Innovative analytical strategies for the development of sensor devices and mass spectrometry methods

Il lavoro presentato in questa tesi di Dottorato è incentrato sullo sviluppo di strategie analitiche innovative basate sulla sensoristica e su tecniche di spettrometria di massa in ambito biologico e della sicurezza alimentare. Il primo capitolo tratta lo studio di aspetti metodologici ed applicativi di procedure sensoristiche per l’identificazione e la determinazione di biomarkers associati alla malattia celiaca. In tale ambito, sono stati sviluppati due immunosensori, uno a trasduzione piezoelettrica e uno a trasduzione amperometrica, per la rivelazione di anticorpi anti-transglutaminasi tissutale associati a questa malattia. L’innovazione di questi dispositivi riguarda l’immobilizzazione dell’enzima tTG nella conformazione aperta (Open-tTG), che è stato dimostrato essere quella principalmente coinvolta nella patogenesi. Sulla base dei risultati ottenuti, entrambi i sistemi sviluppati si sono dimostrati una valida alternativa ai test di screening attualmente in uso per la diagnosi della celiachia. Rimanendo sempre nel contesto della malattia celiaca, ulteriore ricerca oggetto di questa tesi di Dottorato, ha riguardato lo sviluppo di metodi affidabili per il controllo di prodotti “gluten-free”. Il secondo capitolo tratta lo sviluppo di un metodo di spettrometria di massa e di un immunosensore competitivo per la rivelazione di prolammine in alimenti “gluten-free”. E’ stato sviluppato un metodo LC-ESI-MS/MS basato su un’analisi target con modalità di acquisizione del segnale selected reaction monitoring per l’identificazione di glutine in diversi cereali potenzialmente tossici per i celiaci. Inoltre ci si è focalizzati su un immunosensore competitivo per la rivelazione di gliadina, come metodo di screening rapido di farine. Entrambi i sistemi sono stati ottimizzati impiegando miscele di farina di riso addizionata di gliadina, avenine, ordeine e secaline nel caso del sistema LC-MS/MS e con sola gliadina nel caso del sensore. Infine i sistemi analitici sono stati validati analizzando sia materie prime (farine) che alimenti (biscotti, pasta, pane, etc.). L’approccio sviluppato in spettrometria di massa apre la strada alla possibilità di sviluppare un test di screening multiplo per la valutazione della sicurezza di prodotti dichiarati “gluten-free”, mentre ulteriori studi dovranno essere svolti per ricercare condizioni di estrazione compatibili con l’immunosaggio competitivo, per ora applicabile solo all’analisi di farine estratte con etanolo. Terzo capitolo di questa tesi riguarda lo sviluppo di nuovi metodi per la rivelazione di HPV, Chlamydia e Gonorrhoeae in fluidi biologici. Si è scelto un substrato costituito da strips di carta in quanto possono costituire una valida piattaforma di rivelazione, offrendo vantaggi grazie al basso costo, alla possibilità di generare dispositivi portatili e di poter visualizzare il risultato visivamente senza la necessità di strumentazioni. La metodologia sviluppata è molto semplice, non prevede l’uso di strumentazione complessa e si basa sull’uso della isothermal rolling-circle amplification per l’amplificazione del target. Inoltre, di fondamentale importanza, è l’utilizzo di nanoparticelle colorate che, essendo state funzionalizzate con una sequenza di DNA complementare al target amplificato derivante dalla RCA, ne permettono la rivelazione a occhio nudo mediante l’uso di filtri di carta. Queste strips sono state testate su campioni reali permettendo una discriminazione tra campioni positivi e negativi in tempi rapidi (10-15 minuti), aprendo una nuova via verso nuovi test altamente competitivi con quelli attualmente sul mercato.

Endometrial response toward bovine herpesvirus 4 infection

Metriti ed endometriti sono le patologie maggiormente responsabili delle perdite economiche negli allevamenti bovini da latte, specialmente nel periodo successivo al parto. Mentre le metriti coinvolgono e si sviluppano in tutto l’utero e sono caratterizzate dalla presenza di sintomi sistemici, le endometriti consistono in una infiammazione che riguarda il solo endometrio, con la presenza di perdite purulente, distruzione della superficie epiteliale, congestione vascolare, edema stromale ed accumulo di linfociti e plasmacellule. Queste patologie, inoltre, possono causare, disfunzione ovarica, con conseguente infertilità e riduzione sia dell’efficienza riproduttiva della vacca sia della produzione stessa di latte. Nonostante queste malattie siano, nella maggior parte dei casi, correlate all’instaurarsi di infezioni batteriche, che possono subentrare nell’utero direttamente durante il parto, il ruolo di alcuni virus nello sviluppo di queste patologie è stato recentemente approfondito e la correlazione tra l’ Herpesvirus Bovino 4 e l’insorgere di metriti ed endometriti è stata dimostrata. L’ Herpesvirus Bovino 4 (BoHV-4) è un gamma-herpesvirus ed il suo genoma è costituito da una molecola lineare di DNA a doppio filamento con una struttura genomica di tipo B, caratterizzata dalla presenza di un’unica lunga sequenza centrale (LUR) fiancheggiata da multiple sequenze poli-ripetute (prDNA). BoHV-4 è stato isolato sia da animali sani sia da animali con differenti patologie, tra cui malattie oculari e respiratorie, ma soprattutto da casi di metriti, endometriti, vaginiti o aborti. Generalmente, il ruolo svolto dal virus in questo tipo di patologie è associato alla compresenza di altri tipi di patogeni, che possono essere virus, come nel caso del Virus Della Diarrea Virale Bovina (BVDV), o più frequentemente batteri. Usualmente, l’iniziale difesa dell’endometrio bovino nei confronti dei microbi si fonda sul sistema immunitario innato e l’attivazione di specifici recettori cellulari determina la sintesi e la produzione di citochine e chemochine pro infiammatorie, che possono essere in grado di modulare la replicazione di BoHV-4. Il genoma di BoHV-4 possiede due principali trascritti per i geni Immediate Early (IE), trai quali ORF50/IE2 è il più importante ed il suo prodotto, Rta/ORF50, è fortemente conservato tra tutti gli Herpesvirus. Esso è responsabile della diretta trans-attivazione di numerosi geni virali e cellulari e può essere modulato da differenti stimoli extracellulari. Precedentemente è stato dimostrato come il TNF-, prodotto dalle cellule stromali e dai macrofagi all’interno dell’endometrio, in conseguenza ad infezione batterica, sia in grado di aumentare la replicazione di BoHV-4 attraverso l’attivazione del pathway di NFkB e direttamente agendo sul promotore di IE2. Per queste ragioni, è risultato di forte interesse investigare quali potessero essere, invece, i fattori limitanti la replicazione di BoHV-4. In questo lavoro è stata studiata la relazione tra cellule endometriali stromali bovine infettate con l’Herpesvirus Bovino 4 e l’interferon gamma (IFN-) ed è stata dimostrata la capacità di questa molecola di restringere la replicazione di BoHV-4 in maniera IDO1 indipendente ed IE2 dipendente. Inoltre, la presenza di alcuni elementi in grado di interagire con l’ IFN-γ, all’interno del promotore di IE2 di BoHV-4, ha confermato questa ipotesi. Basandoci su questi dati, abbiamo potuto supporre l’esistenza di uno stretto vincolo tra l’attivazione dell’asse dell’interferon gamma e la ridotta replicazione di BoHV-4, andando a porre le basi per una nuova efficiente cura e prevenzione per le patologie uterine. Poiché il meccanismo corretto attraverso il quale BoHV-4 infetta l’endometrio bovino non è ancora ben compreso, è stato interessante approfondire in maniera più accurata l’interazione presente tra il virus ed il substrato endometriale, analizzando le differenze esistenti tra cellule infettate e non, in termini di espressione genica. Basandoci su dati preliminari ottenuti attraverso analisi con RNA sequencing (RNAseq), abbiamo visto come numerosi geni risultino over-espressi in seguito ad infezione con BoHV-4 e come, tra questi, la Metalloproteasi 1 sia uno dei più interessanti, a causa delle sue possibili implicazioni nello sviluppo delle patologie dell’endometrio uterino bovino. Successive analisi, effettuate tramite westernblotting e real time PCR, sono state in grado di confermare tale dato, sottolineando l’efficacia di un nuovo approccio sperimentale, basato sul RNAseq, per lo studio dell’insorgenza delle patologie.

Applicazione della spettrometria di massa MALDI-TOF in microbiologia clinica

Riassunto La spettrometria di massa (MS) nata negli anni ’70 trova oggi, grazie alla tecnologia Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight (MALDI-TOF), importanti applicazioni in diversi settori: biotecnologico (per la caratterizzazione ed il controllo di qualità di proteine ricombinanti ed altre macromolecole), medico–clinico (per la diagnosi di laboratorio di malattie e per lo sviluppo di nuovi trattamenti terapeutici mirati), alimentare ed ambientale. Negli ultimi anni, questa tecnologia è diventata un potente strumento anche per la diagnosi di laboratorio in microbiologia clinica, rivoluzionando il flusso di lavoro per una rapida identificazione di batteri e funghi, sostituendo l’identificazione fenotipica convenzionale basata su saggi biochimici. Attualmente mediante MALDI-TOF MS sono possibili due diversi approcci per la caratterizzazione dei microrganismi: (1) confronto degli spettri (“mass spectra”) con banche dati contenenti profili di riferimento (“database fingerprints”) e (2) “matching” di bio-marcatori con banche dati proteomiche (“proteome database”). Recentemente, la tecnologia MALDI-TOF, oltre alla sua applicazione classica nell’identificazione di microrganismi, è stata utilizzata per individuare, indirettamente, meccanismi di resistenza agli antibiotici. Primo scopo di questo studio è stato verificare e dimostrare l’efficacia identificativa della metodica MALDI-TOF MS mediante approccio di comparazione degli spettri di differenti microrganismi di interesse medico per i quali l’identificazione risultava impossibile a causa della completa assenza o presenza limitata, di spettri di riferimento all’interno della banca dati commerciale associata allo strumento. In particolare, tale scopo è stato raggiunto per i batteri appartenenti a spirochete del genere Borrelia e Leptospira, a miceti filamentosi (dermatofiti) e protozoi (Trichomonas vaginalis). Secondo scopo di questo studio è stato valutare il secondo approccio identificativo basato sulla ricerca di specifici marcatori per differenziare parassiti intestinali di interesse medico per i quali non è disponibile una banca dati commerciale di riferimento e la sua creazione risulterebbe particolarmente difficile e complessa, a causa della complessità del materiale biologico di partenza analizzato e del terreno di coltura nei quali questi protozoi sono isolati. Terzo ed ultimo scopo di questo studio è stata la valutazione dell’applicabilità della spettrometria di massa con tecnologia MALDI-TOF per lo studio delle resistenze batteriche ai carbapenemi. In particolare, è stato messo a punto un saggio di idrolisi dei carbapenemi rilevata mediante MALDI-TOF MS in grado di determinare indirettamente la produzione di carbapenemasi in Enterobacteriaceae. L’efficacia identificativa della metodica MALDI-TOF mediante l’approccio di comparazione degli spettri è stata dimostrata in primo luogo per batteri appartenenti al genere Borrelia. La banca dati commerciale dello strumento MALDI-TOF MS in uso presso il nostro laboratorio includeva solo 3 spettri di riferimento appartenenti alle specie B. burgdorferi ss, B. spielmani e B. garinii. L’implementazione del “database” con specie diverse da quelle già presenti ha permesso di colmare le lacune identificative dovute alla mancanza di spettri di riferimento di alcune tra le specie di Borrelia più diffuse in Europa (B. afzelii) e nel mondo (come ad esempio B. hermsii, e B. japonica). Inoltre l’implementazione con spettri derivanti da ceppi di riferimento di specie già presenti nel “database” ha ulteriormente migliorato l’efficacia identificativa del sistema. Come atteso, il ceppo di isolamento clinico di B. lusitaniae (specie non presente nel “database”) è stato identificato solo a livello di genere corroborando, grazie all’assenza di mis-identificazione, la robustezza della “nuova” banca dati. I risultati ottenuti analizzando i profili proteici di ceppi di Borrelia spp. di isolamento clinico, dopo integrazione del “database” commerciale, indicano che la tecnologia MALDI-TOF potrebbe essere utilizzata come rapida, economica ed affidabile alternativa ai metodi attualmente utilizzati per identificare ceppi appartenenti a questo genere. Analogamente, per il genere Leptospira dopo la creazione ex-novo della banca dati “home-made”, costruita con i 20 spettri derivati dai 20 ceppi di riferimento utilizzati, è stata ottenuta una corretta identificazione a livello di specie degli stessi ceppi ri-analizzati in un esperimento indipendente condotto in doppio cieco. Il dendrogramma costruito con i 20 MSP-Spectra implementati nella banca dati è formato da due rami principali: il primo formato dalla specie non patogena L. biflexa e dalla specie a patogenicità intermedia L. fainei ed il secondo che raggruppa insieme le specie patogene L. interrogans, L. kirschneri, L. noguchii e L. borgpetersenii. Il secondo gruppo è ulteriormente suddiviso in due rami, contenenti rispettivamente L. borgpetersenii in uno e L. interrogans, L. kirschneri e L. noguchii nell’altro. Quest’ultimo, a sua volta, è suddiviso in due rami ulteriori: il primo comprendente la sola specie L. noguchii, il secondo le specie L. interrogans e L. kirshneri non separabili tra loro. Inoltre, il dendrogramma costruito con gli MSP-Spectra dei ceppi appartenenti ai generi Borrelia e Leptospira acquisiti in questo studio, e appartenenti al genere Brachyspira (implementati in un lavoro precedentemente condotto) mostra tre gruppi principali separati tra loro, uno per ogni genere, escludendo possibili mis-identificazioni tra i 3 differenti generi di spirochete. Un’analisi più approfondita dei profili proteici ottenuti dall’analisi ha mostrato piccole differenze per ceppi della stessa specie probabilmente dovute ai diversi pattern proteici dei distinti sierotipi, come confermato dalla successiva analisi statistica, che ha evidenziato picchi sierotipo-specifici. È stato, infatti, possibile mediante la creazione di un modello statistico dedicato ottenere un “pattern” di picchi discriminanti in grado di differenziare a livello di sierotipo sia i ceppi di L. interrogans sia i ceppi di L. borgpetersenii saggiati, rispettivamente. Tuttavia, non possiamo concludere che i picchi discriminanti da noi riportati siano universalmente in grado di identificare il sierotipo dei ceppi di L. interrogans ed L. borgpetersenii; i picchi trovati, infatti, sono il risultato di un’analisi condotta su uno specifico pannello di sierotipi. È stato quindi dimostrato che attuando piccoli cambiamenti nei parametri standardizzati come l’utilizzo di un modello statistico e di un programma dedicato applicato nella routine diagnostica è possibile utilizzare la spettrometria di massa MALDI-TOF per una rapida ed economica identificazione anche a livello di sierotipo. Questo può significativamente migliorare gli approcci correntemente utilizzati per monitorare l’insorgenza di focolai epidemici e per la sorveglianza degli agenti patogeni. Analogamente a quanto dimostrato per Borrelia e Leptospira, l’implementazione della banca dati dello spettrometro di massa con spettri di riferimento di miceti filamentosi (dermatofiti) si è rilevata di particolare importanza non solo per l’identificazione di tutte le specie circolanti nella nostra area ma anche per l’identificazione di specie la cui frequenza nel nostro Paese è in aumento a causa dei flussi migratori dalla zone endemiche (M. audouinii, T. violaceum e T. sudanense). Inoltre, l’aggiornamento del “database” ha consentito di superare la mis-identificazione dei ceppi appartenenti al complesso T. mentagrophytes (T. interdigitale e T. mentagrophytes) con T. tonsurans, riscontrata prima dell’implementazione della banca dati commerciale. Il dendrogramma ottenuto dai 24 spettri implementati appartenenti a 13 specie di dermatofiti ha rivelato raggruppamenti che riflettono quelli costruiti su base filogenetica. Sulla base dei risultati ottenuti mediante sequenziamento della porzione della regione ITS del genoma fungino non è stato possibile distinguere T. interdigitale e T. mentagrophytes, conseguentemente anche gli spettri di queste due specie presentavano picchi dello stesso peso molecoalre. Da sottolineare che il dendrogramma costruito con i 12 profili proteici già inclusi nel database commerciale e con i 24 inseriti nel nuovo database non riproduce l’albero filogenetico per alcune specie del genere Tricophyton: gli spettri MSP già presenti nel database e quelli aggiunti delle specie T. interdigitale e T. mentagrophytes raggruppano separatamente. Questo potrebbe spiegare le mis-identificazioni di T. interdigitale e T. mentagrophytes con T. tonsurans ottenute prima dell’implementazione del database. L’efficacia del sistema identificativo MALDI-TOF è stata anche dimostrata per microrganismi diversi da batteri e funghi per i quali la metodica originale è stata sviluppata. Sebbene tale sistema identificativo sia stato applicato con successo a Trichomonas vaginalis è stato necessario apportare modifiche nei parametri standard previsti per l’identificazione di batteri e funghi. Le interferenze riscontrate tra i profili proteici ottenuti per i due terreni utilizzati per la coltura di questo protozoo e per i ceppi di T. vaginalis hanno, infatti, reso necessario l’utilizzo di nuovi parametri per la creazione degli spettri di riferimento (MSP-Spectra). L’importanza dello sviluppo del nuovo metodo risiede nel fatto che è possibile identificare sulla base del profilo proteico (e non sulla base di singoli marcatori) microorganismi cresciuti su terreni complessi che potrebbero presentare picchi nell'intervallo di peso molecolare utilizzato a scopo identificativo: metaboliti, pigmenti e nutrienti presenti nel terreno possono interferire con il processo di cristallizzazione e portare ad un basso punteggio identificativo. Per T. vaginalis, in particolare, la “sottrazione” di picchi dovuti a molecole riconducibili al terreno di crescita utilizzato, è stata ottenuta escludendo dall'identificazione l'intervallo di peso molecolare compreso tra 3-6 kDa, permettendo la corretta identificazione di ceppi di isolamento clinico sulla base del profilo proteico. Tuttavia, l’elevata concentrazione di parassita richiesta (105 trofozoiti/ml) per una corretta identificazione, difficilmente ottenibile in vivo, ha impedito l’identificazione di ceppi di T. vaginalis direttamente in campioni clinici. L’approccio identificativo mediante individuazione di specifici marcatori proteici (secondo approccio identificativo) è stato provato ed adottato in questo studio per l’identificazione e la differenziazione di ceppi di Entamoeba histolytica (ameba patogena) ed Entamoeba dispar (ameba non patogena), specie morfologiacamente identiche e distinguibili solo mediante saggi molecolari (PCR) aventi come bersaglio il DNA-18S, che codifica per l’RNA della subunità ribosomiale minore. Lo sviluppo di tale applicazione ha consentito di superare l’impossibilità della creazione di una banca dati dedicata, a causa della complessità del materiale fecale di partenza e del terreno di coltura impiagato per l’isolamento, e di identificare 5 picchi proteici in grado di differenziare E. histolytica da E. dispar. In particolare, l’analisi statistica ha mostrato 2 picchi specifici per E. histolytica e 3 picchi specifici per E. dispar. L’assenza dei 5 picchi discriminanti trovati per E. histolytica e E. dispar nei profili dei 3 differenti terreni di coltura utilizzati in questo studio (terreno axenico LYI-S-2 e terreno di Robinson con e senza E. coli) permettono di considerare questi picchi buoni marcatori in grado di differenziare le due specie. La corrispondenza dei picchi con il PM di due specifiche proteine di E. histolytica depositate in letteratura (Amoebapore A e un “unknown putative protein” di E. histolytica ceppo di riferimento HM-1:IMSS-A) conferma la specificità dei picchi di E. histolytica identificati mediante analisi MALDI-TOF MS. Lo stesso riscontro non è stato possibile per i picchi di E. dispar in quanto nessuna proteina del PM di interesse è presente in GenBank. Tuttavia, va ricordato che non tutte le proteine E. dispar sono state ad oggi caratterizzate e depositate in letteratura. I 5 marcatori hanno permesso di differenziare 12 dei 13 ceppi isolati da campioni di feci e cresciuti in terreno di Robinson confermando i risultati ottenuti mediante saggio di Real-Time PCR. Per un solo ceppo di isolamento clinico di E. histolytica l’identificazione, confermata mediante sequenziamento della porzione 18S-rDNA, non è stata ottenuta mediante sistema MALDI-TOF MS in quanto non sono stati trovati né i picchi corrispondenti a E. histolytica né i picchi corrispondenti a E. dispar. Per questo ceppo è possibile ipotizzare la presenza di mutazioni geno/fenotipiche a livello delle proteine individuate come marcatori specifici per E. histolytica. Per confermare questa ipotesi sarebbe necessario analizzare un numero maggiore di ceppi di isolamento clinico con analogo profilo proteico. L’analisi condotta a diversi tempi di incubazione del campione di feci positivo per E. histolytica ed E. dipar ha mostrato il ritrovamento dei 5 picchi discriminanti solo dopo 12 ore dall’inoculo del campione nel terreno iniziale di Robinson. Questo risultato suggerisce la possibile applicazione del sistema MALDI-TOF MS per identificare ceppi di isolamento clinico di E. histolytica ed E. dipar nonostante la presenza di materiale fecale che materialmente può disturbare e rendere difficile l’interpretazione dello spettro ottenuto mediante analisi MALDI-TOF MS. Infine in questo studio è stata valutata l’applicabilità della tecnologia MALDI-TOF MS come saggio fenotipico rapido per la determinazione di ceppi produttori di carbapenemasi, verificando l'avvenuta idrolisi del meropenem (carbapeneme di riferimento utilizzato in questo studio) a contatto con i ceppi di riferimento e ceppi di isolamento clinico potenzialmente produttori di carbapenemasi dopo la messa a punto di un protocollo analitico dedicato. Il saggio di idrolisi del meropenem mediante MALDI-TOF MS ha dimostrato la presenza o l’assenza indiretta di carbapenemasi nei 3 ceppi di riferimento e nei 1219 (1185 Enterobacteriaceae e 34 non-Enterobacteriaceae) ceppi di isolamento clinico inclusi nello studio. Nessuna interferenza è stata riscontrata per i ceppi di Enterobacteriaceae variamente resistenti ai tre carbapenemi ma risultati non produttori di carbapenemasi mediante i saggi fenotipici comunemente impiegati nella diagnostica routinaria di laboratorio: nessuna idrolisi del farmaco è stata infatti osservata al saggio di idrolisi mediante MALDI-TOF MS. In un solo caso (ceppo di K. pneumoniae N°1135) è stato ottenuto un profilo anomalo in quanto presenti sia i picchi del farmaco intatto che quelli del farmaco idrolizzato. Per questo ceppo resistente ai tre carbapenemi saggiati, negativo ai saggi fenotipici per la presenza di carbapenemasi, è stata dimostrata la presenza del gene blaKPC mediante Real-Time PCR. Per questo ceppo si può ipotizzare la presenza di mutazioni a carico del gene blaKPC che sebbene non interferiscano con il suo rilevamento mediante PCR (Real-Time PCR positiva), potrebbero condizionare l’attività della proteina prodotta (Saggio di Hodge modificato e Test di Sinergia negativi) riducendone la funzionalità come dimostrato, mediante analisi MALDI-TOF MS, dalla presenza dei picchi relativi sia all’idrolisi del farmaco sia dei picchi relativi al farmaco intatto. Questa ipotesi dovrebbe essere confermata mediante sequenziamento del gene blaKPC e successiva analisi strutturale della sequenza amminoacidica deducibile. L’utilizzo della tecnologia MALDI-TOF MS per la verifica dell’avvenuta idrolisi del maropenem è risultato un saggio fenotipico indiretto in grado di distinguere, al pari del test di Hodge modificato impiegato comunemente nella routine diagnostica in microbiologia, un ceppo produttore di carbapenemasi da un ceppo non produttore sia per scopi diagnostici che per la sorveglianza epidemiologica. L’impiego del MALDI-TOF MS ha mostrato, infatti, diversi vantaggi rispetto ai metodi convenzionali (Saggio di Hodge modificato e Test di Sinergia) impiegati nella routine diagnostica di laboratorio i quali richiedono personale esperto per l’interpretazione del risultato e lunghi tempi di esecuzione e di conseguenza di refertazione. La semplicità e la facilità richieste per la preparazione dei campioni e l’immediata acquisizione dei dati rendono questa tecnica un metodo accurato e rapido. Inoltre, il metodo risulta conveniente dal punto di vista economico, con un costo totale stimato di 1,00 euro per ceppo analizzato. Tutte queste considerazioni pongono questa metodologia in posizione centrale in ambito microbiologico anche nel caso del rilevamento di ceppi produttori di carbapenemasi. Indipendentemente dall’approccio identificativo utilizzato, comparato con i metodi convenzionali il MALDI-TOF MS conferisce in molti casi un guadagno in termini di tempo di lavoro tecnico (procedura pre-analititca per la preparazione dei campioni) e di tempo di ottenimento dei risultati (procedura analitica automatizzata). Questo risparmio di tempo si accentua quando sono analizzati in contemporanea un maggior numero di isolati. Inoltre, la semplicità e la facilità richieste per la preparazione dei campioni e l’immediata acquisizione dei dati rendono questo un metodo di identificazione accurato e rapido risultando più conveniente anche dal punto di vista economico, con un costo totale di 0,50 euro (materiale consumabile) per ceppo analizzato. I risultati ottenuti dimostrano che la spettrometria di massa MALDI-TOF sta diventando uno strumento importante in microbiologia clinica e sperimentale, data l’elevata efficacia identificativa, grazie alla disponibilità sia di nuove banche dati commerciali sia di aggiornamenti delle stesse da parte di diversi utenti, e la possibilità di rilevare con successo anche se in modo indiretto le antibiotico-resistenze.

Interazione di nanoparticelle metalliche con menbrane biologiche: risultati di studi in vitro su cute, mucosa del cavo orale e meningi ed implicazioni per la salute

L’utilizzo di nanomateriali, ovvero una nuova classe di sostanze composte da particelle ultrafini con dimensioni comprese fra 1 e 100 nm (American Society for Testing Materials - ASTM), è in costante aumento a livello globale. La particolarità di tali sostanze è rappresentata da un alto rapporto tra la superficie e il volume delle particelle, che determina caratteristiche chimico-fisiche completamente differenti rispetto alle omologhe macrosostanze di riferimento. Tali caratteristiche sono tali da imporre una loro classificazione come nuovi agenti chimici (Royal Society & Royal Academy of Engineering report 2004). Gli impieghi attuali dei nanomateriali risultano in continua evoluzione, spaziando in diversi ambiti, dall’industria farmaceutica e cosmetica, all’industria tessile, elettronica, aerospaziale ed informatica. Diversi sono anche gli impieghi in campo biomedico; tra questi la diagnostica e la farmacoterapia. È quindi prevedibile che in futuro una quota sempre maggiore di lavoratori e consumatori risulteranno esposti a tali sostanze. Allo stato attuale non vi è una completa conoscenza degli effetti tossicologici ed ambientali di queste sostanze, pertanto, al fine di un loro utilizzo in totale sicurezza, risulta necessario capirne meglio l’impatto sulla salute, le vie di penetrazione nel corpo umano e il rischio per i lavoratori conseguente al loro utilizzo o lavorazione. La cute rappresenta la prima barriera nei confronti delle sostanze tossiche che possono entrare in contatto con l’organismo umano. Successivamente agli anni ‘60, quando si riteneva che la cute rappresentasse una barriera totalmente impermeabile, è stato dimostrato come essa presenti differenti gradi di permeabilità nei confronti di alcuni xenobiotici, dipendente dalle caratteristiche delle sostanze in esame, dal sito anatomico di penetrazione, dal grado di integrità della barriera stessa e dall’eventuale presenza di patologie della cute. La mucosa del cavo orale funge da primo filtro nei confronti delle sostanze che entrano in contatto con il tratto digestivo e può venir coinvolta in contaminazioni di superficie determinate da esposizioni occupazionali e/o ambientali. È noto che, rispetto alla cute, presenti una permeabilità all’acqua quattro volte maggiore, e, per tale motivo, è stata studiata come via di somministrazione di farmaci, ma, ad oggi, pochi sono gli studi che ne hanno valutato le caratteristiche di permeazione nei confronti delle nanoparticelle (NPs). Una terza importante barriera biologica è quella che ricopre il sistema nervoso centrale, essa è rappresentata da tre foglietti di tessuto connettivo, che assieme costituiscono le meningi. Questi tre foglietti rivestono completamente l’encefalo permettendone un isolamento, tradizionalmente ritenuto completo, nei confronti degli xenobiotici. L’unica via di assorbimento diretto, in questo contesto, è rappresentata dalla via intranasale. Essa permette un passaggio diretto di sostanze dall’epitelio olfattivo all’encefalo, eludendo la selettiva barriera emato-encefalica. Negli ultimi anni la letteratura scientifica si è arricchita di studi che hanno indagato le caratteristiche di assorbimento di farmaci attraverso questa via, ma pochissimi sono gli studi che hanno indagato la possibile penetrazione di nanoparticelle attraverso questa via, e nessuno, in particolar modo, ha indagato le caratteristiche di permeazione delle meningi. L’attività di ricerca svolta nell’ambito del presente dottorato ha avuto per finalità l’indagine delle caratteristiche di permeabilità e di assorbimento della cute, della mucosa del cavo orale e delle meningi nei confronti di alcune nanoparticelle, scelte fra quelle più rappresentative in relazione alla diffusione d’utilizzo a livello globale. I risultati degli esperimenti condotti hanno dimostrato, in vitro, che l’esposizione cutanea a Pt, Rh, Co3O4 e Ni NPs determinano permeazione in tracce dei medesimi metalli attraverso la cute, mentre per le TiO2 NPs tale permeazione non è stata dimostrata. È stato riscontrato, inoltre, che la mucosa del cavo orale e le meningi sono permeabili nei confronti dell’Ag in forma nanoparticellare.

Design and synthesis of new multitarget inhibitors of dengue virus replication

Attraverso una combinazione di virtual screening/virtual library generation abbiamo identificato una nuova serie di inibitori della replicazione del virus Dengue, attivi sia su un target virale (NS5) sia su uno cellulare (Src chinasi)

Nova técnica de julgamento de casos repetitivos à luz do novo Código de Processo Civil: o incidente de resolução de demandas repetitivas

A presente Tese analisa o incidente de resolução de demandas repetitivas. Trata-se de uma nova técnica de julgamento dos denominados processos de massa, instituída pelo Novo Código de Processo Civil. Inicialmente, procurou-se demonstrar o caminho trilhado pelo legislador brasileiro, por meio de sucessivas reformas ao Código de Processo Civil, no sentido de valorizar e tornar estável os precedentes dos Tribunais, em especial das Cortes de Superposição, chegando-se ao ápice de modificar, inclusive, a Constituição do Brasil, para esse fim. Também foi destacada a importância da uniformização de jurisprudência, que de certa maneira precedeu o novel instituto. Na sequência, apontou-se alguns aspectos relevantes, de ordem processual, do incidente, bem como os seus pressupostos de cabimento. Avaliou-se, ainda, um dos mais importantes efeitos que decorrem da admissibilidade do incidente de resolução de demandas repetitivas, no sentido de suspender os demais processos que veiculem idêntica tese jurídica e, também, como se defendeu ao longo do estudo, que guardem similitude de ordem fática. Ademais, especificou-se o procedimento de julgamento, fulcrado, principalmente, em uma notável ampliação do contraditório, que dá margem, inclusive, a que o acórdão prolatado nessa sede possa ser impugnado, via recurso especial e/ou extraordinário. Por fim, encerra-se com a análise do precedente resultante do incidente de resolução de demandas repetitivas. Explicita-se os seus efeitos, inclusive com a possibilidade de aplicação para o futuro, tendo em vista a objetivação do julgamento, voltado à definição de uma tese jurídica. No entanto, e aqui está a Tese defendida, a questão jurídica, ainda que julgada de modo abstrato, justamente para produzir efeitos mais amplos (aqui denominados expansivos), deve estar necessariamente atrelada às questões de fato que a envolvem.

Ação popular e ação de improbidade administrativa na justiça do trabalho

O presente estudo é resultado da observação de que, em que pese o incremento do ajuizamento de ações coletivas na Justiça do Trabalho, por meio de ações civis públicas, ainda há outras ações coletivas, destinadas à defesa de direitos metaindividuais, que não vêm recebendo o mesmo tratamento. Em especial, as ações cuja pretensão é a tutela dos atos da Administração Pública, que, no contexto do Estado Democrático de Direito, deve conduzir-se em prol do bem comum e, ainda, da garantia dos direitos sociais reconhecidos constitucionalmente. Analisa-se o cabimento dessa tutela pela via do Judiciário Trabalhista, nas situações em que os fatos constantes nas causas de pedir das respectivas ações sejam atinentes a direitos relacionados ao trabalho. Isso porque, na ocorrência de pontos de interseção entre o ato administrativo e as relações de trabalho, o ramo do Judiciário constitucionalmente vocacionado a analisá-los é o Trabalhista, já que o interesse em questão não configura mero ato administrativo, mas, além disso, revela o modo como o agente estatal compreende e orienta a sua conduta, gerando a valorização ou a desvalorização de direitos trabalhistas consagrados pela Constituição Federal. Com base nesse panorama acerca do papel do Estado brasileiro contemporâneo no que diz respeito à garantia de direitos sociais e do papel do Poder Judiciário no que tange à efetivação desses direitos, bem como procedendo ao exame da natureza desses direitos, que requerem novas posturas dos operadores do direito, este trabalho se propõe a afastar concepções antigas relacionadas a argumentos de suposta violação à separação de poderes e de indevida interferência em políticas públicas. Com isso, considerando que o Poder Judiciário tem no processo seu locus de manifestação, abordam-se as principais características do processo coletivo, visando à sua diferenciação em relação ao processo individual, em face da natureza dos direitos que compõem o seu objeto. Com o foco no fortalecimento do Judiciário Trabalhista e aperfeiçoamento do Estado Democrático de Direito, ingressa-se na seara das ações populares e de improbidade administrativa, refinando-se a aplicabilidade delas a atos praticados pela Administração Pública que repercutem na esfera trabalhista. Adota-se como premissa a nova conformação dos limites da competência da Justiça do Trabalho que não mais se restringe a lides de natureza individual ou coletiva entre trabalhadores e seus tomadores de serviço, conformação essa introduzida pela Emenda Constitucional no 45/2004 para defender-se que a consecução do bem comum, levada a efeito com a observância aos princípios regentes da Administração, desafia uma nova visão, especializada no valor social do trabalho, inclusive no que se refere à qualidade dos serviços públicos. As questões apontadas possibilitam concluir sobre a necessidade de se instituir concretamente os conteúdos axiológicos e não meramente patrimoniais que compõem o patrimônio público social, em especial o valor social do trabalho, preservando-o ou restituindo-o à coletividade, por meio de ações populares e de improbidade administrativa ajuizadas perante a Justiça do Trabalho. A pesquisa mostra que se alarga a garantia ao cidadão no que tange ao uso dos valores e recursos públicos para a promoção do bem comum e a evolução da coletividade.

Palermo, Italy, 1891 (Raster Image)

This layer is a georeferenced raster image of the historic paper map entitled: Nuova pianta della città di Palermo. It was published by Carlo Clausen, editore in 1891. Scale 1:10,000. Covers a portion of Palermo, Italy. Map in Italian.The image inside the map neatline is georeferenced to the surface of the earth and fit to the European Datum 1950, Universal Transverse Mercator (UTM) Zone 33N projected coordinate system. All map collar and inset information is also available as part of the raster image, including any inset maps, profiles, statistical tables, directories, text, illustrations, index maps, legends, or other information associated with the principal map. This map shows features such as roads, railroads and stations, drainage, built-up areas, selected buildings, parks, ground cover, shoreline features, and more. Includes index. Relief shown by shading.This layer is part of a selection of digitally scanned and georeferenced historic maps from the Harvard Map Collection. These maps typically portray both natural and manmade features. The selection represents a range of originators, ground condition dates, scales, and map purposes.

Genoa, Italy, 1910 (Raster Image)

This layer is a georeferenced raster image of the historic paper map entitled: Nuova pianta topografica della città e del porto di Genova : secondo gli ultimi lavori stradali con il percorso dei trams. It was published by A. P. Editore in 1910. Scale [ca. 1:7,000]. Covers Genoa, Italy. Map in Italian.The image inside the map neatline is georeferenced to the surface of the earth and fit to the European Datum 1950, Universal Transverse Mercator (UTM) Zone 32N projected coordinate system. All map collar and inset information is also available as part of the raster image, including any inset maps, profiles, statistical tables, directories, text, illustrations, index maps, legends, or other information associated with the principal map. This map shows features such as roads, railroads and stations, street railways, drainage, built-up areas and selected buildings, fortification, wharves, docks, gardens, and more. Relief shown by hachures.This layer is part of a selection of digitally scanned and georeferenced historic maps from the Harvard Map Collection. These maps typically portray both natural and manmade features. The selection represents a range of originators, ground condition dates, scales, and map purposes.

Rome, Italy, 1823 (Raster Image)

This layer is a georeferenced raster image of the historic paper map entitled: Nuova pianta di Roma Moderna, estratta dalla grande del Nolli corretta ed accresciuta de nomi delle contrade indicati al loro rispettivo sito in Roma; Pietro Ruga incise. It was published by Venanzio Monaldini Libraio e Cartolaro in 1823. Scale [ca. 1:9,120]. Covers Rome, Italy and Vatican City. The image inside the map neatline is georeferenced to the surface of the earth and fit to the "European Datum 1950 UTM Zone 33N" coordinate system. All map collar and inset information is also available as part of the raster image, including any inset maps, profiles, statistical tables, directories, text, illustrations, index maps, legends, or other information associated with the principal map. This map shows features such as roads, drainage, city districts, walls, gates, and fortifications, selected buildings, and more. Relief is shown by hachures. Includes index and inset plans: Pianta della Chiesa di S. Lorenzo fuori le mura -- Mausoleo di S. Costanza -- Pianta della Basilica di S. Paolo -- Pianta del Pantheon, degli avanzi delle Terme di Agrippa, e dé ruderi scoperti recentemente. This layer is part of a selection of digitally scanned and georeferenced historic maps from The Harvard Map Collection as part of the Imaging the Urban Environment project. Maps selected for this project represent major urban areas and cities of the world, at various time periods. These maps typically portray both natural and manmade features at a large scale. The selection represents a range of regions, originators, ground condition dates, scales, and purposes.

Design and Implementation of a Cloud-based Middleware for Persuasive Android Applications

Negli ultimi decenni, le tecnologie e i prodotti informatici sono diventati pervasivi e sono ora una parte essenziale delle nostre vite. Ogni giorno ci influenzano in maniera più o meno esplicita, cambiando il nostro modo di vivere e i nostri comportamenti più o meno intenzionalmente. Tuttavia, i computer non nacquero inizialmente per persuadere: essi furono costruiti per gestire, calcolare, immagazzinare e recuperare dati. Non appena i computer si sono spostati dai laboratori di ricerca alla vita di tutti i giorni, sono però diventati sempre più persuasivi. Questa area di ricerca è chiamata pesuasive technology o captology, anche definita come lo studio dei sistemi informatici interattivi progettati per cambiare le attitudini e le abitudini delle persone. Nonostante il successo crescente delle tecnologie persuasive, sembra esserci una mancanza di framework sia teorici che pratici, che possano aiutare gli sviluppatori di applicazioni mobili a costruire applicazioni in grado di persuadere effettivamente gli utenti finali. Tuttavia, il lavoro condotto dal Professor Helal e dal Professor Lee al Persuasive Laboratory all’interno dell’University of Florida tenta di colmare questa lacuna. Infatti, hanno proposto un modello di persuasione semplice ma efficace, il quale può essere usato in maniera intuitiva da ingegneri o specialisti informatici. Inoltre, il Professor Helal e il Professor Lee hanno anche sviluppato Cicero, un middleware per dispositivi Android basato sul loro precedente modello, il quale può essere usato in modo molto semplice e veloce dagli sviluppatori per creare applicazioni persuasive. Il mio lavoro al centro di questa tesi progettuale si concentra sull’analisi del middleware appena descritto e, successivamente, sui miglioramenti e ampliamenti portati ad esso. I più importanti sono una nuova architettura di sensing, una nuova struttura basata sul cloud e un nuovo protocollo che permette di creare applicazioni specifiche per smartwatch.

Individuazione del danno su ponti in muratura mediante misure dinamiche

La diagnostica strutturale è un campo in continuo sviluppo e attualmente sono numerosi gli studi tendenti alla definizione di tecniche e metodi in grado di fornire parametri che possano identificare, in modo sempre più accurato, lo stato di sicurezza di una struttura. Stato di sicurezza è un termine globale che si riferisce alla capacità portante di una struttura e alla sua resistenza alle sollecitazioni esterne, siano esse statiche o dinamiche. Per tanto, un qualsiasi danneggiamento strutturale potrebbe in varia misura influenzare tale stato. Per quanto riguarda i ponti stradali, negli ultimi anni l’attenzione è stata focalizzata allo studio di metodi di individuazione del danno a partire dai risultati ottenuti dal monitoraggio delle vibrazioni mediante accelerometri. Questo è stato possibile grazie agli avanzamenti raggiunti nell’identificazione modale e nei sensori per il monitoraggio strutturale. Questo lavoro si pone come obiettivo quello di proporre una nuova metodologia di analisi dei dati ottenuti da indagini sperimentali che possono essere svolte in sito. La definizione di tale metodologia è affidata a simulazioni numeriche volte a rappresentare stati di danneggiamento avanzati su elementi strutturali. In una prima fase verranno analizzati elementi semplificati rappresentativi di strutture esistenti, come ad esempio travi da ponte in calcestruzzo armato. In una seconda fase, il metodo verrà testato su modelli più complessi che tengano conto della tridimensionalità del problema, oltre alle variazioni sezionali e di materiali degli elementi che lo compongono.

HTML5, Javascript and modern browser technologies: toward a web based framework for device fingerprinting

Mentre navighiamo siamo veramente certi che i nostri dati e la nostra privacy siano al sicuro? I browser e le tecnologie di cui fanno uso possono rivelare una miriade di informazioni. Al crescere delle informazioni reperibili, si inizia a superare una massa critica che può permettere l'identificazione. Il device fingerprinting è proprio il rilevamento di questa tipologia di dati. HTML5 e le nuove API che esso mette a disposizione aumentano a dismisura le modalità per fare fingerprinting. Durante lo sviluppo della presente tesi è stato realizzato un framework molto potente che verrà mostrato nel dettaglio. Come a seguito di un disastro aereo, l'ingegneria aeronautica si mette all'opera per scovare i punti deboli allo scopo di rendere più robusti gli aerei di nuova generazione, noi con la presente tesi vogliamo dare il nostro contributo al miglioramento del web del futuro. Affinchè la nostra privacy sia veramente nelle nostre mani e possiamo essere artefici del nostro domani.

Modello di simulazione del processo di gestione ordini e di outbound in linguaggio Arena

La tesi ha l'obiettivo di analizzare e tradurre in un modello di simulazione il processo di evasione di ordini dal sito di stoccaggio di un’azienda di e-commerce al fine di valutarne le possibili evoluzioni. In prima analisi sono stati evidenziati i principali motivi che spingono i clienti a preferire gli store online rispetto a quelli fisici e come alcuni dei vantaggi siano il frutto dell’efficienza della gestione dell’outbound. Si è passati, quindi, all’esame del caso di studio, alla scomposizione delle singole fasi di lavorazione degli ordini e alla loro traduzione in linguaggio Arena. Il modello ottenuto è stato valutato grazie alla comparazione dei risultati di statistiche automatiche e manuali, frutto della simulazione, con i dati reali. La fase finale ha riguardato, invece, la valutazione in termini di efficienza di una possibile evoluzione del sistema che consiste nell’introduzione di un robot addetto al packing: il modello è stato modificato e le statistiche del caso as-is sono state confrontate con quelle frutto della nuova simulazione. Con i dati utilizzati è stato dimostrato come un unico robot garantisca prestazioni superiori rispetto allo stato attuale e risulti più che sufficiente per la mole di lavoro di una giornata tipo. Nei periodi dell’anno caratterizzati da un aumento esponenziale degli acquisti, tuttavia, potrebbe essere necessario affiancare alla soluzione automatica quella manuale.

Equity crowdfunding: analisi finanziaria della piattaforma Crowdcube

La crescente difficoltà di accesso ai canali tradizionali ha spinto le start-up e le PMI a ricercare soluzioni alternative di finanziamento al fine di trovare le risorse economiche necessarie per la loro crescita e il loro sviluppo. Una nuova opportunità che sta emergendo negli ultimi anni è l’equity-based crowdfunding. La tesi si pone l’obiettivo di ottenere indicazioni sulla profittabilità previsionale delle imprese e dei singoli individui che ricorrono all’equity crowdfunding. Per ricercare queste informazioni è stata svolta un’analisi empirica selezionando un campione di 100 progetti dalla piattaforma britannica Crowdcube. Quella svolta è una analisi finanziaria implementata utilizzando i dati previsionali contenuti nel piano economico-finanziario dei progetti presi come campione.