhgef10 and to study the cellular basis of the misaligned cardioblasts defect. We found that about half of darhgef10 mutants die during development. However, the survivors surprisingly have a nearly normal developmental time, adult locomotor behavior and total lifespan. Detection of transgene-derived dArhgef10 protein in vitro and in vivo using custom antibodies revealed a cytosolic protein slightly enriched in the cellular membranes and associated with F-actin. Tissue-specific darhgef10 expression disrupts the normal morphology of developing muscles, salivary glands and the eye. Live imaging of darhgef10 mutant embryos revealed that heart defect could be caused by a reduced capacity of attachment of pericardial cells and/or alary muscle to dorsal vessel. The human homolog of darhgef10 is also expressed in the heart and is a susceptibility gene for atherothrombotic stroke, suggesting that what we learn about the function of this gene and its phenotypes in Drosophila could have implications to human health.

Avaliação económica em transplantação renal : abordagem estratégica do processo de doação e análise de custo-utilidade do programa de transplantação renal versus hemodiálise

SUMÁRIO - O desafio atual da Saúde Pública é assegurar a sustentabilidade financeira do sistema de saúde. Em ambiente de recursos escassos, as análises económicas aplicadas à prestação dos cuidados de saúde são um contributo para a tomada de decisão que visa a maximização do bem-estar social sujeita a restrição orçamental. Portugal é um país com 10,6 milhões de habitantes (2011) com uma incidência e prevalência elevadas de doença renal crónica estadio 5 (DRC5), respetivamente, 234 doentes por milhão de habitantes (pmh) e 1.600 doentes/pmh. O crescimento de doenças associadas às causas de DRC, nomeadamente, diabetes Mellitus e hipertensão arterial, antecipam uma tendência para o aumento do número de doentes. Em 2011, dos 17.553 doentes em tratamento substitutivo renal, 59% encontrava-se em programa de hemodiálise (Hd) em centros de diálise extra-hospitalares, 37% viviam com um enxerto renal funcionante e 4% estavam em diálise peritoneal (SPN, 2011). A lista ativa para transplante (Tx) renal registava 2.500 doentes (SPN 2009). O Tx renal é a melhor modalidade terapêutica pela melhoria da sobrevida, qualidade de vida e relação custo-efetividade, mas a elegibilidade para Tx e a oferta de órgãos condicionam esta opção. Esta investigação desenvolveu-se em duas vertentes: i) determinar o rácio custo-utilidade incremental do Tx renal comparado com a Hd; ii) avaliar a capacidade máxima de dadores de cadáver em Portugal, as características e as causas de morte dos dadores potenciais a nível nacional, por hospital e por Gabinete Coordenador de Colheita e Transplantação (GCCT), e analisar o desempenho da rede de colheita de órgãos para Tx. Realizou-se um estudo observacional/não interventivo, prospetivo e analítico que incidiu sobre uma coorte de doentes em Hd que foi submetida a Tx renal. O tempo de seguimento mínimo foi de um ano e máximo de três anos. No início do estudo, colheram-se dados sociodemográficos e clínicos em 386 doentes em Hd, elegíveis para Tx renal. A qualidade de vida relacionada com a saúde (QVRS) foi avaliada nos doentes em Hd (tempo 0) e nos transplantados, aos três, seis, 12 meses, e depois, anualmente. Incluíram-se os doentes que por falência do enxerto renal transitaram para Hd. Na sua medição, utilizou-se um instrumento baseado em preferências da população, o EuroQol-5D, que permite o posterior cálculo dos QALY. Num grupo de 82 doentes, a QVRS em Hd foi avaliada em dois tempos de resposta o que permitiu a análise da sua evolução. Realizou-se uma análise custo-utilidade do Tx renal comparado com a Hd na perspetiva da sociedade. Identificaram-se os custos diretos, médicos e não médicos, e as alterações de produtividade em Hd e Tx renal. Incluíram-se os custos da colheita de órgãos, seleção dos candidatos a Tx renal e follow-up dos dadores vivos. Cada doente transplantado foi utilizado como controle de si próprio em diálise. Avaliou-se o custo médio anual em programa de Hd crónica relativo ao ano anterior à Tx renal. Os custos do Tx foram avaliados prospetivamente. Considerou-se como horizonte temporal o ciclo de vida nas duas modalidades. Usaram-se taxas de atualização de 0%, 3% e 5% na atualização dos custos e QALY e efetuaram-se análises de sensibilidade one way. Entre 2008 e 2010, 65 doentes foram submetidos a Tx renal. Registaram-se, prospetivamente, os resultados em saúde incluíndo os internamentos e os efeitos adversos da imunossupressão, e o consumo dos recursos em saúde. Utilizaram-se modelos de medidas repetidas na avaliação da evolução da QVRS e modelos de regressão múltipla na análise da associação da QVRS e dos custos do transplante com as características basais dos doentes e os eventos clínicos. Comparativamente à Hd, observou-se melhoria da utilidade ao 3º mês de Tx e a qualidade de vida aferida pela escala EQ-VAS melhorou em todos os tempos de observação após o Tx renal. O custo médio da Hd foi de 32.567,57€, considerado uniforme ao longo do tempo. O custo médio do Tx renal foi de 60.210,09€ no 1º ano e 12.956,77€ nos anos seguintes. O rácio custo-utilidade do Tx renal vs Hd crónica foi de 2.004,75€/QALY. A partir de uma sobrevivência do enxerto de dois anos e cinco meses, o Tx associou-se a poupança dos custos. Utilizaram-se os dados nacionais dos Grupos de Diagnóstico Homogéneos e realizou-se um estudo retrospectivo que abrangeu as mortes ocorridas em 34 hospitais com colheita de órgãos, em 2006. Considerou-se como dador potencial o indivíduo com idade entre 1-70 anos cuja morte ocorrera a nível hospitalar, e que apresentasse critérios de adequação à doação de rim. Analisou-se a associação dos dadores potenciais com características populacionais e hospitalares. O desempenho das organizações de colheita de órgãos foi avaliado pela taxa de conversão (rácio entre os dadores potenciais e efetivos) e pelo número de dadores potenciais por milhão de habitantes a nível nacional, regional e por Gabinete Coordenador de Colheita e Transplantação (GCCT). Identificaram-se 3.838 dadores potenciais dos quais 608 apresentaram códigos da Classificação Internacional de Doenças, 9.ª Revisão, Modificações Clínicas (CID- 9-MC) que, com maior frequência, evoluem para a morte cerebral. O modelo logit para dados agrupados identificou a idade, o rácio da lotação em Unidades de Cuidados Intensivos e lotação de agudos, existência de GCCT e de Unidade de Transplantação, e mortalidade por acidente de trabalho como fatores preditivos da conversão dum dador potencial em efetivo e através das estimativas do modelo logit quantificou-se a probabilidade dessa conversão. A doação de órgãos deve ser assumida como uma prioridade e as autoridades em saúde devem assegurar o financiamento dos hospitais com programas de doação, evitando o desperdício de órgãos para transplantação, enquanto um bem público e escasso. A colheita de órgãos deve ser considerada uma opção estratégica da atividade hospitalar orientada para a organização e planeamento de serviços que maximizem a conversão de dadores potenciais em efetivos incluindo esse critério como medida de qualidade e efetividade do desempenho hospitalar. Os resultados deste estudo demonstram que: 1) o Tx renal proporciona ganhos em saúde, aumento da sobrevida e qualidade de vida, e poupança de custos; 2) em Portugal, a taxa máxima de eficácia da conversão dos dadores cadavéricos em dadores potenciais está longe de ser atingida. O investimento na rede de colheita de órgãos para Tx é essencial para assegurar a sustentabilidade financeira e promover a qualidade, eficiência e equidade dos cuidados em saúde prestados na DRC5.

Primary cilia and the regulation of hedgehog signaling: link to cardiac development

RESUMO: As células eucarióticas evoluíram um sistema de sinalização complexo que lhes permite responder aos sinais extracelulares e intracelulares. Desta forma, as vias de sinalização são essenciais para a sobrevivência da célula e do organismo, uma vez que regulam processos fundamentais, tais como o desenvolvimento, o crescimento, a imunidade, e a homeostase dos tecidos. A via de transdução de sinal Hedgehog (Hh) envolve o receptor Patched1 (Ptch1), que tem um efeito inibidor sobre a proteína Smoothened (Smo) na ausência dos seus ligandos, as proteínas Sonic hedgehog (Shh). Estas proteínas são reguladores fundamentais do desenvolvimento embrionário, como ilustrado pelas malformações drásticas observadas em embriões humanos e de murganho com perturbações da transdução de sinal da via Hh e que incluem polidactilia, defeitos craniofaciais e malformações ósseas. Igualmente importantes são as consequências da ativação inapropriada da via de sinalização Hh na formação de tumores. Curiosamente, os componentes desta via localizam-se nos cílios primários. Além disso, demonstrou-se que esta localização é crucial para a sinalização através da via Hh. Na presença dos ligandos, Ptch1 é internalizado e destinado a degradação ou sequestrado num compartimento da célula de onde não pode desempenhar o seu papel inibitório. A proteína Arl13b é uma pequena GTPase pertencente à família Arf/Arl da superfamília Ras de pequenas GTPases e foi implicada no síndrome de Joubert, uma ciliopatia caracterizada por ataxia congénita cerebelar, hipotonia, atrso mental e cardiopatia congénita. Murganhos deficientes para Arl13b, chamado hennin (hnn) morrem morrem prematuramente ao dia 13,5 de gestação (E13,5) e exibem anomalias morfológicas nos cílios que levam à interrupção da sinalização Hh. Além disso, a Arl13b está diretamente envolvida na regulação da via Hh, controlando a localização de vários componentes desta via nos cílios primários. Neste trabalho, mostramos que a Arl13b se localiza em circular dorsal ruffles (CDRs), que são estruturas de actina envolvidas em macropinocitose e internalização de recetores, e que regula a sua formação. Além disso, aprofundámos o conhecimento do processo de ativação da via de sinalização Hh, mostrando que as CDRs sequestram seletivamente e internalizam o recetor Ptch1. As CDRs formam-se minutos após ativação da via por ligandos Shh ou pelo agonista de Smo SAG e continuam a ser formadas a partir daí, sugerindo uma indução contínua da reorganização do citoesqueleto de actina quando a via está ativada. Observámos ainda que a inibição da formação de CDRs através do silenciamento de WAVE1, uma proteína necessária para a formação destas estruturas, resulta na diminuição da ativação da via de sinalização Hh. Além disso, o bloqueio da macropinocitose, que se segue ao fecho das CDRs, através do silenciamento de uma proteína necessária para a cisão de macropinossomas, nomeadamente a proteína BARS, tem um efeito semelhante. Estes resultados sugerem que as CDRs e a macropinocitose são necessárias para a ativação da via de sinalização Hh e indicam que esta via de internalização controla os níveis de sinal Hh. Durante o desenvolvimento, as células proliferativas dependem do cílio primário para a transdução de várias vias de sinalização. A via Hh induz a diferenciação do músculo cardíaco. Por conseguinte, os murganhos deficientes na via de sinalização Hh exibem uma variedade de defeitos de lateralidade, incluindo alteração do looping do coração, como pode ser visto em murganhos deficientes para Arl13b. Por conseguinte, investigámos o papel da Arl13b no desenvolvimento do coração. Mostramos que a Arl13b é altamente expressa no coração de embriões de murganho e de murganhos adultos ao nível do mRNA e da proteína. Além disso, o perfil de distribuição da Arl13b no coração segue o dos cílios primários, que são essenciais para o desenvolvimento cardíaco. Corações de murganhos hnn no estadio E12,5 mostram um canal átrio-ventricular aberto, espessamento da camada compacta ventricular e aumento do índice mitótico no ventrículo esquerdo. Além disso, um atraso de 1 a 2 dias no desenvolvimento é observado em corações de murganhos hnn, quando comparados com controlos selvagens no estadio E13,5. Assim, estes resultados sugerem que a Arl13b é necessária para o desenvolvimento embrionário do coração e que defeitos cardíacos podem contribuir para a letalidade embrionária de murganhos hnn. Em suma, foi estabelecido um novo mecanismo para a regulação dos níveis de superfície do recetor Ptch1, que envolve a remodelação do citoesqueleto de actina e a formação de CDRs após a ativação da via de sinalização Hh. Este mecanismo permite um feedback negativo que evita a repressão excessiva da via através da remoção de Ptch1 da superfície da célula. Além disso, determinou-se que uma mutação de perda de função na Arl13b causa defeitos cardíacos durante o desenvolvimento, possivelmente relacionados com a associação dos defeitos em cílios primários e na sinalização Hh, existentes em murganhos deficientes para Arl13b. A via de sinalização Hh tem tido um papel central entre as vias de sinalização, uma vez que a sua regulação é crucial para o funcionamento apropriada da célula. Assim, a descoberta de um novo mecanismo de tráfego através de macropinocitose e CDRs que controla a ativação e repressão da via de sinalização Hh traz novas perspetivas de como esta via pode ser regulada e pode ainda conduzir à identificação de novos alvos e estratégias terapêuticas. --------------------ABSTRACT: Eukaryotic cells have evolved a complex signaling system that allows them to respond to extracellular and intracellular cues. Signaling pathways are essential for cell and organism survival, since they regulate fundamental processes such as development, growth, immunity, and tissue homeostasis. The Hedgehog (Hh) pathway of signal transduction involves the receptor Patched1 (Ptch1), which has an inhibitory effect on Smoothened (Smo) in the absence of its ligands, the Sonic hedgehog (Shh) proteins. These proteins are fundamental regulators of embryonic development, as illustrated by the dramatic malformations seen in human and mouse embryos with perturbed Hh signal transduction that include polydactyly, craniofacial defects and skeletal malformations. Equally important are the consequences of inappropriate activation of the Hh signaling response in tumor formation. Interestingly, the components of this pathway localize to primary cilia. Moreover, it has been shown that this localization is crucial for Hh signaling. However, in the presence of the ligands, Ptch1 is internalized and destined for degradation or sequestered in a cell compartment where it no longer can play its inhibitory role. ADP-ribosylation factor-like (Arl) 13b, a small GTPase belonging to Arf/Arl family of the Ras superfamily of small GTPases has been implicated in Joubert syndrome, a ciliopathy characterized by congenital cerebellar ataxia, hypotonia, intellectual disability and congenital heart disease. Arl13b-deficient mice, called hennin (hnn) die at embryonic day 13.5 (E13.5) and display morphological abnormalities in primary cilia that lead to the disruption of Hh signaling. Furthermore, Arl13b is directly involved in the regulation of Hh signaling by controlling the localization of several components of this pathway to primary cilia. Here, we show that Arl13b localizes to and regulates the formation of circular dorsal rufles (CDRs), which are actin-basedstructures known to be involved in macropinocytosis and receptor internalization. Additionally, we extended the knowledge of the Hh signaling activation process by showing that CDRs selectively sequester and internalize Ptch1 receptors. CDRs are formed minutes after Hh activation by Shh ligands or the Smo agonist SAG and keep being formed thereafter, suggesting a continuous induction of actin reorganization when the pathway is switched on. Importantly, we observed that disruption of CDRs by silencing WAVE1, a protein required for CDR formation, results in down-regulation of Hh signaling activation. Moreover, the blockade of macropinocytosis, which follows CDR closure, through silencing of a protein necessary for the fission of macropinosomes, namely BARS has a similar effect. These results suggest that CDRs and macropinocytosis are necessary for activation of Hh signaling and indicate that this pathway of internalization controls Hh signal levels. During development, proliferating cells rely on the primary cilium for the transduction of several signaling pathways. Hh induces the differentiation of cardiac muscle. Accordingly, Hh-deficient mice display a variety of laterality defects, including alteration of heart looping, as seen in Arl13b-deficient mice. Therefore, we investigated the role of Arl13b in heart development. We show that Arl13b is highly expressed in the heart of both embryonic and adult mice at mRNA and protein levels. Also, Arl13b localization profile mimics that of primary cilia, which have been shown to be essential to early heart development. E12.5 hnn hearts show an open atrioventricular channel, increased thickening of the ventricular compact layer and increased mitotic index in the left ventricle. Moreover, a delay of 1 to 2 days in development is observed in hnn hearts, when compared to wild-type controls at E13.5. Hence, these results suggest that Arl13b is necessary for embryonic heart development and that cardiac defects might contribute to the embryonic lethality of hnn mice. Altogether, we established a novel mechanism for the regulation of Ptch1 surface levels, involving cytoskeleton remodeling and CDR formation upon Hh signaling activation. This mechanism allows a negative feedback loop that prevents excessive repression of the pathway by removing Ptch1 from the cell surface. Additionally, we determined that the Arl13b loss-offunction mutation causes cardiac defects during development, possibly related to the associated ciliary and Hh signaling defects found in Arl13b-deficient mice. Hh signaling has taken a center stage among the signaling pathways since its regulation is crucial for the appropriate output and function of the cell. Hence, the finding of a novel trafficking mechanism through CDRs and macropinocytosis that controls Hh signaling activation and repression brings new insights to how this pathway can be regulated and can lead to the discovery of novel therapeutic targets and strategies.

Ações farmacológicas do acido tânico. III. Análise em outros modelos experimentais

Estudos de nosso laboratório surgerem que o ácido tânico (AT) exerce diversos efeitos "in vitro" ou "in vivo", podendo ser responsável por várias ações inespecíficas freqüentemente observadas com extratos brutos de plantas medicinais. O presente trabalho amplia estes estudos em outos modelos biológicos. A administração crônica ou aguda, por vida oral (v.o.), de AT em ratos não produziu alterações gástricas ou no processo inflamatório. Em ratos não-diabéticos observou-se modificações variáveis na glicemia de acordo com a metodologia empregada. O AT, cronicamente (v.o.), não interferiu na reprodução de fêmeas, embora constatou-se redução do número de filhotes de machos tratados. O AT (3mg/kg, v.o.) provocou aumento da diurese, porém doses mais elevadas não modificaram o volume urinário. Os testes hematológicos demonstraram que o AT possui efeito anticoagulante "in vitro", sem modificar a fragilidade de hemácias ou na homeastase sanguínea "in vivo". No músculo esquelético, o AT reduziu a resposta contrátil à acetilcolina, enquanto no músculo cardíaco (átrio esquerdo) observou-se efeito inotrópico positivo ou negativo. Estes resultados estendem os estudos anteriores e reforçam a sugestão de que parte significativa dos efeitos inespecíficos observados com extratos brutos de plantas medicinais podem estar relacionados com a presença de taninos nos mesmos.

Terapia celular com células mesenquimais por via intracoronária: contributos do estudo invasivo da microcirculação coronária

RESUMO: Introdução - A utilização de células e das suas propriedades para o tratamento das doenças cardiovasculares, é uma promessa para o futuro e talvez a única forma de ultrapassar algumas das insuficiências das terapêuticas atuais. A via de entrega das células mais utilizada na investigação tem sido a intracoronária, ganhando a microcirculação especial relevância, por ser onde ocorre a primeira interação com o tecido nativo. As células estaminais mesenquimais (CEM) têm propriedades que as tornam particularmente aptas para a Terapia Celular, mas as suas dimensões, superiores ao diâmetro dos capilares, tem motivado controvérsia quanto à sua entrega intracoronária. A cardiologia de intervenção tem atualmente técnicas que permitem a avaliação em tempo real e in vivo do estado da microcirculação coronária. A determinação do índice da resistência da microcirculação (IRM) fornece informação sobre a circulação dos pequenos vasos, de forma independente da circulação coronária e do estado hemodinâmico, mas a aplicabilidade clínica deste conhecimento encontra-se ainda por definir. Objectivos Esclarecer o potencial do IRM no estudo dos efeitos do transplante de CEM por via intracoronária. População e Métodos . Estudo pré-clínico com modelo animal (suíno) desenvolvido em 3 fases. Na Primeira Fase foram utilizados 8 animais saudáveis para estudar e validar a técnica de determinação de estudo da microcirculação. Efetuou-se a determinação do IRM com duas doses diferentes de papaverina para a indução da resposta hiperémica máxima (5 e 10 mg) e após a disfunção da microcirculação com injeção intracoronária de microesferas de embozene com 40 μm de diâmetro. Na Segunda Fase foram utilizados 18 animais saudáveis, randomizados em grupo controlo e grupo recetor de 30 x 106 CEM por via intracoronária. Foram avaliados de forma cega o IRM, a pressão aórtica, o fluxo coronário epicárdico e a ocorrência de alterações electrocardiográficas. Na Terceira Fase foram utilizados 18 animais, com enfarte agudo do miocárdio provocado (EAM), randomizados em grupo controlo, grupo recetor de CEM expandidas de forma convencional e grupo recetor de CEM expandidas com metodologia inovadora e de menores dimensões. Foi realizada uma exploração da dose/efeito com infusão faseada de 10 x 106, 15 x 106 e 20 x 106 CEM, com determinação do IRM, da pressão aórtica, do fluxo coronário epicárdico e da ocorrência de alterações eletrocardiográficas. Quatro semanas após a entrega das células foi novamente avaliado o IRM e foi efetuado o estudo anatomopatológico dos animais na procura de evidência de neoangiogénese e de regeneração miocárdica, ou de um efeito positivo da resposta reparadora após o enfarte. Resultados Nas 3 fases todos os animais mantiveram estabilidade hemodinâmica e eletrocardiográfica, com exceção da elevação de ST de V1-V3 verificada após a injeção das microesferas. Na Primeira Fase as duas doses de papaverina induziram uma resposta hiperémica eficaz, sem tradução com significado na determinação do IRM (variação da pressão distal de - 11,4 ± 5 e de - 10,6± 5 mmHg com as doses de 5 e 10 mg respetivamente (p=0,5). Com a injeção das microesferas o IRM teve uma elevação média de 310 ± 190 %, para um valor médio de 41,3 ± 16 U (p = 0,001). Na Segunda Fase não houve diferenças significativas dos parâmetros hemodinâmicos, do fluxo epicárdico e da avaliação eletrocardiográfica entre os dois grupos. O IRM de base foi semelhante e após a infusão intracoronária observou-se uma elevação expressiva do IRM nos animais que receberam células em comparação com o grupo controlo (8,8 U ± 1 vs. 14,2 U ± 1,8, P=0,02) e quanto ao seu valor de base (aumento de 112%, p=0,008). Na terceira Fase não houve novamente diferenças significativas dos parâmetros hemodinâmicos, do fluxo epicárdico e da avaliação eletrocardiográfica entre os três grupos. Houve uma elevação do IRM nos animais que receberam células a partir da 2ª dose (72% nas células convencionai e 108% nas células inovadoras) e que se manteve com a 3ª dose (100% nas células convencionais e 88% nas inovadoras) com significado estatístico em comparação com o grupo controlo (p=0,034 com a 2ªdose e p=0,024 com a 3ª dose). Quatro semanas após a entrega das CEM observou-se a descida do IRM nos dois grupos que receberam células, para valores sobreponíveis aos do grupo controlo e aos valores pós-EAM. Na avaliação anatomopatológica e histológica dos corações explantados não houve diferenças entre os três grupos. Conclusões O IRM permite distinguir alterações da microcirculação coronária motivadas pela entrega intracoronária de CEM, na ausência de alterações de outros parâmetros clínicos da circulação coronária utilizados em tempo real. As alterações do IRM são progressivas e passíveis de avaliar o efeito/dose, embora não tenha sido possível determinar diferenças com os dois tipos de CEM. No nosso modelo a injeção intracoronária não se associou a evidência de efeito benéfico na reparação ou regeneração miocárdica após o EAM.---------------------------- ABSTRACT: ABSTRACT Introduction The use of cells for the treatment of cardiovascular disease is a promise for the future and perhaps the only option to overcome some of the shortcomings of current therapies. The strategy for the delivery of cells most often used in current research has been the intracoronary route and due to this microcirculation gains special relevance, mainly because it is the first interaction site of transplanted cells with the native tissue. Mesenchymal stem cells (MSC) have properties that make them suitable for Cell Therapy, but its dimensions, larger than the diameter of capillaries, have prompted controversy about the safety of intracoronary delivery. The interventional cardiology currently has techniques that allow for real-time and in vivo assessment of coronary microcirculation state. The determination of the index of microcirculatory resistance index (IMR) provides information about small vessels, independently of the coronary circulation and hemodynamic status, but the clinical applicability of this knowledge is yet to be defined. Objectives To clarify the potential use of IMR in the study of the effects of MSC through intracoronary transplantation. Population and Methods Preclinical study with swine model developed in three phases. In Phase One 8 healthy animals were used to study and validate the IMR assessment in our animal model. IMR was assessed with two different doses of papaverine for inducing the maximal hyperaemic response (5 and 10 mg) and microcirculation dysfunction was achieved after intracoronary injection with embozene microspheres with 40 μm in diameter. In Phase Two we randomized 18 healthy animals divided between the control group and the one receiving 30 x 106 MSC through an intracoronary infusion. There we blindly evaluated IMR, the aortic pressure, the epicardial coronary flow and the occurrence of ECG changes. In Phase Three we used 18 animals with a provoked acute myocardial infarction (AMI), randomized into a control group, a MSC expanded conventionally receiver group and a MSC expanded with an innovative methodology receiver group. There was a stepwise infusion with doses of 10 x 106, 15 x 106 and 20 x 106 MSC with determination of IMR, the aortic pressure, the epicardial coronary flow and occurrence of electrocardiographic abnormalities. Four weeks after cell delivery we again measured the IMR and proceeded with the pathological study of animals in the search for evidence of neoangiogenesis and myocardial regeneration, or a positive effect in the reparative response following the infarction. Results All animals remained hemodynamically stable and with no electrocardiographic abnormalities, except for the ST elevation in V1-V3 observed after injection of the microspheres. In Phase One the two doses of papaverine achieved an hyperemic and effective response without significant differences in IMR (variation of the distal pressure -11.4 ± 5 and -10.6 ± 5 mmHg with the doses of 5 and 10 mg respectively (p = 0.5). With the injection of the microspheres the IMR had an average increase of 310 ± 190% for an average value of 41.3 ± 16 U (p = 0.001). In the second phase there were no significant differences in hemodynamic parameters, epicardial flow and electrocardiographic assessment between the two groups. The baseline IMR was similar and after intracoronary infusion there was a significant increase in animals receiving cells compared with the control group (8.8 ± U 1 vs. 14.2 ± 1.8, p = 0.02) and with their baseline (112% increase, p = 0.008). In the third phase again there were no significant differences in hemodynamic parameters, the epicardial flow and electrocardiographic evaluation between the three groups. There was a significant increase in IMR in animals that received cells from the 2nd dose (72% in conventional cells and 108% in the innovative cells) that remained with the 3rd dose (100% in conventional cells and 88% in the innovative) with statistical significance compared with the control group (p = 0.034 with 2nd dose, p = 0.024 with 3rd dose). Four weeks after delivery of the MSC we observed the fall of the IMR in the two groups that received cells with values overlapping those of the control group. In pathological and histological evaluation of removed hearts there were no differences among the three groups. Conclusions The IMR allows for the differentiation of changes in coronary microcirculation motivated by intracoronary delivery of MSC in the absence of modification in other clinical parameters. IMR changes are progressive and enable the evaluation of the effect / dose, though it has not been possible to determine differences in the two types of MSC. In our model, intracoronary injection of MSC was not associated with evidence of repair or myocardial regeneration after AMI.

INFLUÊNCIA DO SOMBREAMENTO NO DESENVOLVIMENTO DE MUDAS DE LOURO PIRARUCU (Licaria canella (Meissn.) Kosterm.)

Com o objetivo de avaliar o efeito dos níveis de sombreamento no desenvolvimento de mudas de Louro pirarucu (Licaria canella(Meissn.) Kosterm. - Lauraceae), conduziu-se um ensaio em viveiro na Reserva Florestal Adolfo Ducke. As sementes foram colocadas para germinar em caixas de madeira contendo areia lavada como substrato e posteriormente foi feito o transplante das mudas para sacos plásticos de cor preta. Utitizou-se quatro diferentes níveis de sombreamento. Os níveis de 30%, 50% e 70% de sombreamento foram obtidos por meio de telas de poliolefinas de cor preta e o nível de 0% a céu aberto. Foi empregado o delineamento em blocos ao acaso com parcelas subdivididas; os níveis de sombreamento constituíram as parcelas e os períodos de avaliação das mudas as subparcelas. Após 30,60 e 90 dias de permanência no viveiro, as mudas foram avaliadas quanto à altura, área foliar, razão de área foliar, peso de matéria seca da parte aérea e do sistema radicular. Baseando-se nos resultados obtidos, pode-se concluir: a) as mudas produzidas sob 50% de sombreamento apresentaram maiores valores de peso da parte aérea e do sistema radicular quando comparadas com 0% de sombreamento ; b) a altura, área foliar e razão de área foliar não foram influenciadas significativamente pelos níveis de sombreamento; c) as mudas com maior desenvolvimento em altura e maior peso do sistema radicular foram obtidas com 90 dias.

Efeitos do tamanho da semente e do recipiente no crescimento de mudas de Camu-camu (Myrciaria dubia)

O camu-camu (Myrciaria dubia (H. B. K.) McVaugh, Myrtaceae) é uma fruteira silvestre dos rios e lagos da Amazônia que está sendo domesticada para cultivo cm solos de terra firme. O seu potencial econômico reside no seu alto teor de ácido ascórbico, que pode ser de até 2950 mg/100g de polpa. O objetivo do presente trabalho foi avaliar o desenvolvimento das mudas de camu-camu provenientes de sementes de diferentes tamanhos, produzidas em diferentes volumes de substrato. O delineamento experimental foi de blocos casualizados, em esquema fatorial de 3x4, com quatro repetições. Os fatores foram tamanho da semente (pequena, média e grande, pesando 19, 37 e 67 g/100 sementes, respectivamente) e tamanhos do recipiente (sacos plásticos pretos de 12x23, 16x28, 19x21 e 20,5x33 cm, com 750, 1500, 1750 e 3500 g, respectivamente). As mudas provenientes de sementes grandes c médias tiveram melhor desenvolvimento (altura de 53 e 46 cm, respectivamente) e as mudas cultivadas em sacos de 19x21 cm mostraram uma tendência de maior desenvolvimento (altura de 49 cm), inclusive durante todo o período de cinco meses. Portanto, mudas de camu-camu com 30 cm de altura (pronto para o campo) podem ser obtidas em 60 a 70 dias após o transplante das plântulas provenientes de sementes grandes e médios e usando sacos de mudas com 19x21 cm.

Bacterial cellulose as a novel substrate for retinal pigment epithelium cells transplantation in age-related macular degeneration

Tese de Doutoramento em Engenharia Química e Biológica.

Empathy and heart rate variability: a need and a mechanism of emotion regulation

Dissertação de mestrado integrado em Psicologia