Identification et caractérisation de gènes chez Salmonella enterica sérovar Typhi impliqués dans l’interaction avec les macrophages humains.

Le genre bactérien Salmonella regroupe plus de 2500 sérovars, mais peu sont responsables de pathologies humaines. Salmonella enterica sérovar Typhi (S. Typhi) est reconnu pour son importance médicale à travers le globe. S. Typhi cause la fièvre typhoïde chez l’Homme, une maladie infectieuse létale caractérisée par la dissémination systémique de la bactérie vers des organes du système réticulo-endothélial. La fièvre typhoïde représente un fardeau pour la santé mondiale, notamment auprès des pays en développement où les conditions sanitaires sont désuètes. La situation se complique davantage par l’apparition de souches résistantes aux antibiotiques. De plus, les deux vaccins licenciés sont d’efficacité modérée, présentent certaines contraintes techniques et ne sont pas appropriés pour les jeunes enfants et nourrissons. La phase systémique de l’infection par Salmonella repose sur sa survie dans les macrophages du système immunitaire. Dans ce compartiment intracellulaire, la bactérie module les défenses antimicrobiennes grâce à de multiples facteurs de virulence encodés dans son génome. Les mécanismes moléculaires sollicités sont complexes et finement régulés. Malgré les progrès scientifiques réalisés précédemment, plusieurs incompréhensions persistent au sujet de l’adaptation de ce pathogène dans les macrophages de l’hôte. Pour mieux concevoir les déterminants génétiques de S. Typhi impliqués dans l’interaction avec ces cellules, une stratégie de sélection négative a été appliquée afin de vérifier systématiquement l’effet direct des gènes pendant l’infection. En premier temps, une librairie de mutants par transposon chez S. Typhi a été créée pour l’infection de macrophages humains en culture. Après 24 heures d’infection, la présence des mutants fut évaluée simultanément par analyse sur des biopuces de Salmonella. Au total, 130 gènes ont été sélectionnés pour leur contribution potentielle auprès des macrophages infectés. Ces gènes comptaient des composantes d’enveloppe bactérienne, des éléments fimbriaires, des portions du flagelle, des régulateurs, des facteurs de pathogenèse et plusieurs protéines sans fonction connue. En deuxième temps, cette collection de gènes a dirigé la création de 28 mutants de délétion définie chez S. Typhi. Les capacités d’entrée et de réplication intracellulaire de ces mutants au sein des macrophages humains ont été caractérisées. D’abord, les macrophages ont été co-infectés avec les mutants en présence de la souche sauvage, pour vérifier la compétitivité de chacun d’eux envers cette dernière. Ensuite, les mutants ont été inoculés individuellement chez les macrophages et leur infectivité fut mesurée comparativement à celle de la souche sauvage. Sommairement, 26 mutants ont présenté des défauts lorsqu’en compétition, tandis que 14 mutants se sont montrés défectueux lorsque testés seuls. Par ailleurs, 12 mutants ont exposé une déficience lors de l’infection mixte et individuelle, incluant les mutants acrA, exbDB, flhCD, fliC, gppA, mlc, pgtE, typA, waaQGP, STY1867-68, STY2346 et SPI-4. Notamment, 35 nouveaux phénotypes défectueux d’entrée ou de survie intracellulaire chez Salmonella ont été révélés par cette étude. Les données générées ici offrent plusieurs nouvelles pistes pour élucider comment S. Typhi manipule sa niche intracellulaire, menant à l’infection systémique. Les gènes décrits représentent des cibles potentielles pour atténuer la bactérie chez l’humain et pourraient contribuer au développement de meilleures souches vaccinales pour immuniser contre la fièvre typhoïde.

Étude de l’expression de « Bcl-2 modifying factor » (Bmf) et son implication dans la néphropathie diabétique

Objectif : Étudier les mécanismes apoptotiques impliqués dans la néphropathie diabétique en identifiant les gènes responsables de l’apoptose et activés par les espèces réactives de l’oxygène (ROS) dans les cellules de tubules proximaux rénaux (RPTC) de différents modèles diabétiques. Méthodes : Une hybridation par puce à AND a été réalisée sur les ARN extraits à partir de RPTC de souris heterozygotes db/m+, db/db and db/db catalase (CAT)-transgénique (Tg) de 20 semaines. Des expériences de PCR en temps réel et d’immunohistochimie réalisées sur ces modèles et sur le modèle ou le diabète avait été induit par traitement au streptozotocin (STZ) ont permis de valider les gènes apoptotiques identifiés par puce à ADN. Des RPTC immortalisées de rat ont été utilisées pour montrer l’activité de ces gènes apoptotique et la régulation de leur expression. De plus, une étude additionnelle réalisée sur des sections rénales provenant de patients diabétiques et non diabétiques a démontré également une surexpression de ces gènes apoptotiques dans les IRPTC. Résultats: L’expression de Bcl-2-modifying factor (Bmf), une protéine apoptotique, semble augmentée dans les RPTC de souris db/db comparé aux souris contrôles db/m+, ou aux souris db/db CAT-tg. La surexpression de Bmf a également été identifiée dans les RPTC du modèle diabétique STZ. La normalisation de l’hyperglycémie chez ces souris par traitement à l’insuline semble normaliser également l’expression de Bmf. In vitro, la surexpression du cDNA de Bmf dans les RPTC promouvoit l’apoptose et augmente l’activité de caspase 3. La stimulation de RPTC de Rat avec le glucose élevé (25mM de D-glucose) semble augmenter l’expression de Bmf et le traitement de ces cellules avec la roténone, les Diphénylène iodonium, la catalase et l’apocynine semble renverser cette stimulation. L’inhibition de Bmf avec un siRNA semble réduire l’apoptose induite par le glucose élevé. L’expression de Bmf a également été démontrée dans les RPTC de patients diabétiques. Conclusion: Ces résultats ont démontré une surexpression de Bmf dans les RPTC de différents modèles diabétiques et suggèrent son potentiel rôle dans la régulation de l’apoptose et de l’atrophie tubulaire chez les diabétiques.

Differential regulation of early response genes by fibroblast growth factor (FGF) 8 and FGF18 in bovine granulosa cells in vitro

Les « Facteurs de croissance des fibroblastes» (FGF) agissent comme des régulateurs locaux sur la qualité des follicules et sont connus pour promouvoir la prolifération des cellules de granulosa, réduire l’apoptose et la stéroïdogenèse. Parmi la sous-famille FGF8, FGF18 est une exception puisqu’il semblerait avoir une fonction pro-apoptotique alors que FGF8 n’a pas été jusqu’à présent rapporté comme altérant la viabilité des cellules de la granulosa. Ces deux ligands ont un mode d’activation similaire et il pourrait être proposé que toute la sous-famille FGF8 ait la même réponse. L’objectif de cette étude était de déterminer si FGF8 et FGF18 activaient la même réponse précoce de gènes dans des cultures de granulosa bovine. Pour répondre à cette question, nous avons cultivé des cellules de la granulosa dans du milieu de culture sans sérum pendant 5 jours. Le jour 5, les cellules ont été traitées avec FGF8 ou FGF18. Nous avons eu recours à une approche de « puce à ADN » afin d’identifier la réponse précoce de gènes induite par FGF8 et FGF18, et les données ont été confirmées par des PCRs en temps réel lors d’une expérience in vitro où les cellules de granulosa ont été traitées avec FGF8 et FGF18 pendant différents temps. L’analyse du puce à ADN a identifié 12 gènes surexprimés par FGF8, incluant SPRY2, NR4A1, XIRP1, BAMBI, EGR1, FOS et FOSL1. A l’inverse, FGF18 n’a régulé aucun gène de manière significative. Les analyses de PCR ont confirmé l’augmentation d’ARNm codant pour EGR1, EGR3, FOS, XIRP1, FOSL1, SPRY2, NR4A1 et BAMBI après 2 h de traitement. FGF18 a entrainé seulement une augmentation de l’expression de EGR1 après 2 h de traitement parmi tous les gènes testés. Ces résultats démontrent donc que FGF8 et FGF18, malgré leur similarité dans le mode d’activation de leurs récepteurs, agissent sur les cellules de la granulosa via différentes voies de signalisation. FGF8 et FGF18, sont donc tous les deux capables de stimuler l’expression de EGR1, mais les voies de signalisation induites par la suite divergent.

Approches bio-informatiques appliquées aux technologies émergentes en génomique

Les études génétiques, telles que les études de liaison ou d’association, ont permis d’acquérir une plus grande connaissance sur l’étiologie de plusieurs maladies affectant les populations humaines. Même si une dizaine de milliers d’études génétiques ont été réalisées sur des centaines de maladies ou autres traits, une grande partie de leur héritabilité reste inexpliquée. Depuis une dizaine d’années, plusieurs percées dans le domaine de la génomique ont été réalisées. Par exemple, l’utilisation des micropuces d’hybridation génomique comparative à haute densité a permis de démontrer l’existence à grande échelle des variations et des polymorphismes en nombre de copies. Ces derniers sont maintenant détectables à l’aide de micropuce d’ADN ou du séquençage à haut débit. De plus, des études récentes utilisant le séquençage à haut débit ont permis de démontrer que la majorité des variations présentes dans l’exome d’un individu étaient rares ou même propres à cet individu. Ceci a permis la conception d’une nouvelle micropuce d’ADN permettant de déterminer rapidement et à faible coût le génotype de plusieurs milliers de variations rares pour un grand ensemble d’individus à la fois. Dans ce contexte, l’objectif général de cette thèse vise le développement de nouvelles méthodologies et de nouveaux outils bio-informatiques de haute performance permettant la détection, à de hauts critères de qualité, des variations en nombre de copies et des variations nucléotidiques rares dans le cadre d’études génétiques. Ces avancées permettront, à long terme, d’expliquer une plus grande partie de l’héritabilité manquante des traits complexes, poussant ainsi l’avancement des connaissances sur l’étiologie de ces derniers. Un algorithme permettant le partitionnement des polymorphismes en nombre de copies a donc été conçu, rendant possible l’utilisation de ces variations structurales dans le cadre d’étude de liaison génétique sur données familiales. Ensuite, une étude exploratoire a permis de caractériser les différents problèmes associés aux études génétiques utilisant des variations en nombre de copies rares sur des individus non reliés. Cette étude a été réalisée avec la collaboration du Wellcome Trust Centre for Human Genetics de l’University of Oxford. Par la suite, une comparaison de la performance des algorithmes de génotypage lors de leur utilisation avec une nouvelle micropuce d’ADN contenant une majorité de marqueurs rares a été réalisée. Finalement, un outil bio-informatique permettant de filtrer de façon efficace et rapide des données génétiques a été implémenté. Cet outil permet de générer des données de meilleure qualité, avec une meilleure reproductibilité des résultats, tout en diminuant les chances d’obtenir une fausse association.

Histone H2B-R95A mutant identifies the pheromone pathway that signals cell cycle arrest during rapamycin response

La rapamycine est un immunosuppresseur utilisé pour traiter plusieurs types de maladies dont le cancer du rein. Son fonctionnement par l’inhibition de la voie de Tor mène à des changements dans des processus physiologiques, incluant le cycle cellulaire. Chez Saccharomyces cerevisiae, la rapamycine conduit à une altération rapide et globale de l’expression génique, déclenchant un remodelage de la chromatine. Nous proposons que les modifications des histones peuvent jouer un rôle crucial dans le remodelage de la chromatine en réponse à la rapamycine. Notre objectif principal est d’identifier d’une banque de mutants d’histone les variantes qui vont échouer à répondre à la rapamycine dans une tentative de réaliser une caractérisation des modifications d’histone critiques pour la réponse à cette drogue. Ainsi, nous avons réalisé un criblage d’une banque de mutants d’histone et identifié plusieurs mutants d‘histone dont la résistance à la rapamycine a été altérée. Nous avons caractérisé une de ces variantes d’histone, à savoir H2B, qui porte une substitution de l’alanine en arginine en position 95 (H2B-R95A) et démontré que ce mutant est extrêmement résistant à la rapamycine, et non à d’autres drogues. Des immunoprécipitations ont démontré que H2B-R95A est défectueux pour former un complexe avec Spt16, un facteur essentiel pour la dissociation de H2A et H2B de la chromatine, permetant la réplication et la transcription par les ADN et ARN polymérases, respectivement. Des expériences de ChIP-Chip et de micropuce ont démontré que l’arginine 95 de H2B est requise pour recruter Spt16 afin de permettre l’expression d’une multitude de gènes, dont certains font partie de la voie des phéromones. Des évidences seront présentées pour la première fois démontrant que la rapamycine peut activer la voie des phéromones et qu’une défectuosité dans cette voie cause la résistante à cette drogue.

Transcriptional approach to study porcine tracheal epithelial cells individually or dually infected with swine influenza virus and Streptococcus suis

Background: Swine influenza is a highly contagious viral infection in pigs affecting the respiratory tract that can have significant economic impacts. Streptococcus suis serotype 2 is one of the most important post-weaning bacterial pathogens in swine causing different infections, including pneumonia. Both pathogens are important contributors to the porcine respiratory disease complex. Outbreaks of swine influenza virus with a significant level of co-infections due to S. suis have lately been reported. In order to analyze, for the first time, the transcriptional host response of swine tracheal epithelial (NPTr) cells to H1N1 swine influenza virus (swH1N1) infection, S. suis serotype 2 infection and a dual infection, we carried out a comprehensive gene expression profiling using a microarray approach. Results: Gene clustering showed that the swH1N1 and swH1N1/S. suis infections modified the expression of genes in a similar manner. Additionally, infection of NPTr cells by S. suis alone resulted in fewer differentially expressed genes compared to mock-infected cells. However, some important genes coding for inflammatory mediators such as chemokines, interleukins, cell adhesion molecules, and eicosanoids were significantly upregulated in the presence of both pathogens compared to infection with each pathogen individually. This synergy may be the consequence, at least in part, of an increased bacterial adhesion/invasion of epithelial cells previously infected by swH1N1, as recently reported. Conclusion: Influenza virus would replicate in the respiratory epithelium and induce an inflammatory infiltrate comprised of mononuclear cells and neutrophils. In a co-infection situation, although these cells would be unable to phagocyte and kill S. suis, they are highly activated by this pathogen. S. suis is not considered a primary pulmonary pathogen, but an exacerbated production of proinflammatory mediators during a co-infection with influenza virus may be important in the pathogenesis and clinical outcome of S. suis-induced respiratory diseases.

Identification and characterization of new biomarkers in aggressive subtypes of breast cancer

En 2015, la récidive tumorale et les métastases du cancer du sein demeurent une cause importante de décès à travers le monde. Toutefois, ces cancers sont souvent hétérogènes car en dépit d’un phénotype similaire, l’évolution clinique et la réponse au traitement peuvent varier considérablement. Il y a donc un intérêt évident à identifier et à caractériser de nouveaux biomarqueurs pour permettre classer les tumeurs mammaires dans des sous-groupes plus homogènes. Notre hypothèse est que chaque cancer mammaire possède des caractéristiques distinctes au plan des altérations du génome et des profils d’expression géniques et que ces changements se traduisent cliniquement par une prédisposition à former des métastases ou à répondre ou non à la chimiothérapie et aux thérapies ciblées. Dans le cadre de nos travaux, nous nous sommes intéressés aux sous-types agressifs de tumeurs mammaires et notamment les cancers de type triple négatif. Nous avons aussi tenté d’identifier des marqueurs capables de distinguer l’une de l’autre les tumeurs de type luminal A et luminal B. Pour ce faire, nous avons d’abord utilisé une stratégie in silico à partir de données publiques (micro-puces d’ADN et séquençage de l’ARN). Nous avons ensuite construit sept micro-matrices tissulaires (TMA) provenant de tissus mammaires normaux et tumoraux fixés à la formaline et enrobés en paraffine. Ces outils nous ont permis d’évaluer par immunohistochimie les niveaux d’expression différentielle des marqueurs suivants : ANXA1, MMP-9, DP103 et MCM2. Ceux-ci ont été comparés aux marqueurs usuels du cancer du sein (ER, PR, HER2, CK5/6 et FOXA1) et corrélés aux données cliniques (survie globale et métastase). Nos résultats indiquent que ces nouveaux marqueurs jouent un rôle important dans l’évolution clinique défavorable des tumeurs de haut grade. Dans un premier article nous avons montré que l’expression d’ANXA1 est dérégulée dans les cancers de type triple-négatif et aussi, dans une certaine mesure, dans les tumeurs HER2+. Nous croyons qu’ANXA1 permet de mieux comprendre le processus d’hétérogénéité tumorale et facilite l’identification des tumeurs de haut grade. Nous proposons également qu’ d’ANXA1 stimule la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) et la formation des métastases. Dans un second temps, nous avons montré que les niveaux d’expression de MMP-9 reflètent la différenciation cellulaire et corrèlent avec les sous-types de cancers mammaires ayant un mauvais pronostic. Nous estimons que MMP-9 permet de mieux comprendre et d’identifier les tumeurs mammaires à haut risque. De fait, la surexpression de MMP-9 est associée à une augmentation des métastases, une récidive précoce et une diminution de la survie globale. Dans le cadre d’un troisième article, nous avons montré que la surexpression du marqueur de prolifération MCM2 s’observe dans les cancers triple-négatifs, HER2+ et Luminal B par comparaison aux cancers luminal A (p< 0.0001). Nos résultats suggèrent qu’en utilisant un seuil de 40% de noyaux marqués, nous pourrions distinguer l’une de l’autre les tumeurs de type luminal A et luminal B. Cela dit, avant de pouvoir envisager l’utilisation de ce marqueur en clinique, une étude de validation sur une nouvelle cohorte de patientes s’impose. En somme, les résultats de nos travaux suggèrent qu’ANXA1, MMP-9 et MCM2 sont des marqueurs intéressants pour mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques impliqués dans la progression tumorale et le développement des métastases. À terme, ces nouveaux marqueurs pourraient être utilisés seuls ou en combinaison avec d’autres gènes candidats pour permettre le développement de trousses « multigènes » ou d’essais protéomiques multiplex pour prédire l’évolution clinique des cancers mammaires.

Prevalence et caracterisation de Staphylococcus aureus resistant a la methicilline d'origine aviaire au Quebec

Le Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline (SARM) est un enjeu majeur en santé publique. Il est responsable d’une grande variété d’infections. Les “Livestock Associated-MRSA” (LA-MRSA) sont des SARM ayant comme origine les animaux de production tels le porc ou la volaille. Ils constituent un risque de transmission à l’humain via la chaîne alimentaire. Les LA-MRSA peuvent former du biofilm ce qui augmente leur tolérance aux stress environnementaux. Le biofilm est partiellement régulé par le système Agr. Il n’existe aucune donnée sur les ‘LA-MRSA’ d’origine aviaire au Québec. Les objectifs de ce projet étaient : (i) de déterminer la prévalence de ces SARM dans la viande de poulet et le poulet à griller de la province de Québec et (ii) de caractériser les isolats retrouvés. La collecte d’échantillons s’est effectuée dans 43 épiceries (309 cuisses et pilons de poulet) et dans deux abattoirs (échantillons nasaux et fécaux de 200 poulets) de la Montérégie. La prévalence de SARM a été évaluée à 1.29% (IC 95%: 0.35-3.28) et 0% dans la viande et les oiseaux respectivement. Les isolats testés se sont révélés résistants aux bêta-lactamines (n=15), à la tétracycline (n=10), à l’oxytétracycline (n=10), à la spectinomycine (n=10) et à la tobramycine (n=1). Le typage a révélé deux clones différents (ST398-V, n=10; et ST8-IVa ’USA300’, n=5). La présence de gènes de résistance aux antibiotiques (blaZ, blaR, blaI, erm(A), lnu(A), aad(D), fosB, tet(K), tet(L) et spc) ainsi que plusieurs gènes codant pour l’évasion du système immunitaire (IEC), la production de toxines ou encore pour la production de biofilm ont aussi été détectés. Une forte production de biofilm a été observée pour la majorité des isolats (n=11) à l’exception de certains isolats ST398. Le taux d’expression du système Agr n’a révélé aucune différence particulière entre les SARM testés. Pour conclure, nos données indiquent une faible prévalence de SARM chez la volaille et la viande de poulet. Les isolats ont été catégorisés en deux génotypes, dont un portant plus de gènes de résistance aux antibiotiques (ST398) et l’autre possédant plus de gènes de virulence (ST8).

Actinobacillus pleuropneumoniae induces SJPL cell cycle arrest in G2/M-phase and inhibits porcine reproductive and respiratory syndrome virus replication

Background: Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) is one of the most important pathogens in the swine industry and causes important economic losses. No effective antiviral drugs against it are commercially available. We recently reported that the culture supernatant of Actinobacillus pleuropneumoniae, the porcine pleuropneumonia causative agent, has an antiviral activity in vitro against PRRSV in SJPL cells. Objectives of this study were (i) to identify the mechanism behind the antiviral activity displayed by A. pleuropneumoniae and (ii) to characterize the active molecules present in the bacterial culture supernatant. Methods: Antibody microarray analysis was used in order to point out cellular pathways modulated by the A. pleuropneumoniae supernatant. Subsequent, flow cytometry analysis and cell cycle inhibitors were used to confirm antibody microarray data and to link them to the antiviral activity of the A. pleuropneumoniae supernatant. Finally, A. pleuropneumoniae supernatant characterization was partially achieved using mass spectrometry. Results: Using antibody microarray, we observed modulations in G2/M-phase cell cycle regulation pathway when SJPL cells were treated with A. pleuropneumoniae culture supernatant. These modulations were confirmed by a cell cycle arrest at the G2/M-phase when cells were treated with the A. pleuropneumoniae culture supernatant. Furthermore, two G2/M-phase cell cycle inhibitors demonstrated the ability to inhibit PRRSV infection, indicating a potential key role for PRRSV infection. Finally, mass spectrometry lead to identify two molecules (m/z 515.2 and m/z 663.6) present only in the culture supernatant. Conclusions: We demonstrated for the first time that A. pleuropneumoniae is able to disrupt SJPL cell cycle resulting in inhibitory activity against PRRSV. Furthermore, two putative molecules were identified from the culture supernatant. This study highlighted the cell cycle importance for PRRSV and will allow the development of new prophylactic or therapeutic approaches against PRRSV.

Dissection moléculaire de la sénescence cellulaire induite par le stress et la thérapie dans le cancer de l’ovaire et son impact sur la réponse des patientes

Le cancer de l’ovaire (COv) est le cancer gynécologique le plus létal chez la femme et les traitements existants, chirurgie et chimiothérapie, ont peu évolué au cours des dernières décennies. Nous proposons que la compréhension des différents destins cellulaires tels que la sénescence que peuvent choisir les cellules du cancer de l’ovaire en réponse à la chimiothérapie pourrait conduire à de nouvelles opportunités thérapeutiques. La sénescence cellulaire a été largement associée à l’activité de la protéine TP53, qui est mutée dans plus de 90% des cas de cancer de l’ovaire séreux de haut grade (COv-SHG), la forme la plus commune de la maladie. Dans nos travaux, à partir d’échantillons dérivés de patientes, nous montrons que les cultures primaires du cancer de l’ovaire séreux de haut grade exposées au stress ou à des drogues utilisées en chimiothérapie entrent en senescence grâce à l’activité d’un isoforme du gène CDKN2A (p16INK4A). Dans ces cellules, nous avons évalué les caractéristiques fondamentales de la sénescence cellulaire tels que les altérations morphologiques, l’activité béta galactosidase associée à la sénescence, les dommages à l’ADN, l’arrêt du cycle cellulaire et le phénotype sécrétoire associé à la sénescence. En utilisant des micromatrices tissulaires construites à partir d’échantillons humains de COv-SHG pré- et post-chimiothérapie, accompagnées de leurs données cliniques, nous avons quantifié des marqueurs de sénescence incluant une diminution de la prolifération cellulaire quelques semaines après chimiothérapie. De façon intéressante, l’expression de p16INK4A dans les échantillons de COv-SHG prétraitement corrèle avec une survie prolongée des patientes suite au traitement. Ceci suggère ainsi pour la première fois un impact biologique bénéfique pour la présence de cellules cancéreuses qui sont capable d’activer la sénescence, particulièrement pour le traitement du cancer de l’ovaire. Dans le but de complémenter les thérapies actuelles avec des approches de manipulation pharmacologique de la sénescence, nos résultats suggèrent qu’il serait important de déterminer l’impact positif ou négatif de la sénescence induite par la thérapie sur la progression de la maladie et la survie, pour chaque type de cancer de façon indépendante.

“Reconstruction of Gene Regulatory Network from Expression Profile of Plasma RNA Data of Colorectal Cancer Patients using Soft Computing Techniques”

Microarray data analysis is one of data mining tool which is used to extract meaningful information hidden in biological data. One of the major focuses on microarray data analysis is the reconstruction of gene regulatory network that may be used to provide a broader understanding on the functioning of complex cellular systems. Since cancer is a genetic disease arising from the abnormal gene function, the identification of cancerous genes and the regulatory pathways they control will provide a better platform for understanding the tumor formation and development. The major focus of this thesis is to understand the regulation of genes responsible for the development of cancer, particularly colorectal cancer by analyzing the microarray expression data. In this thesis, four computational algorithms namely fuzzy logic algorithm, modified genetic algorithm, dynamic neural fuzzy network and Takagi Sugeno Kang-type recurrent neural fuzzy network are used to extract cancer specific gene regulatory network from plasma RNA dataset of colorectal cancer patients. Plasma RNA is highly attractive for cancer analysis since it requires a collection of small amount of blood and it can be obtained at any time in repetitive fashion allowing the analysis of disease progression and treatment response.

MicroRNA–mRNA interaction network using TSK-type recurrent neural fuzzy network

MicroRNAs are short non-coding RNAs that can regulate gene expression during various crucial cell processes such as differentiation, proliferation and apoptosis. Changes in expression profiles of miRNA play an important role in the development of many cancers, including CRC. Therefore, the identification of cancer related miRNAs and their target genes are important for cancer biology research. In this paper, we applied TSK-type recurrent neural fuzzy network (TRNFN) to infer miRNA–mRNA association network from paired miRNA, mRNA expression profiles of CRC patients. We demonstrated that the method we proposed achieved good performance in recovering known experimentally verified miRNA–mRNA associations. Moreover, our approach proved successful in identifying 17 validated cancer miRNAs which are directly involved in the CRC related pathways. Targeting such miRNAs may help not only to prevent the recurrence of disease but also to control the growth of advanced metastatic tumors. Our regulatory modules provide valuable insights into the pathogenesis of cancer

Mögliche Komponenten in einem Signalweg zwischen endosomaler Verdauung und Partikelaufnahme in Dictyostelium discoideum

Die Amöbe Dictyostelium discoideum ist ein genetisch leicht manipulierbarer Organismus und dient als Modell für verschiedene zelluläre Prozesse, wie z.B. der Endocytose. Hierbei konnte vieles über die Funktion von beteiligten Proteinen anhand von Untersuchungen an spezifischen Mutanten gelernt werden. Bei AlyA handelt es sich um D. discoideum spezifisches Lysozym. GFP-modifiziertes AlyA lokalisiert in Phagosomen und in einer neuen Klasse von Vesikeln lysososomaler Enzyme. Über Rescue Mutanten konnte der Phänotyp alyA138 Knockout Mutanten, einer erhöhten Phagocytoserate einhergehend mit einem verbesserten Wachstum auf Bakterienrasen, der gerettet werden. In AlyA Null Zellen wurde eine erhöhte Expression von Gp70, einer lysosomalen Esterase, gefunden. Die Überexpression von Gp70 alleine führt mit geringen Unterschieden zu einem Phänotyp ähnlich der alyA Knockout Mutante. Demzufolge scheinen beide Enzyme eine Funktion in einer gemeinsamen Signalskaskade, ausgehend von der Degradation internalisierter Bakterien hin zu einer erhöhten Phagocytoserate, zu haben. Eine erhöhte Lysozymaktivität in Gp70 Überexprimierern wurde nicht gefunden. Mit H5 konnte mittels Microarray Analysen ein Protein identifiziert werden, welches in den alyA138 Knockout Zellen, jedoch nicht in Gp70 Überexprimierern, verstärkt exprimiert wird. Eine Funktion in einer Signalkette zwischen AlyA und Gp70, wie die erhöhte Expression vermuten lässt, konnte jedoch nicht bestätigt werden. So führt die Überexpression von H5 weder zu einer erhöhten Phagocytoserate noch zu einer verstärkten Expression von Gp70. Mittels der Microarray Analysen konnten weiterhin acht Gene identifiziert werden, die in den beiden Mutanten schwächer exprimiert vorliegen. Knockaout Mutanten zweier dieser Gene, sse346 und ssj758, wurden untersucht. Sse346 Null Zellen zeigen eine erhöhte Phagocytoserate einhergehend mit effizienterem Wachstum auf Bakterienrasen, während das Fehlen von Ssj758 nur zu vergrößerten Plaquedurchmessern führte. Beide proteine haben demnach eine Funktion in der postulierten Signalkaskade. Diese scheint, ausgehend von der Überexpression von Gp70, zweigeteilt zu verlaufen.

DNA methylation in Dictyostelium discoideum

DNA methyltransferases of type Dnmt2 are a highly conserved protein family with enigmatic function. The aim of this work was to characterize DnmA, the Dnmt2 methyltransferase in Dictyostelium discoideum, and further to investigate its implication in DNA methylation and transcriptional gene silencing. The genome of the social amoeba Dictyostelium encodes DnmA as the sole DNA methyltransferase. The enzyme bears all ten characteristic DNA methyltransferase motifs in its catalytic domain. The DnmA mRNA was found by RT-PCR to be expressed during vegetative growth and down regulated during development. Investigations using fluorescence microscopy showed that both DnmA-myc and DnmA-GFP fusions predominantly localised to the nucleus. The function of DnmA remained initially unclear, but later experiment revealed that the enzyme is an active DNA methyltransferase responsible for all DNA (cytosine) methylation in Dictyostelium. Neither in gel retardation assays, nor by the yeast two hybrid system, clues on the functionality of DnmA could be obtained. However, immunological detection of the methylation mark with an α - 5mC antibody gave initial evidence that the DNA of Dictyostelium was methylated. Furthermore, addition of 5-aza-cytidine as demethylating agent to the Dictyostelium medium and subsequent in vitro incubation of the DNA isolated from these cells with recombinant DnmA showed that the enzyme binds slightly better to this target DNA. In order to investigate further the function of the protein, a gene knock-out for dnmA was generated. The gene was successfully disrupted by homologous recombination, the knock-out strain, however, did not show any obvious phenotype under normal laboratory conditions. To identify specific target sequences for DNA methylation, a microarray analysis was carried out. Setting a threshold of at least 1.5 fold for differences in the strength of gene expression, several such genes in the knock-out strain were chosen for further investigation. Among the up-regulated genes were the ESTs representing the gag and the RT genes respectively of the retrotransposon skipper. In addition Northern blot analysis confirmed the up-regulation of skipper in the DnmA knock-out strain. Bisufite treatment and sequencing of specific DNA stretches from skipper revealed that DnmA is responsible for methylation of mostly asymmetric cytosines. Together with skipper, DIRS-1 retrotransposon was found later also to be methylated but was not present on the microarray. Furthermore, skipper transcription was also up-regulated in strains that had genes disrupted encoding components of the RNA interference pathway. In contrast, DIRS 1 expression was not affected by a loss of DnmA but was strongly increased in the strain that had the RNA directed RNA polymerase gene rrpC disrupted. Strains generated by propagating the usual wild type Ax2 and the DnmA knock-out cells over 16 rounds in development were analyzed for transposon activity. Northern blot analysis revealed activation for skipper expression, but not for DIRS-1. A large number of siRNAs were found to be correspondent to the DIRS-1 sequence, suggesting concerted regulation of DIRS-1 expression by RNAi and DNA methylation. In contrast, no siRNAs corresponding to the standard skipper element were found. The data show that DNA methylation plays a crucial role in epigenetic gene regulation in Dictyostelium and that different, partially overlapping mechanisms control transposon silencing for skipper and DIRS-1. To elucidate the mechanism of targeting the protein to particular genes in the Dictyostelium genome, some more genes which were up-regulated in the DnmA knock-out strain were analyzed by bisulfite sequencing. The chosen genes are involved in the multidrug response in other species, but their function in Dictyostelium is uncertain. Bisulfite data showed that two of these genes were methylated at asymmetrical C-residues in the wild type, but not in DnmA knock-out cells. This suggested that DNA methylation in Dictyostelium is involved not only in transposon regulation but also in transcriptional silencing of specific genes.

Charakterisierung potentiell positiver Regulatoren der Phagozytose in Dictyostelium discoideum und deren Funktion in einem Signalweg zwischen endosomaler Verdauung und Partikelaufnahme

Dictyostelium discoideum ernährt sich in seinem natürlichen Habitat, dem Waldboden, vorwiegend von Bakterien. Diese werden aus der Umgebung über Phagozytose aufgenommen und unter anderem mit Hilfe von Lysozymen verdaut. Eines dieser Lysozyme, AlyA, wurde bereits in vorhergehenden Arbeiten detailliert untersucht. Sein Fehlen resultierte in einer zeitabhängigen Vergrößerung der Fresshöfe in Bakterienrasen. Zusätzlich waren in diesen Knockout-Mutanten auch die Phagozytoserate und die Expression eines zweiten lysosomalen Enzyms (Gp70) erhöht. Die Überexpression dieser Esterase in wildtypischen Zellen bewirkte ebenfalls, dass Partikel aus der Umgebung effektiver aufgenommen werden konnten. Da die AlyA-Mutanten und die Gp70-Überexprimierer ähnliche Phänotypen zeigten, die Proteine aber in unterschiedlichen lysosomalen Vesikeln lokalisieren, müssen weitere Proteine an der Ausbildung der Phänotypen beteiligt sein. Aus diesem Grund wurden die Genexpressionen beider Mutanten verglichen. Über Microarray-Analysen sollten auf diese Weise weitere Proteine identifiziert werden, die eine Weiterleitung des Signals von AlyA über Gp70 bis hin zur Plasmamembran vermitteln. Einigen der potentiellen Kandidaten konnte anhand der Untersuchung von Mutanten bereits eine Weiterleitung des Signals zwischen Gp70 und der erhöhten Phagozytose an der Plasmamembran zugeordnet werden. Um jedoch mehr über die Signalkette oberhalb von Gp70 zu erfahren, wurden im Rahmen dieser Arbeit drei Proteine untersucht. Die Expression von DD3-3, SSD673 und SSD485 war in den AlyA-Mutanten erhöht, in den Gp70-Überexprimierern jedoch unverändert. Durch Herstellung und Untersuchung von überexprimierenden Mutanten wurde die Wirkung jedes Proteins auf die Gp70-Expression, das Phagozytoseverhalten und den Durchmesser der Fresshöfe analysiert. Die Markierung der Kandidaten mit dem Myc-Epitop sollte deren subzelluläre Lokalisation klären. Für DD3-3-überexpimierende Klone konnte in dieser Arbeit allerdings keine Veränderung gegenüber wildtypischen Zellen festgestellt werden. Sie zeigt allerdings, dass Medium von SSD673-überexprimierenden Zellen die Phagozytoserate wildtypischer Zellen leicht erhöht. Eine starke SSD673myc-Expression führte auch zu einer verstärkten Aufnahme von Hefezellen. Die Gp70-Expression in Gesamtzelllysaten der SSD673-Mutanten blieb jedoch unverändert. Wurde in Wildtypzellen hingegen SSD485 im Übermaß exprimiert, so führte dies zu einer verstärkten Partikelaufnahme. Diese entwickelte sich ähnlich den AlyA-Knockout-Mutanten in Abhängigkeit der Zeit und ging mit einer erhöhten Gp70-Expression einher. In dieser Arbeit konnte folglich zwei von drei Proteinen eine positive Wirkung auf die Phagozytose nachgewiesen werden. SSD485-Mutanten erfüllten darüber hinaus die Bedingungen für eine Weiterleitung des AlyA-Signals von SSD485 auf Gp70 bis hin zu einer erhöhten Phagozytose.