Produção de um agente de controlo biológico de doenças pós-colheita, em reactor biológico, a partir de resíduos de alfarroba. Estudos de transferência de massa.

Dissertação mest., Engenharia Biológica, Universidade do Algarve, 2009

Abordagem tecnológica da administração colónica: aplicação à doença de Crohn

Dissertação de mest., Ciências Farmacêuticas, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Univ. do Algarve, 2011

Estudo de alterações na função salivar de um modelo de ratos pré-diabéticos

A Diabetes Mellitus é uma doença metabólica com uma distribuição mundial cada vez mais acentuada, acarretando consigo, elevada morbilidade e mortalidade. Deste modo, é de suma importância a compreensão e estudo em fases precoces desta doença. Nos últimos anos a saliva tem sido usada como fonte de biomarcadores para detecção e monitorização de doenças. Para além disso, há referencia a alterações na secreção salivar e percepção dos alimentos em indivíduos diabéticos, tornando-se importante um maior conhecimento da função salivar associada a esta patologia. O objectivo geral deste trabalho é estudar a função salivar num modelo de roedores intolerantes à glicose, avaliando-se a concentração proteica total da saliva, morfologia e morfometria das glândulas salivares maiores e expressão da amilase na saliva e glândulas salivares. Não se observam diferenças entre os grupos, para a concentração em proteína total, nem para a expressão de α-amilase, na saliva. Na análise histológica das glândulas salivares maiores é possível observar dimensões significativamente maiores dos ácinos das glândulas analisadas (parótida, submandibular e sublingual), em relação aos animais normoglicémicos, sugerindo o que pode ser o início de uma patologia comum em diabéticos, a sialose (hipertrofia e hiperplasia das glândulas salivares). Através de imunomarcação para a actina observa-se um aumento da expressão de células mioepiteliais na seguinte ordem: parótida, submandibular e sublingual. Não se observam diferenças entre os grupos. A imunomarcação para a α-amilase é mais intensa nos ácinos da parótida, nos ductos granulares da submandibular e nas meias luas serosas da sublingual, em ambos os grupos. Verifica-se uma sobre-expressão nos ductos intralobulares da parótida e nos ductos granulares da sumandibular, nos animais pré-diabéticos, sugerindo alguma endocitose da enzima por parte das células dos ductos. Os resultados obtidos sugerem alterações na função salivar, numa fase prévia ao desenvolvimento da Diabetes Mellitus, as quais merecem ser exploradas.

Study of influence of regulatory polymorphisms of expression in development of breast cancer

The human genome has millions of genetics variants that can affect gene expression. These variants are known as cis-regulatory variants and are responsible for intra-species phenotypic differences and individual susceptibility to disease. One of the diseases affected by cis-regulatory variants is breast cancer. Breast cancer is one of the most common cancers, with approximately 4500 new cases each year in Portugal. Breast cancer has many genes mutated and TP53 has been shown to be relevant for this disease. TP53 is one of the most commonly mutated genes in human cancer and it is involved in cell cycle regulation and apoptosis. Previous work by Maia et al has shown that TP53 has differential allelic expression (DAE), which suggests that this gene may be under the influence of cis-regulatory variants. Also, its DAE pattern is totally altered in breast tumours with normal copy number. We hypothesized that cis-regulatory variants affecting TP53 may have a role in breast cancer development and treatment. The present work aims to identify the cis-regulatory variants playing a role in TP53 expression, using in silico, in vitro and in vivo approaches. By bioinformatic tools we have identified candidate cis-regulatory variants and predicted the possible transcription factor binding sites that they affect. By EMSA we studied DNA-protein interactions in this region of TP53. The in silico analysis allowed us to identified three candidate cis-regulatory SNPs which may affect the binding of seven transcription factors. However, the EMSA experiments have not been conclusive and we have not yet confirmed whether any of the identified SNPs are associated with gene expression control of TP53. We will carry out further experiments to validate our findings.

Implementação de um programa de pré-requisitos baseado na metodologia do sistema HACCP no mercado municipal de Tavira (freguesia de Santa Maria)

A transmissão de agentes patogénicos (bactérias, vírus e parasitas) através do consumo de géneros alimentícios pode desencadear um problema gravíssimo de saúde pública. Esta preocupação crescente levou o Homem a criar regras e aplicar medidas rigorosas que impedissem a contaminação dos alimentos e a propagação de doenças infecto-contagiosas que provocam muitos prejuízos à sociedade atual. De acordo com a Retificação ao Regulamento (CE) n.º 852/2004 do Parlamento Europeu e do Conselho de 29 de abril, verificou-se a necessidade de implementar um programa de pré-requisitos (PPR) (1.ª Fase) baseado na metodologia do Sistema HACCP no Mercado Municipal de Tavira, com o intuito de valorizar estes locais de comércio a retalho de diversos grupos de géneros alimentícios, onde existem inúmeros riscos de contaminação. Foi elaborada uma checklist e realizada uma avaliação minuciosa das condições de construção do edifício, a disposição da estrutura física, o modo de funcionamento dos equipamentos e o fluxo das operações integradas no respetivo mercado municipal, desde a zona de receção da mercadoria até aos locais de exposição e venda dos alimentos aos consumidores. A cascata de operações para a implementação do Sistema HACCP divide-se em três fases, contudo, para esta dissertação, apenas a primeira fase (programa de pré-requisitos - PPR) foi implementada no respetivo mercado municipal, a saber: - PPR n.º 1: Instalações e equipamentos; - PPR n.º 2: Plano de higienização; - PPR n.º 3: Controlo de pragas; - PPR n.º 4: Abastecimento de água; - PPR n.º 5: Recolha de resíduos; - PPR n.º 6: Material em contacto com géneros alimentícios; - PPR n.º 7: Higiene pessoal; - PPR n.º 8: Formação do pessoal. A implementação do PPR tem sido um processo moroso e ainda se encontra na fase de implementação. Periodicamente, os procedimentos, registos e documentos são verificados por forma evitar a repetição dos problemas.

Isolamento e produção de agentes de controlo biológico das principais doenças de pós-colheita, em citrinos e pomóideas

Potenciais agentes de biocontrolo foram isolados a partir da microbiota epifítica de folhas e frutos, de citrinos e pomóideas, de diferentes pomares, durante diferentes campanhas e de distintas condições de armazenamento. A atividade antagonista de 1465 microrganismos isolados foi testada em ensaios in vivo em pomóideas face a Penicillium expansum (104 esporos/ml) e em citrinos face a P. digitatum (105 esporos/ml) em frutos feridos e inoculados artificialmente. Aproximadamente 7,6% dos isolados reduziu a severidade (diâmetro da podridão) e a incidência (% podres) em mais de 25%, menos de 3% reduziu ambos os parâmetros em mais de 50%, mas apenas 4 microrganismos preencheram os critérios de seleção, redução da incidência e severidade em mais de 75%. Dos 4 e pelos resultados obtidos em ensaios de seleção secundária e de determinação da concentração mínima eficaz, destacaram-se e selecionaram-se 2 microrganismos, uma bactéria isolada de laranjas „Valencia late‟ e identificada como pertencente ao grupo das Enterobactérias, Pantoea agglomerans PCB-1 e uma levedura isolada a partir da superfície de maças 'Bravo de Esmolfe' identificada como Metschnikowia andauensis PBC-2, com o objetivo de usar dois modelos distintos de agentes de biocontrol, uma bactéria e uma levedura. P. agglomerans é um agente de biocontrolo já conhecido. A estirpe PBC-1 isolada neste trabalho mostrou ter elevada eficácia face aos principais agentes patogénicos na póscolheita de citrinos e pomóideas. M. andauensis é uma levedura recentemente descoberta e a estirpe PBC-2 diz respeito à primeira referência desta espécie como agente de biocontrolo, a qual foi recentemente objeto de concessão de Patente de Invenção Nacional nº 105210, como uma nova estirpe desta espécie para uso como agente de biocontrolo das doenças de póscolheita de frutos. A concentração mínima eficaz dos antagonistas revelou estar dentro dos limites para o seu desenvolvimento comercial. M. andauensis PBC-2 quando aplicada à concentração de 5×106 ufc/ml, permitiu uma redução da incidência e da severidade de 62 e 70%, respetivamente, e quando aplicada a 1×107 ufc/ml, uma redução de 90% de incidência e de 95% de severidade. P. agglomerans PBC-1 aplicada a 1 × 108 ufc/ml em maçãs e em citrinos no controlo de P. expansum e P. digitatum, respetivamente, propiciaram uma redução significativa de cerca de 86% de cada um dos agentes patogénicos. O espectro de ação de M. andauensis PBC-2 foi avaliado, verificando-se o controlo efetivo face a Rhizopus stolonifer, P. expansum e Botritys cinerea, em pera 'Rocha' e em diferentes cultivares de maçã e contra P. digitatum e Penicillium italicum em clementinas e laranjas de diferentes cultivares. Durante 4 épocas, a eficácia de M. andauensis PBC-2, foi avaliada e comparada com o fungicida sintético mais usado comercialmente, Imazalil, em ensaios semicomerciais. Os resultados assemelharam-se aos obtidos com o fungicida, a redução da incidência do bolor azul foi de 90% em maças armazenadas durante 3 meses a 1±0.5 ºC, seguido de 7 dias à temperatura ambiente, para simular o tempo de prateleira. Em ensaios do estudo da dinâmica populacional, verificou-se que o agente de biocontrolo M. andauensis PBC-2 tem uma excelente capacidade colonizadora e que consegue crescer e sobreviver nas feridas, mas também na superfície dos frutos, armazenados à temperatura ambiente e em condições de frio. Pelo contrário, M. andauensis PBC- não apresentou capacidade de sobrevivência no suco gástrico simulado, começando a população a diminuir imediatamente após exposição e passadas 48 h não restava população viável. Diferentes meios de cultura usualmente descritos na produção de leveduras foram testados na produção de M. andauensis PBC-2. Aquele que apresentou a maior população viável ao fim de 40 h de incubação foi o meio YPD, entretanto escolhido para estudos posteriores. O pH mais favorável ao crescimento foi de 6,5, não se observando diferenças significativas entre os crescimentos a 25 e 30 ºC. Estudou-se ainda o efeito da concentração das duas fontes de azoto do meio YPD e elegeu-se a combinação de 10 g/l de extrato de levedura e 20 g/l de peptona. Nos estudos de produção de biomassa dos dois potenciais agentes de biocontrolo, analisou-se o efeito da sacarose, frutose e glucose, como fontes de carbono e otimizou-se a concentração destes açúcares no crescimento em Erlenmeyer. Após 20 h de incubação a população viável de P. agglomerans PBC-1 atingiu 3.9×109, 1.5×109, 3.9×109 ufc/ml, respetivamente. No caso de M. andauensis PBC-2, foi obtida a população de 1.2×108, 5.3×108 e 1,3×108 ufc/ml, com glucose, sacarose e frutose, após 40 h. Os resultados permitem concluir que os dois agentes têm capacidade de metabolizar os açúcares testados, contudo e atendendo à produtividade de biomassa, rendimento, disponibilidade e custo, optou-se por usar a sacarose como fonte de carbono nos restantes ensaios, nomeadamente na transição de Erlenmeyer para reator biológico. Na produção de P. agglomerans PBC-1 escolheu-se o meio SAC (5 g/l sacarose e 5 g/l extrato de levedura). O meio YPS (12.5g/l sacarose, 10 g/l extrato de levedura, 20 g/l peptona) foi usado no aumento de escala de M. andauensis PBC-2. A otimização da produção em reator biológico de P. agglomerans PCB-1 foi realizada submetendo o microrganismo a diferentes condições hidrodinâmicas, testando-se arejamentos, dois tipos de turbina (hélice; rusthon) e dispersores (poroso, em L). Foram igualmente estudados, o efeito da concentração inicial do inoculo e a adição programada da fonte de carbono. Embora tenham sido testadas diferentes variações, o perfil dos diferentes parâmetros analisados foi idêntico, a população máxima viável foi de 3-5×109 ufc/ml. A diferença mais notória foi observada na fermentação com concentração inicial de 107 cfu/ml, que permitiu encurtar em cinco horas a fase lag, o que pode significar uma redução de tempo de fermentação, e consequentemente uma redução de custos. Visando a produção de biomassa a baixo custo, fator importante na implementação de um sistema de controlo biológico, estudou-se a possibilidade de utilizar subprodutos e resíduos da indústria alimentar no crescimento dos agentes de biocontrolo. Subprodutos da indústria de alfarroba e subprodutos e resíduos da indústria de sumos de citrinos foram utilizados na produção de P. agglomerans PBC-1 e de M. andauensis PBC-2, respetivamente. Desta forma, para além de uma redução dos custos de produção, pretendeu-se a valorização de um subproduto (no caso de alfarroba e do bagaço de citrinos) e mitigar os efeitos nefastos de um resíduo (licor), com elevada carga poluente, que gera graves problemas ambientais e que pode ditar o encerramento desta unidade industrial, com efeitos devastadores para a economia local. Realizaram-se extrações de subprodutos da indústria de alfarroba, a diferentes razões sólido/líquido, tempos e temperaturas, de forma a maximizar a extração de açúcares. A potencialidade de utilizar o extrato de açúcares obtido, na produção de P. agglomerans PBC-1 foi avaliada, em ensaios de crescimento em Erlenmeyer, com consequente transição para reator mecanicamente agitado. Os perfis de crescimento da cultura crescida com subprodutos da indústria de alfarroba assemelharam-se aos observados com sacarose como fonte de carbono. A biomassa viável produzida com subprodutos da indústria de alfarroba, foi de 4- 7×109 ufc/ml, o que permite concluir que é uma alternativa viável à produção deste microrganismo. A produção de M. andauensis PBC-2 com subprodutos da indústria de sumos de citrinos, foi estudada em Erlenmeyer tendo como objetivo conhecer os perfis de crescimento do microrganismo, bem como, estudar a melhor combinação desta fonte de carbono e sua concentração. O bagaço de citrinos e um resíduo líquido, que se denominou de licor, foram testados com resultados comparáveis à produção obtida com meio usado como standard, (YPS), sem comprometer a atividade antagonista do agente de biocontrolo. Posteriormente, foi realizada a produção em reator mecanicamente agitado, escolhendo-se para tal o meio YL (10 g/l extrato de levedura e licor à concentração de açúcares de 12.5 g/l). Os parâmetros de crescimento da cultura foram semelhantes aos obtidos com a fonte de carbono comercial. Após aproximadamente 40 h de incubação, a população viável de M. andauensis PCB-2 atingiu 3.1×108 ufc/ml. A produtividade de biomassa e rendimento foi de 0.435 g/l.h e 1.502 g/g, respetivamente, comparável a produtividade de biomassa (0.432 g/l.h) e rendimento (1.4416 g/g) observado no meio YPS. Os resultados obtidos, são uma base sólida para o aumento de escala a um nível laboratorial e semi-industrial, permitiram concluir que é exequível produzir M. andauensis a baixo custo e representam uma possível alternativa para um resíduo. Em estudos dos possíveis modos de ação, de M. andauensis PBC-2, conclui-se que, este agente de biocontrolo, não tem como modos de ação a produção de antibióticos ou de voláteis, uma vez que, não se verificou inibição do crescimento dos agentes patogénicos. A competição por ferro e a produção de enzimas líticas por M. andauensis PBC-2 foi estudada em meios com diferentes concentrações de ferro e em um meio de cultura, com paredes celulares de fungos, como única fonte de carbono. Os resultados obtidos neste estudo sugerem que a produção e secreção de enzimas líticas não é o principal ou o mais importante modo de ação do agente de controlo biológico PBC-2, uma vez que a produção de quitinase observada ao 5 e 7º dia de incubação foi muito baixa, e não foi observada a produção de β-1,3- glucanases e proteases.

Farmacogenómica na terapêutica das leucemias agudas

As leucemias agudas são doenças raras, quando comparadas com outros tipos de neoplasias constituindo, no entanto, a doença maligna mais comum na infância. São responsáveis por 30% de todos os tipos de cancros diagnosticados em crianças menores de 15 anos em países industrializados. Enquanto que a leucemia linfoblástica aguda apresenta uma taxa de incidência superior em crianças até aos 15 anos, correspondendo a cerca de 80% das leucemias em crianças e adolescentes, a leucemia mieloide aguda é rara abaixo dos 40 anos, sendo que a sua incidência aumenta progressivamente com a idade. As estratégias atuais de tratamento dividem a terapêutica em duas etapas: a primeira possui como objetivo induzir a remissão da doença e a segunda consiste numa terapêutica de pós-remissão com o objetivo de erradicar a doença residual mínima, evitar recidivas e promover a cura. Após anos de pesquisa na área da farmacogenómica, observa-se que as diferenças genéticas entre indivíduos podem explicar alguma da variabilidade observada na farmacocinética, eficácia e toxicidade de alguns fármacos. Embora muitos estudos relacionem diferentes respostas farmacológicas com a variabilidade genética, a maioria daqueles aplicam-se à população adulta pelo que a atenção dada à população pediátrica tem sido muito menor. Assim, o aperfeiçoamento na terapêutica das leucemias agudas é urgente. Atualmente encontra-se perfeitamente estabelecida a relação entre reações adversas à 6-mercaptopurina e polimorfismos no gene que codifica para a enzima tiopurina s-metiltransferase, sendo um dos poucos exemplos na área da farmacogenética a ser “traduzido” para a prática clínica.

The activity of mouse Cerberus like 2 during cardiogenesis - genetic and morphogenetic studies

Cardiogenesis is a delicate and complex process that requires the coordination of an intricate network of pathways and the different cell types. Therefore, understanding heart development at the morphogenetic level is an essential requirement to uncover the causes of congenital heart disease and to provide insight for disease therapies. Mouse Cerberus like 2 (Cerl2) has been defined as a Nodal antagonist in the node with an important role in the Left-Right (L/R) axis establishment, at the early embryonic development. As expected, Cerl2 knockout mice (Cerl2-/-) showed multiple laterality defects with associated cardiac failure. In order to identify the endogenous role of Cerl2 during heart formation independent of its described functions in the node, we accurately analyzed animals where laterality defects were not present. We thereby unravel the consequences of Cerl2 lossof- function in the heart, namely increased left ventricular thickness due to hyperplasia of cardiomyocytes and de-regulated expression of cardiac genes. Furthermore, the Cerl2 mutant neonates present impaired cardiac function. Once that the cardiac expression of Cerl2 is mostly observed in the left ventricle until around midgestration, this result suggest a specific regulatory role of Cerl2 during the formation of the left ventricular myoarchitecture. Here, we present two possible molecular mechanisms underlying the cardiac Cerl2 function, the regulation of Cerl2 antagonist in activation of the TGFßs/Nodal/Activin/Smad2 signaling identified by increased Smad2 phosphorilation in Cerl2-/- hearts and the negative feedback between Cerl2 and Wnt/ß-catenin signaling in heart formation. In this work and since embryonic stem cells derived from 129 mice strain is extensively used to produce targeted mutants, we also present echocardiographic reference values to progressive use of juveniles and young adult 129/Sv strain in cardiac studies. In addition, we investigate the cardiac physiology of the surviving Cerl2 mutants in 129/Sv background over time through a follow-up study using echocardiographic analysis. Our results revealed that Cerl2-/- mice are able to improve and maintain the diastolic and most of systolic cardiac physiologic parameters as analyzed until young adult age. Since Cerl2 is no longer expressed in the postnatal heart, we suggest that an intrinsic and compensatory mechanism of adaptation may be active for recovering the decreased cardiac function found in Cerl2 mutant neonates. Altogether, these data highlight the role of Cerl2 during embryonic heart development in mice. Furthermore, we also suggest that Cerl2-/- may be an interesting model to uncover the molecular, cellular and physiological mechanisms behind the improvement of the cardiac function, contributing to the development of therapeutic approaches to treat heart failures.

O impacte da política comum de pescas na gestão de um recurso natural a nível regional: a actividade pesqueira no Algarve

Dissertação de mestrado, Ciências Económicas e Empresariais, Unidade de Ciências Económicas e Empresariais, Universidade do Algarve. Instituto Superior de Economia e Gestão, Universidade Técnica de Lisboa, 1995

Molecular structure and functional analysis of runx3 in zebrafish

Tese de doutoramento, Ciências Biomédicas, Universidade do Algarve, Departamento de Ciências Biomédicas e Medicina, 2014

Cancro colorretal e inflamação - vias celulares e alvos farmacológicos

Dissertação de mestrado, Ciências Farmacêuticas, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade do Algarve, 2015

Novas abordagens no desenvolvimento de fármacos modificadores da doença de Alzheimer

Dissertação de mestrado, Ciências Farmacêuticas, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade do Algarve, 2015

Deciphering the molecular role of DJ-1 in the etiology of Parkinson’s and Huntingtons’s disease

Tese de doutoramento, Ciências Biomédicas (Neurociências), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2014

The role of alpha-synuclein phosphorylation in synucleinopathies

Tese de doutoramento, Ciências Biomédicas (Neurociências), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2014

Towards the therapeutic use of regulatory T cells for the treatment of human autoimmune diseases

Tese de doutoramento, Medicina (Imunologia Clínica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2016