Shifts of Intracellular pH Distribution as a Part of the Signal Mechanism Leading to the Elicitation of Benzophenanthridine Alkaloids1 : Phytoalexin Biosynthesis in Cultured Cells of Eschscholtzia californica

Cultured cells of Eschscholtzia californica (Californian poppy) respond to a yeast elicitor preparation or Penicillium cyclopium spores with the production of benzophenanthridine alkaloids, which are potent phytoalexins. Confocal pH mapping with the probe carboxy-seminaphthorhodafluor-1-acetoxymethylester revealed characteristic shifts of the pH distribution in challenged cells: within a few minutes after elicitor contact a transient acidification of cytoplasmic and nuclear areas occurred in parallel with an increase of the vacuolar pH. The change of proton concentration in the vacuole and in the extravacuolar area showed a nearly constant relation, indicating an efflux of vacuolar protons into the cytosol. A 10-min treatment with 2 mm butyric or pivalic acid caused a transient acidification of the cytoplasm comparable to that observed after elicitor contact and also induced alkaloid biosynthesis. Experimental depletion of the vacuolar proton pool reversibly prevented both the elicitor-triggered pH shifts and the induction of alkaloid biosynthesis. pH shifts and induction of alkaloid biosynthesis showed a similar dependence on the elicitor concentration. Net efflux of K+, alkalinization of the outer medium, and browning of the cells were evoked only at higher elicitor concentrations. We suggest that transient acidification of the cytoplasm via efflux of vacuolar protons is both a necessary and sufficient step in the signal path toward biosynthesis of benzophenanthridine alkaloids in Californian poppy cells.

Expression Patterns Conferred by Tyrosine/Dihydroxyphenylalanine Decarboxylase Promoters from Opium Poppy Are Conserved in Transgenic Tobacco1

Opium poppy (Papaver somniferum) contains a large family of tyrosine/dihydroxyphenylalanine decarboxylase (tydc) genes involved in the biosynthesis of benzylisoquinoline alkaloids and cell wall-bound hydroxycinnamic acid amides. Eight members from two distinct gene subfamilies have been isolated, tydc1, tydc4, tydc6, tydc8, and tydc9 in one group and tydc2, tydc3, and tydc7 in the other. The tydc8 and tydc9 genes were located 3.2 kb apart on one genomic clone, suggesting that the family is clustered. Transcripts for most tydc genes were detected only in roots. Only tydc2 and tydc7 revealed expression in both roots and shoots, and TYDC3 mRNAs were the only specific transcripts detected in seedlings. TYDC1, TYDC8, and TYDC9 mRNAs, which occurred in roots, were not detected in elicitor-treated opium poppy cultures. Expression of tydc4, which contains a premature termination codon, was not detected under any conditions. Five tydc promoters were fused to the β-glucuronidase (GUS) reporter gene in a binary vector. All constructs produced transient GUS activity in microprojectile-bombarded opium poppy and tobacco (Nicotiana tabacum) cell cultures. The organ- and tissue-specific expression pattern of tydc promoter-GUS fusions in transgenic tobacco was generally parallel to that of corresponding tydc genes in opium poppy. GUS expression was most abundant in the internal phloem of shoot organs and in the stele of roots. Select tydc promoter-GUS fusions were also wound induced in transgenic tobacco, suggesting that the basic mechanisms of developmental and inducible tydc regulation are conserved across plant species.

Influence of Precursor Availability on Alkaloid Accumulation by Transgenic Cell Line of Catharanthus roseus1

We have used a transgenic cell line of Catharanthus roseus (L.) G. Don to study the relative importance of the supply of biosynthetic precursors for the synthesis of terpenoid indole alkaloids. Line S10 carries a recombinant, constitutively overexpressed version of the endogenous strictosidine synthase (Str) gene. Various concentrations and combinations of the substrate tryptamine and of loganin, the immediate precursor of secologanin, were added to suspension cultures of S10. Our results indicate that high rates of tryptamine synthesis can take place under conditions of low tryptophan decarboxylase activity, and that high rates of strictosidine synthesis are possible in the presence of a small tryptamine pool. It appears that the utilization of tryptamine for alkaloid biosynthesis enhances metabolic flux through the indole pathway. However, a deficiency in the supply of either the iridoid or the indole precursor can limit flux through the step catalyzed by strictosidine synthase. Precursor utilization for the synthesis of strictosidine depends on the availability of the cosubstrate; the relative abundance of these precursors is a cell-line-specific trait that reflects the metabolic status of the cultures.

Agonist-selective endocytosis of mu opioid receptor by neurons in vivo.

Opiate alkaloids are potent analgesics that exert multiple pharmacological effects in the nervous system by activating G protein-coupled receptors. Receptor internalization upon stimulation may be important for desensitization and resensitization, which affect cellular responsiveness to ligands. Here, we investigated the agonist-induced internalization of the mu opioid receptor (MOR) in vivo by using the guinea pig ileum as a model system and immunohistochemistry with an affinity-purified antibody to the C terminus of rat MOR. Antibody specificity was confirmed by the positive staining of human embryonic kidney 293 cells transfected with epitope-tagged MOR cDNA, by the lack of staining of cells transfected with the delta or kappa receptor cDNA, and by the abolition of staining when the MOR antibody was preadsorbed with the MOR peptide fragment. Abundant MOR immunoreactivity (MOR-IR) was localized to the cell body, dendrites, and axonal processes of myenteric neurons. Immunostaining was primarily confined to the plasma membrane of cell bodies and processes. Within 15 min of an intraperitoneal injection of the opiate agonist etorphine, intense MOR-IR was present in vesicle-like structures, which were identified as endosomes by confocal microscopy. At 30 min, MOR-IR was throughout the cytoplasm and in perinuclear vesicles. MOR-IR was still internalized at 120 min. Agonist-induced endocytosis was completely inhibited by the opiate antagonist naloxone. Interestingly, morphine, a high-affinity MOR agonist, did not cause detectable internalization, but it partially inhibited the etorphine-induced MOR endocytosis. These results demonstrate the occurrence of agonist-selective MOR endocytosis in neurons naturally expressing this receptor in vivo and suggest the existence of different mechanisms regulating cellular responsiveness to ligands.

Structural basis for specificity and potency of a flavonoid inhibitor of human CDK2, a cell cycle kinase.

The central role of cyclin-dependent kinases (CDKs) in cell cycle regulation makes them a promising target for studying inhibitory molecules that can modify the degree of cell proliferation. The discovery of specific inhibitors of CDKs such as polyhydroxylated flavones has opened the way to investigation and design of antimitotic compounds. A novel flavone, (-)-cis-5,7-dihydroxyphenyl-8-[4-(3-hydroxy-1-methyl)piperidinyl] -4H-1-benzopyran-4-one hydrochloride hemihydrate (L868276), is a potent inhibitor of CDKs. A chlorinated form, flavopiridol, is currently in phase I clinical trials as a drug against breast tumors. We determined the crystal structure of a complex between CDK2 and L868276 at 2.33 angstroms resolution and refined to an Rfactor 20.3%. The aromatic portion of the inhibitor binds to the adenine-binding pocket of CDK2, and the position of the phenyl group of the inhibitor enables the inhibitor to make contacts with the enzyme not observed in the ATP complex structure. The analysis of the position of this phenyl ring not only explains the great differences of kinase inhibition among the flavonoid inhibitors but also explains the specificity of L868276 to inhibit CDK2 and CDC2.

Análise química e atividades biológicas de Guatteria elliptica R. E. Fries (Annonaceae)

A espécie endêmica G. elliptica R. E. Fries não apresentava estudos fitoquímicos e biológicos detalhados na literatura. Assim, o objetivo desse trabalho foi avaliar a composição química e as propriedades biológicas dos óleos essenciais, extratos brutos, alcaloides totais, tortas, frações das tortas, amostras isoladas dessa espécie. O material vegetal foi coletado em Paranapiacaba (Santo André, SP, Brasil). O óleo essencial extraído das folhas por destilação à vapor apresentou um rendimento de 0,2%. A análise histológica das folhas encontrou óleo em células oleíferas localizadas no parênquima esponjoso. A composição do óleo (CG-EM) indicou espatulenol e óxido de cariofileno como compostos majoritários. Os alcaloides totais foram obtidos dos extratos brutos das folhas e dos galhos e analisados por CG-EM, identificando quatro aporfinas (nornuciferina, estefarina, corituberina e asimilobina) e duas protoberberinas (discretamina e caseadina). Os alcaloides totais foram fracionados em coluna cromatográfica ou por Extração em Fase Sólida e purificados por cromatografia em camada preparativa, originando duas amostras (Amostra 9 e 10). Na Amostra 9, foram identificados dois alcaloides aporfinicos nornuciferina e asimilobina (CG-EM e RMN-1H). Na Amostra 10, foram identificados (LC-EM/EM) cinco alcaloides aporfínicos (desidronantenina, glaunidina, liriodenina, N-óxido de oliverina e telikovina) e um alcaloide protoberberínico (caseadina). Caseadina, glaunidina, N-óxido de oliverina e telikovina não foram previamente identificados em Guatteria. Os resíduos dos extratos brutos livres de alcaloides foram fracionados pelo método de partição com solventes de polaridade crescente. Os extratos brutos e as frações acetato de etila e butanólicas de folhas e galhos apresentaram flavonoides (NP-PEG). Nos ensaios biológicos, a melhor atividade antioxidante (sequestro do radical DPPH) foi encontrada para a fração clorofórmica dos galhos (EC50=24,25±1,14 µg/mL) e a torta dos galhos (EC50=26,23±4,20 µg/mL). No ensaio antimicrobiano pelo método turbidimétrico a atividade mais importante foi obtida contra Staphylococcus aureus (ATCC 6538) para os alcaloides totais dos galhos (CIM/CBM=0,12±0,01/0,26 mg/mL) e das folhas (CIM/CBM=0,21±0,01/0,28 mg/mL), e fração hexânica das folhas (CIM/CBM=0,24±0,02/>1 mg/mL). Uma alta atividade antitumoral foi observada frente a células humanas de mama (MCF-7) para Amostra 10 (IC50=2,28±0,18 µg/mL), fração de acetato de etila das folhas (IC50=4,47±0,40 µg/mL), óleo essencial (IC50=7,01±0,23 µg/mL) e os alcaloides totais das folhas (IC50=9,32±0,36 µg/mL). Para as células de próstata (PC-3), foi encontrada atividade para a Amostra 10 (IC50=1,37±0,36 µg/mL) e o óleo essencial (IC50=5,32±0,35 µg/mL). A futura aplicação dos extratos e frações de G. elliptica como um agente antitumoral parece ser segura, pois mantiveram uma viabilidade celular maior do que 90% no ensaio de citotoxicidade com culturas de fibroblasto murino (BALB/c 3T3, ATCC CCL-163) nas concentrações onde a atividade antitumoral foi promissora (<30 µg/mL) contra MCF-7 e/ou PC-3.

Vegetais minimamente processados prontos para o consumo: influência da etapa de desinfecção na inativação de Salmonella Typhimurium, na ocorrência da contaminação cruzada e na avaliação quantitativa de risco microbiológico em relação a este patógeno

Dados mundiais apontam haver uma associação entre o aumento do comércio de vegetais minimamente processados prontos para o consumo (VPC) e o aumento da ocorrência de surtos de enfermidades transmitidas por alimentos. Durante o processamento industrial de VPC, a desinfecção é a principal etapa de inativação de micro-organismos patogênicos presentes, mas nessa etapa também pode ocorrer contaminação cruzada, com transferência de contaminantes de produtos contaminados para não-contaminados. Neste trabalho, foram coletadas informações sobre as práticas empregadas na etapa de desinfecção em dez importantes indústrias produtoras de VPC no Estado de São Paulo, avaliando-se, em seguida, a influência dessas práticas na qualidade microbiológica dos produtos e na inativação de Salmonella Typhimurium, bem como na ocorrência de contaminação cruzada por este patógeno. Um modelo de avaliação quantitativa de risco microbiológico foi elaborado para estimar o impacto da contaminação cruzada durante a etapa de desinfecção no risco de infecção por Salmonella devido ao consumo de VPC. Observou-se que, em todas as indústrias visitadas, a desinfecção dos vegetais era feita com produtos à base de cloro em concentrações de 50 a 240 mg/L, que resultava em redução de até 1,2 log na carga microbiana dos vegetais que entravam na linha de processamento. Ao avaliar a influência das características da água de processamento (pH, temperatura, concentração de matéria orgânica e concentração de dicloroisocianurato de sódio) e do tempo de contato entre a água clorada e os vegetais na redução de Salmonella, observou-se que a concentração do produto à base de cloro foi o parâmetro que apresentou maior influência (p<0.05). Concentrações de dicloroisocianurato de sódio acima de 10 mg/L foram necessárias para controle da contaminação cruzada durante a etapa de lavagem. O modelo de avaliação de risco construído indicou quantitativamente haver uma relação entre a concentração de dicloroisocianurato de sódio na água de desinfecção e o risco de ocorrência de surtos causados por Salmonella em VPC. Cenários simulando uso de dicloroisocianurato de sódio em concentrações abaixo de 5 mg/L indicaram que mais de 96% dos casos preditos de infecção por Salmonella poderiam ser atribuídos à ocorrência de contaminação cruzada, enquanto que em cenários com concentrações acima de 50 mg/L, casos de infecção devidos à contaminação cruzada não foram preditos. Estes resultados mostram que o controle da qualidade da água e o monitoramento da concentração de sanitizante na etapa de desinfecção são essenciais para evitar a ocorrência de contaminação cruzada e garantir a produção de VPC seguros para o consumo.

Exposição a substâncias organocloradas em São Paulo: níveis séricos em doadores de sangue e fatores associados

A utilização de pesticidas organoclorados é motivo de preocupação das entidades ligadas à área de saúde em todo o mundo. Apesar de as formas de contaminação serem bem conhecidas, não há um controle eficaz na fiscalização do seu uso no Brasil. Sabe-se que altos níveis séricos destes compostos nos organismos de seres humanos e animais acarretam sérios problemas de saúde. Tendo em vista essa realidade, foi realizado, em 2009, o Projeto Piloto do I Inquérito Nacional de Populações Expostas a Substâncias Químicas, cujo subprojeto \"doadores de sangue\" teve como objetivo mensurar as concentrações de substâncias químicas no sangue de 547 residentes da região metropolitana de São Paulo, dentre elas os pesticidas organoclorados. Este trabalho teve como objetivos avaliar as concentrações dos pesticidas hexaclorobenzeno (HCB), alfa-HCH, ?-HCH, beta-HCH, beta-HCH, heptacloro, heptacloro epóxido, dieldrin, mirex, o,p\'-DDT, p,p\'-DDT, o,p\'-DDE, p,p\'-DDE, o,p\'-DDD e p,p\'-DDD nesta população e compará-las com as encontradas em outros países e determinar fatores associados aos níveis mais elevados destas substâncias. O método analítico utilizado foi de cromatografia a gás. Os resultados deste estudo indicam que a população adulta de São Paulo não está exposta a níveis preocupantes de pesticidas organoclorados, pois dentre os compostos analisados, apenas o beta-HCH e o p,p\'-DDE tiveram um número significante de amostras acima do limite de quantificação, 10,7% e 31,2% das amostras respectivamente. Quando utilizada a metade do limite de quantificação para substituir os valores abaixo do limite de quantificação do método, o valor médio encontrado para o beta-HCH foi de 0,028 ug/dL e para o p,p\'-DDE foi de 0,045 ug/dL. Este estudo propôs dois modelos multivariados para explicar os fatores associados aos compostos beta-HCH e p,p\'-DDE no sangue dos doadores. Segundo o modelo de Regressão Logística Ordinal Multivariado, os fatores associados a níveis mais altos de beta-HCH foram ter idade entre 26 e 45 anos e ser do sexo feminino. Para o p,p\'-DDE os fatores associados a níveis mais altos foram ter idade entre 26 e 45 anos, ser do sexo feminino e ter trabalhado com pesticidas, enquanto receber renda mensal de 3 a 5 salários mínimos e consumir derivados de origem animal uma ou mais vezes por semana foram associados a níveis mais baixos de p,p\'-DDE. Segundo o modelo de Regressão Linear Múltipla, os fatores associados a níveis mais altos de beta-HCH foram o sexo feminino, ter contato prévio com pesticidas na região agrícola, ter trabalhado com pesticidas em campanhas de saúde pública, ter trabalhado em empresas de capacitores ou transformadores, ter trabalhado em indústrias de solventes clorados, ter renda mensal de 3 a 5 salários mínimos, consumo de carnes uma ou duas vezes por semana e consumo de frutos do mar uma ou duas vezes por semana, enquanto consumo frequente de cerveja e ter renda mensal de 1 a 3 salários mínimos foram associado a níveis menores de beta-HCH. Já para o p,p\'-DDE, os fatores associados a níveis mais elevados foram ser do sexo feminino, ser não branco, ter trabalhado com pesticidas e consumir água de fontes que não sejam minerais ou de rede, enquanto o consumo frequente de bebidas alcoólicas foi associado a níveis mais baixos de p,p\'-DDE

Reduction of haloacetonitriles and haloacetones in natural waters using ceramic nanofiltration membranes

Póster presentado en 19th International Congress of Chemical and Process Engineering, Prague, Czech Republic August 28th-September 1st, 2010.

Biogeographical Patterns and Phenological Changes in Lapiedra martinezii Lag. Related to Its Alkaloid Diversity

The aim of this work was to investigate the alkaloid patterns of Lapiedra martinezii and their relation to biogeography and phenology focused in a phylogenetic comparison. Plants from 14 populations of L. martinezii, covering almost its entire distribution area, were subjected to morphological, ecological, and phytochemical analysis. Experiments for different alkaloid-type content are proposed as a new tool for analysis of plant distribution. Several plants were transplanted for weekly observation of their phenological changes, and alkaloids from different plant organs were extracted, listed, and compared. The alkaloid pattern of L. martinezii comprises 49 compounds of homolycorine, lycorine, tazettine, haemantamine, and narciclasine types. The populations located in the north and south margins of the distribution area displayed alkaloid patterns different from those of the central area. Changes in these patterns during their phenological cycle may be related to a better defence for plant reproduction. L. martinezii is an old relict plant, and it has maintained some of the more primitive morphological features and alkaloid profiles of the Mediterranean Amaryllidaceae. The variations in alkaloid content observed could be interpreted in a phylogenetic sense, and those found in their phenological changes, in an adaptive one.

Evolution of alkaloid biosynthesis in the genus Narcissus

In an attempt to reveal the relationships between alkaloid biosynthesis and phylogeny, we investigated by GC–MS the alkaloid patterns of 22 species and 3 hybrids (from 45 locations) from seven main sections of the genus Narcissus (Amaryllidaceae). The results indicate that the first alkaloids to evolve in the genus Narcissus were of the lycorine- and homolycorine-type. The alkaloid pattern of the Nevadensis section supports its recent separation from the Pseudonarcissus section. The plants of Narcissus pallidulus (Ganymedes section) show a predominance of Sceletium-type compounds, which are quite rare in the Amaryllidaceae family. Two successful evolutionary strategies involving alkaloid biosynthesis and leading to an expansion in taxa and occupied area were determined. Firstly, a diversification of alkaloid patterns and a high alkaloid concentration in the organs of the large Narcissus species (in the Pseudonarcissus section) resulted in an improved chemical defence in diverse habitats. Secondly, both plant size and alkaloid biosynthesis were reduced (in the Bulbocodium and Apodanthi sections) relegated to dry pastures and rocky places.

Decomposition of two types of electric wires considering the effect of the metal in the production of pollutants

Combustion runs at 700 °C in a horizontal laboratory furnace were carried out on two different electric wires (PVC and halogen-free wire). Tests were performed in the presence and in the absence of the metal conductor of the wires. The analyses of the polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs), chlorobenzenes (CBzs), chlorophenols (CPhs), mono- to octa-chlorodibenzo-p-dioxin and dibenzofurans (PCDD/Fs), and dioxin-like PCBs are shown. Regarding semivolatile compounds, PAHs production decreases in the presence of metal, while a higher amount of chlorinated compounds are emitted. Respect to the PCDD/Fs, the PVC wire in the presence of metal presents the highest emission, with a much more emission of furans than dioxins. The maximum emission is with 2 or 3 chlorine atom PCDD/Fs. PCBs emission correlates with PCDD/F production and represents 3–4% of total toxicity, determined by using WHO2005 factors.

Tratamiento de lixiviados de residuos de origen urbano mediante MBR

Se ha utilizado una planta de tratamiento a escala laboratorio consiste en un biorreactor de membrana (MBR). Esta planta está compuesta por un reactor biológico de 25 L de capacidad. Se utilizó una membrana plana de micro filtración marca Kubota de polietileno clorado, tamaño de poro 0,1 μm y área de filtración 0.116 m2. Se utilizaron como condiciones de operación: tiempo de residencia hidráulico 3 días, caudal de permeado 0.35 L/h y LMH 3 L/m2h. Se ha podido comprobar que es posible adaptar una población microbiológica a las particulares características químicas del lixiviado procedente de la planta y tratar estos lixiviados en un reactor biológico de membrana sumergida operando en condiciones habituales de sólidos en suspensión en el reactor entre 8-12 g/L durante un periodo de 6 meses. El proceso utilizado permite reducir la materia orgánica (97% DBO5 y 40% DQO) presente en estas corrientes residuales, agotando prácticamente toda la materia biodegradable. Respecto a los contenidos de nutrientes, el tratamiento MBR ensayado permite reducir de 35-40% el nitrógeno total, 45-50% el nitrógeno amoniacal y un 65-70% el fósforo total. Los sólidos en suspensión se han reducido en el efluente tratado en más de un 99%.

Kinetic Analysis and Pollutant Evolution During Thermal Degradation of Printed Circuit Boards Considering the Effect of Metals

Paper submitted to the 7th International Symposium on Feedstock Recycling of Polymeric Materials (7th ISFR 2013), New Delhi, India, 23-26 October 2013.

Thermogravimetric Study of the Decomposition of Printed Circuit Boards from Mobile Phones

Paper submitted to the 19th International Symposium on Analytical & Applied Pyrolysis, Linz, Austria, 21-25 May 2012.