DPS-Like Peroxide Resistance Protein: Structural and Functional Studies on a Versatile Nanocontainer

Oxidative stress is a constant threat to almost all organisms. It damages a number of biomolecules and leads to the disruption of many crucial cellular functions. It is caused by reactive oxygen species (ROS), such as hydrogen peroxide (H2O₂), superoxide (•O₂ -), and hydroxyl radical (•OH). The most harmful of these compounds is •OH, which is only formed in cells in the presence of redox-cycling transition metals, such as iron and copper. Bacteria have developed a number of mechanisms to cope with ROS. One of the most widespread means employed by bacteria is the DNA-binding proteins from starved cells (Dps). Dps proteins protect the cells by binding and oxidizing Fe2+, thus greatly reducing the production of •OH. The oxidized iron is stored inside the protein as an iron core. In addition, Dps proteins bind directly to DNA forming a protective coating that shields DNA from harmful agents. Moreover, Dps proteins have been found to elicit other protective functions in cells and to participate in bacterial virulence. Dps proteins are of special importance to Streptococci owing to the lack of catalase in this genus of bacteria.This study was focused on structural and functional characterization of streptococcal Dpslike peroxide resistance (Dpr) proteins. Initially, crystal structures of Streptococcus pyogenes Dpr were determined. The data confirmed the presence of a di-metal ferroxidase center (FOC) in Dpr proteins and revealed the presence of a novel N-terminal helix as well as a surface metal-binding site. The crystal structures of Streptococcus suis Dpr complexed with transition metals demonstrated the metal specificity of the FOC. Solution binding studies also indicated the presence of a di-metal FOC. These results suggested a possible role for Dpr in the detoxification of various metals. Iron was found to mineralize inside the protein as ferrihydrite based on X-ray absorption spectroscopy data. The iron core was found to exhibit clear superparamagnetic behaviour using magnetic and Mössbauer measurements. The results from this study are expected to further increase our understanding on the binding, oxidation, and mineralization of iron and other metals in Dpr proteins. In particular, the structural and magnetic properties of the iron core can form a basis for potential new applications in nanotechnology. From the streptococcal viewpoint, the results would help in understanding better the complicated picture of bacterial pathogenesis. Dpr proteins may also provide a novel target for drug design due to their tight involvement in bacterial virulence.

Swine manure post-treatment technologies for pathogenic organism inactivation

Swine manure agricultural use is a common practice in Brazil. Their physic-chemical characteristics favor its use as biofertilizer, but the presence of pathogens may become a risk to human health. This research presents a qualitative study of the main alternatives of pig manure disinfection, analyzing efficiency, advantages and limitations of each procedure. The disinfection studies reported in literature are based on the following treatments: alkaline, thermal, biological, chemical, and physical. The greater efficiencies are in thermal treatment (> 4 log: 60 °C), chemical treatment (3 to 4 log: 30mg Cl- L-1; 3 to 4 log: 40 mg O3 L-1) and physical treatment (3 a 4 log: 220 mJ UV radiation cm-2). The biological treatment (anaerobiosis) also promotes the pathogen reduction of swine manure, however with lower efficiency (1 to 2 log). The selection of the treatment should consider: implementation and operation cost, necessity of preliminary treatment, efficiency obtained and destination of the treated manure (agricultural use, water reuse). Brazilian regulation does not have specific guidelines for the microbiological quality of animal production effluents that is very important to be considered due to confined animal feeding operation transformation in the last years in the country.

Freqüência de infecção pelo Mycoplasma hominis e Ureaplasma urealyticum em mulheres inférteis e relação com repercussões clínicas

OBJETIVOS: determinar a freqüência de infecção pelo Mycoplasma hominis e Ureaplasma urealyticum e relacioná-la a variáveis clínicas de mulheres inférteis. MÉTODOS: estudo transversal com 322 pacientes inférteis submetidas à coleta de swab endocervical para pesquisa de Mycoplasma hominis e Ureaplasma urealyticum, de outubro de 2002 a maio de 2004. Todas as pacientes foram submetidas a protocolo básico de investigação clínica e laboratorial da infertilidade. Como controle, utilizou-se série histórica de 51 mulheres não gestantes, previamente pesquisadas quanto aos agentes infecciosos estudados. RESULTADOS: a freqüência de infecção pelo Mycoplasma hominis e Ureaplasma urealyticum foi de 4,9% nas pacientes inférteis e 13,8% no grupo controle. Entre as pacientes inférteis observou-se relação entre a presença dos dois patógenos e alterações no resultado da histerossalpingografia (OR: 3,20; IC 95%: 1,05-9,73), presença de dispareunia (OR: 10,72; IC 95%: 3,21-35,77) e corrimento vaginal (OR: 8,5; IC 95%: 2,83-26,02), além de cultura endocervical positiva para Escherichia coli (OR: 16,09; IC 95%: 4,95-52,25). CONCLUSÃO: a taxa de infecção pelo Mycoplasma hominis e Ureaplasma urealyticum é baixa em pacientes inférteis e está associada a seqüelas reprodutivas tardias.

Ultrastructural observation of the airways of recovered and susceptible pigs after inoculation with Mycoplasma hyopneumoniae

To determine the morphological differences in the epithelium of the airways of recovered and susceptible pigs after Mycoplasma hyopneumoniae challenge, twenty-four 4-week-old M. hyopneumoniae-free pigs were intratracheally inoculated with 107ccu/ml of a pure low-passaged culture of the P5722-3 strain of M. hyopneumoniae challenge material. Eight pigs (group I) were challenged at the beginning of the experiment and rechallenged 3 months later. Group II pigs were also challenged at the beginning of the experiment and necropsied 3 months later. Group III pigs were challenged at the same time as the rechallenge of group I pigs. Eight nonchallenged pigs served as controls (group IV). Three days after the second challenge of group I and the first challenge of group III, and every 3 and 4 days thereafter, two pigs from each group were euthanatized by electrocution and necropsied. Samples of bronchi and lung tissue were examined using light and electron microscopy (SEM and TEM). Macroscopic lesions were observed in the lungs of all group III pigs (average = 4.74%) and were characterized by purple-red areas of discoloration and increased firmness affecting the cranioventral aspect of the lungs. Macroscopic lesions of pneumonia in groups I and II were minimal (less than 1%). There were no gross lesions of pneumonia in control (group IV) pigs. Microscopic lesions were characterized by hyperplasia of the peribronchial lymphoid tissue and mild neutrophilic infiltrates in alveoli. Electron microscopy showed patchy areas with loss of cilia and presence of leukocytes and mycoplasmas in bronchi of susceptible pigs (group III). The bronchial epithelium of rechallenged (group I), recovered (group II), and control (group IV) pigs was ultrastructurally similar indicating recovery of the former two groups. Although mycoplasmas were seen among cilia, a second challenge on pigs of group I did not produce another episode of the disease nor did it enhance morphological changes, suggesting that those pigs could become carriers of M. hyopneumoniae.

Mastite bovina por Mycoplasma bovis em rebanhos leiteiros

Foram examinadas 713 vacas de três rebanhos leiteiros localizados na região norte do Estado do Paraná e sudoeste do Estado de São Paulo, das quais 137 apresentaram mastite. Nas três propriedades foram detectados oito animais (1,12%) com mastite clínica por Mycoplasma bovis. Destes animais, quatro tratados com oxitetraciclina e tilosina e três com enrofloxacina, não responderam ao tratamento e foram descartados no decorrer da lactação. Uma vaca medicada com enrofloxacina recuperou quase que totalmente a secreção láctea mas a eliminação de M. bovis persistiu por toda lactação. Esta vaca apresentou cura bacteriológica na lactação seguinte. O descarte dos animais positivos, monitora-mento bacteriológico e a aplicação correta das medidas de prevenção para as mastites contagiosas controlaram a disseminação de M. bovis nos rebanhos.

Animal infections by vaccinia-like viruses in the state of Rio de Janeiro: an expanding disease

In the present study we investigated the presence of infections by vaccinia-like viruses in dairy cattle from 12 counties in the state of Rio de Janeiro in the last 9 years. Clinical specimens were collected from adult animals with vesicular/pustular lesions mainly in the udder and teats, and from calves with lesions around the nose and mouth. A plaque reduction neutralization test (PRNT) was applied to search for antibodies to Orthopoxvirus; the vesicular/pustular fluids and scabs were examined by PCR, electron microscopy (EM) and by inoculation in VERO cells for virus isolation. Antibodies to Orthopoxvirus were detected in most cases. The PCR test indicated a high nucleotide homology among the isolates and the vaccinia viruses (VACV) used as controls. By EM, typical orthopoxvirus particles were observed in some specimens. The agents isolated in tissue culture were confirmed as vaccinia-like viruses by EM and PCR. The HA gene of the vaccinia-like Cantagalo/IOC virus isolated in our laboratory was sequenced and compared with other vaccinia-like isolates, showing high homology with the original Cantagalo strain, both strains isolated in 1999 from dairy cattle. Antibodies to Orthopoxvirus were detected in one wild rodent (genus Akodon sp.) collected in the northwestern region of the state, indicating the circulation of poxvirus in this area. Nonetheless, PCR applied to tissue samples collected from the wild rodents were negative. Vesicular/pustular lesions in people in close contact with animals have been also recorded. Thus, the vaccinia-like virus infections in cattle and humans in the state seem to be an expanding condition, resulting in economic losses to dairy herds and leading to transient incapacitating human disease. Therefore, a possible immunization of the dairy cattle in the state should be carefully evaluated.

Epidemiological survey on Mycoplasma gallisepticum and M. synoviae by multiplex PCR in commercial poultry

Mycoplasmas are important avian pathogens, which cause respiratory and joint diseases that result in large economic losses in Brazilian and world-wide poultry industry. This investigation regarding the main species of mycoplasmas, Mycoplasma gallisepticum (MG) and M. synoviae (MS), responsible for the above mentioned conditions, was carried out through PCR Multiplex analysis. One thousand and forty-six (1,046) samples of tracheal swabs and piped embryos were collected from 33 farms with laying hens, breeders, broilers or hatchery, located in the Brazilian states of São Paulo, Paraná and Pernambuco, where respiratory problems or drops in egg production had occurred. The MG and MS prevalence on the farms was 72.7%. These results indicated (1) high dissemination of mycoplasmas in the evaluated farms, with predominance of MS, either as single infectious agent or associated with other mycoplasmas in 20 farms (60.6%), and (2) an increase of MS and decrease of MG infection in Brazilian commercial poultry.

Detecção do Grupo Mycoplasma mycoides por imunoperoxidase indireta (IPI) e PCR-REA em conduto auditivo de bovinos

O Grupo Mycoplasma mycoides (GMM) foi diagnosticado por PCR-REA e imunoperoxidase indireta (IPI) em amostras de lavados de conduto auditivo de bovinos no Estado do Rio de Janeiro, Brasil. 60 bovinos foram selecionados aleatoriamente. As lavagens foram feitas com uso de seringas estéreis contendo um volume de 60 mL de solução salina tamponada (PBS pH 7.2). As amostras obtidas foram estocadas em glicerol (1:2) e congeladas a 20ºC até uso. Estas amostras foram diluídas até 10-5 e repicadas em meio Hayflick modificado, sólido e líquido, sendo incubados a 37ºC por 48-72 horas. As placas foram mantidas em microaerofilia e observadas diariamente, para visualização das colônias típicas em “ovo-frito”. Das 60 amostras cultivadas, 48 (80,00%) foram positivas para Mycoplasma spp. A prevalência obtida para o GMM na IPI foi de 20,0% (12/60) enquanto na PCR-REA foi de 41,7% (25/60). Das cepas tipificadas pela IPI 58,3% (7/12) foram M. mycoides subsp. mycoides LC e 41,7% (5/12) foram M. capricolum. Na PCR-REA o grupo M. mycoides foi confirmado pela visualização de um amplicon de 785bp, compatível com este grupo. O valor encontrado no teste Kappa para associação entre estes testes foi de 0,14 (P>0,05. Na clivagem do produto da PCR com a enzima de restrição AluI, de cepas de referências e dos isolados de ouvido os fragmentos obtidos foram de 81, 98, 186 e 236pb, mas não de 370pb, que é específica para o agente da Pleuropneumonia Contagiosa Bovina. A presença de espécies de micoplasmas no conduto auditivo de bovinos assintomáticos representa um risco para propagação de Mycoplasma spp. entre rebanhos bovinos no Brasil.

Associação entre Mycoplasma spp. e ácaros do conduto auditivo de bovinos

Esse estudo foi realizado com o objetivo de verificar a associação entre micoplasmas e ácaros (Raillietia auris e R. flechtmanni) no conduto auditivo de bovinos. Foram realizadas lavagens no conduto auditivo externo de 60 bovinos abatidos no Estado do Rio de Janeiro, Brasil. Para a lavagem dos condutos auditivos foi utilizada solução salina tamponada (PBS, pH 7.2) em seringas estéreis de 60mL. Para o isolamento de micoplasmas foram utilizados pools de ácaros por animal, lavados sucessivamente em 1mL de meio Hayflick modificado. Os lavados dos ácaros foram diluídos de 10-1 até 10-5 e repicados em meio Hayflick modificado, sólido e líquido e incubados a 37°C por 48-72 horas em microaerofilia. A identificação das espécies de micoplasmas foi realizada pelo teste da imunoperoxidase indireta (IPI). Verificou-se alta prevalência de ácaros do gênero Raillietia spp. 76,7% (46/60). O parasitismo por ácaros e micoplasmas foi verificado em 40 animais (74,1%), sendo esta associação significativa (p<0,001). Dos ácaros processados para isolamento de micoplasmas, 193 foram fêmeas e 25 machos. A frequência de Mycoplasma em Raillietia spp. foi de 81,2% (177/218) (p<0.001). Das fêmeas identificadas, 52,3% (101/193) foram R. auris e 47,7% (92/193) R. flechtmanni. A frequência de Mycoplasma nas fêmeas de R. auris foi de 75,2% (76/101) e na espécie R. flechtmanni foi de 88% (81/92) (P<0.05). As espécies de micoplasmas tipificadas pela IPI nos ácaros Raillietia auris foram: M. alkalescens 6,9%, M. arginini 3,4%, M. bovirhinis 9,2%, M. conjunctivae 18,4%, M. mycoides mycoides LC 8,0%, M. capricolum 5,7%. Em R. flechtmanni as espécies de micoplasmas identificadas foram: M. alkalescens 12,2%, M. arginini 1,0%, M. bovirhinis 18,9%, M. bovis 2,2%, M. conjunctivae 21,0%, M. mycoides mycoides LC 11,0% e M. capricolum 4,4%. As espécies de micoplasmas identificadas no conduto auditivo externo dos bovinos foram as mesmas presentes nos ácaros R. auris e R. flechtmanni. Os resultados confirmam que o conduto auditivo externo de bovinos é um habitat de Mycoplasma spp., incluindo espécies potencialmente patogênicas para os rebanhos, além dos ácaros R. auris e R. flechtmanni estarem associados com esses molicutes carreando-os em seu organismo.

Mycoplasma gallisepticum como fator de risco no peso de lotes de frangos de corte com condenação por aerossaculite na Inspeção Sanitária Federal

A Indústria avícola brasileira cresce anualmente e se torna cada vez mais representativa na produção e exportação dos seus produtos. Os cuidados com a sanidade avícola têm acompanhado e favorecido essa evolução, entretanto, agentes respiratórios que afetam o peso e a qualidade da carcaça, continuam a provocar grandes prejuízos à produção avícola. A aerossaculite é considerada uma das principais causas da condenação total e/ou parcial de carcaças de frangos de corte, sendo de grande importância Mycoplasma gallisepticum (MG). O objetivo do presente estudo foi detectar MG pela PCR e correlacionar sua positividade a aerossaculite, queda de peso e condenação de carcaças de lotes de frangos de corte na Inspeção Sanitária Federal. Do total de 40 lotes de frangos de corte abatidos sob Inspeção Sanitária Federal, localizado no Estado do Rio Grande do Sul, Brasil, foram selecionados ao acaso. Em cada lote, três frangos de corte, independente de sexo, foram randomicamente selecionados para necropsia, sendo as traquéias coletadas e agrupadas em pool para formação de uma amostra para análise. Pela PCR, o DNA foi extraído pelo método de fenol-clorofórmio e amplificado com pares de "primers" específicos para MG. Dos 40 lotes analisados pela PCR, 20% (8/40) foram positivos para MG. Houve relação entre a positividade para MG, aumento da taxa de aerossaculite e queda de peso por Regressão Logística Múltipla (p<0,05), LogitPi= 7,9409 + (0,5601 x X1) - (3,3080 x X2). O aumento da taxa de aerossaculite esteve relacionada à queda de peso por Regressão Linear Simples (p<0,05), Y= 2, 1050-0,6397X. Em conclusão, a positividade por MG está relacionada à aerossaculite que provoca queda de peso em frangos de corte. Em adição, a PCR foi uma técnica eficaz para a detecção de MG em lotes de frangos de corte, não sendo este diagnóstico influenciado pelo tipo de colheita do material biológico, por escarificado ou swab de traquéia.

Características clínicas e anatomo-histopatologicas da infecção experimental mista por Orthoreovirus aviario e Mycoplasma synoviae em frangos de corte

A artrite infecciosa em frangos de corte representa um problema sanitário e econômico de grande impacto, provocando perdas de produtividade e nos processos de produção e industrialização. Os principais agentes etiológicos associados aos casos de artrites e tenossinovites infecciosas em aves são Mycoplasma synoviae (MS) e Orthoreovirus aviario (ARV). Esse trabalho propôs investigar as alterações anatomohistopatológicas causadas pela infecção experimental concomitante por Mycoplasma synoviae e Orthoreovirus aviario em frangos de corte e confirmar a presença dos agentes através das técnicas de PCR e imuno-luorescência indireta (RIFI). Para tal foram utilizados 16 frangos de corte, alojados em cama, com fornecimento de ração e água ad libitum. A infecção experimental foi realizada utilizando amostras atenuadas de MS e de ARV. Clinicamente as aves inoculadas apresentaram apatia e edemaciação da região da articulação tíbiotársica. Após 30 dias procedeu-se a eutanásia e a necropsia das aves. Na análise histopatológica constatou-se o efeito da infecção mista com MS e ARV sobre os diferentes órgãos/tecidos. Todos os animais apresentaram quadro de artrite e tenossinovite caracterizado pela presença de infiltrado inflamatório linfohistiocitário difuso, com acúmulo de heterófilos na cápsula articular/membrana sinovial e tendão flexor digital. Além disso, foi possível observar infiltrado inflamatório na traquéia, nos pulmões e sacos aéreos, no fígado, baço, pericárdio e proventrículo. A utilização da RIFI foi necessária para visualizar a presença de ambos os agentes nas articulações, identificando a presença de antígenos do ARV e do MS. A técnica de PCR constatou positividade do MS na traquéia, pulmões/sacos aéreos, cápsula articular/membrana sinovial e liquido sinovial. Já para o ARV a PCR foi positiva em amostras de fígado, baço, cápsula articular/membrana sinovial e tendão flexor digital. Com base nas lesões observadas e nos dados da literatura, sugere-se a ação concomitante por MS e ARV nos diferentes tecidos.

Nested-PCR for the detection of Mycoplasma hyopneumoniae in bronchial alveolar swabs, frozen tissues and formalin-fixed paraffin-embedded swine lung samples: comparative evaluation with immunohistochemical findings and histological features

The diagnosis of Mycoplasma hyopneumoniae infection is often performed through histopathology, immunohistochemistry (IHC) and polymerase chain reaction (PCR) or a combination of these techniques. PCR can be performed on samples using several conservation methods, including swabs, frozen tissue or formalin-fixed and paraffin-embedded (FFPE) tissue. However, the formalin fixation process often inhibits DNA amplification. To evaluate whether M. hyopneumoniae DNA could be recovered from FFPE tissues, 15 lungs with cranioventral consolidation lesions were collected in a slaughterhouse from swine bred in herds with respiratory disease. Bronchial swabs and fresh lung tissue were collected, and a fragment of the corresponding lung section was placed in neutral buffered formalin for 48 hours. A PCR assay was performed to compare FFPE tissue samples with samples that were only refrigerated (bronchial swabs) or frozen (tissue pieces). M. hyopneumoniae was detected by PCR in all 15 samples of the swab and frozen tissue, while it was detected in only 11 of the 15 FFPE samples. Histological features of M. hyopneumoniae infection were presented in 11 cases and 7 of these samples stained positive in IHC. Concordance between the histological features and detection results was observed in 13 of the FFPE tissue samples. PCR was the most sensitive technique. Comparison of different sample conservation methods indicated that it is possible to detect M. hyopneumoniae from FFPE tissue. It is important to conduct further research using archived material because the efficiency of PCR could be compromised under these conditions.