Genetic purity certificate in seeds of hybrid maize using molecular markers

One of the main features that confer high quality to the seed is its genetic purity, in which one of the major causes of contamination is the self-pollination of the female parent. Up to date, there is no accurate and fast methods for detecting such contamination. Thus, this work was carried out to certify the genetic purity in seeds of hybrid maize using different biochemical and DNA-based markers. Two single-cross hybrids and their parental lines derived from the maize breeding program at UFLA were evaluated by isoenzymatic pattern of alcohol dehydrogenase (ADH), esterase (EST), acid phosphatase (ACP), glutamate-oxaloacetate transaminase (GOT), malate dehydrogenase (MDH), isocitrate dehydrogenase (IDH), phosphoglucomutase (PGM), 6-phosphoglucomate dehydrogenase (PGDH), catalase (CAT) and ß-glucosidade (ßGLU) and by microsatellites markers. The enzymatic systems that were able to distinguish the hybrids from their parental line were the catalase, the isocitrate dehydrogenase and the esterase. The esterase showed a Mendelian segregation pattern for UFLA 8/3 hybrid, that enables a safer genetic purity certificate. Microsatellites were able to differentiate the hybrid lines and the respective parental lines. Moreover, this technique was fast, precise and without environment effects. For microsatellites, the amplification pattern was identical when young leaves or seeds were used as DNA source. The possibility of using seeds as DNA source would accelerate and facilitate the role process of the genetic purity analysis.

Effects of dietary restraint and oral contraceptives on bone strength and bone turnover in young women

ABSTRACT Introduction The purpose of this study was to assess specific osteoporosis-related health behaviours and physiological outcomes including daily calcium intake, physical activity levels, bone strength, as assessed by quantitative ultrasound, and bone turnover among women between the ages of 18 and 25. Respective differences on relevant study variables, based on dietary restraint and oral contraceptive use were also examined. Methods One hundred women (20.6 ± 0.2 years of age) volunteered to participate in the study. Informed written consent was obtained by all subjects prior to participation. The study and all related procedures were approved by the Brock University Research Ethics Board. Body mass, height, relative body fat, as well as chest, waist and hip circumferences were measured using standard procedures. The 10-item restrained eating subscale of the Dutch Eating Behaviour Questionnaire (DEBQ) was used to assess dietary restraint (van Strien et al., 1986). Daily calcium intake was assessed by the Rapid Assessment Method (RAM) (Hertzler & Frary 1994). Weekly physical activity was documented by the 4-item Godin Leisure-Time Exercise Questionnaire (Godin & Shephard 1985). Bone strength was determined from the speed of sound (SOS) as measured by QUS (Sunlight 7000S). SOS measurements (m/s) were taken of the dominant and non-dominant sides of the distal one third of the radius and the mid-shaft of the tibia. Resting blood samples were collected from all subjects between 9am and 12pm, in order to evaluate the impact of lifestyle factors on biochemical markers of bone turnover. Blood was collected during the early follicular phase of the menstrual cycle (approximately days 1-5) for all subjects. Samples were centrifliged and the serum or plasma was aliquoted into separate tubes and stored at -80°C until analysis. The bone formation markers measured were Osteocalcin (OC), bone specific alkaline phosphatase (BAP) and 25-OH vitamin D. The bone resorption markers measured were the carboxy (CTx) and amino (NTx) terminal telopeptides of type-I collagen crosslinks. All markers were assessed by ELISA. Subjects were divided into high (HDR) and low dietary restrainers (LDR) based on the median DEBQ score, and also into users (BC) and non-users (nBC) of oral contraceptives. A series of multiple one way ANOVA's were then conducted to identify differences between each set of groups for all relevant variables. A two-way ANOVA analysis was used to explore significant interactions between dietary restraint and use of oral contraceptives while a univariate follow-up analysis was also performed when appropriate. Pearson Product Moment Correlations were used to determine relationships among study variables. Results HDR had significantly higher BMI, %BF and circumference measures but lower daily calcium intake than LDR. There were no significant differences in physical activity levels between HDR and LDR. No significant differences were found between BC and nBC in body composition, calcium intake and physical activity. HDR had significantly lower tibial SOS scores than LDR in both the dominant and non-dominant sites. The post-hoc analysis showed that within the non-birth control group, the HDR had significantly lower tibial SOS scores of bone strength when compared to the LDR but Aere were no significant differences found between the two dietary restraint groups for those currently on birth control. HDR had significantly lower levels of OC than LDR and the BC group had lower levels of BAP than the nBC group. Consistently, the follow-up analysis revealed that within those not on birth control, subjects who were classified as HDR had significantly (f*<0.05) lower levels of OC when compared with LDR but no significant differences were observed in bone turnover between the two dietary restraint groups for those currently on birth control. Physical activity was not correlated with SOS scores and bone turnover markers possibly due to the low physical activity variability in this group of women. Conclusion This is the first study to examine the effects of dietary restraint on bone strength and turnover among this population of women. The most important finding of this study was that bone strength and turnover are negatively influenced by dietary restraint independent of relative body fat. In general, the results of the present thesis suggest that dietary restraint, oral contraceptive use, as well as low daily calcium intake and low physical activity levels were widespread behaviours among this population of college-aged women. The young women who were using dietary restraint as a strategy to lose weight, and thus were in the HDR group, despite their higher relative body fat and weight, had lower scores of bone strength and lower levels of markers of bone turnover compared to the low dietary restrainers. Additionally, bone turnover seemed to be negatively affected by oral contraceptives, while bone strength, as assessed by QUS, seemed unaffected by their use in this population of young women. Physical activity (weekly energy expenditure), on the other hand, was not associated with either bone strength or bone tiimover possibly due to the low variability of this variable in this population of young Canadian women.

A biochemical predictor of performance during mesophilic anaerobic fermentation of starch wastewater

The aim of this study was to determine the potential of biochemical parameters, such as enzyme activity and adenosine triphosphate (ATP) levels, as monitors of process performance in the Upflow Anaerobic Sludge Blanket (UASB) reactor utilizing a starch wastewater. The acid and alkaline phosphatase activity and the ATP content of the UASB sludge were measured in response to changes in flow rate and nutrient loading. Conventional parameters of process performance, such as gas production, acetic acid production, COD, phosphorus, nitrogen and suspended solids loadings and % COD removal were also monitored. The response of both biochemical and conventional parameters to changing process conditions was then compared. Alkaline phosphatase activity exhibited the highest activity over the entire study perioda A high suspended solids loading was observed to upset the system in terms of gas production, acetic acid production and % COD removala The initial rate of increase in alkaline phosphatase activity following an increase in loading was four times as great during process upset than under conditions of good performance. The change in enzyme actiVity was also more sensitive to process upset than changes in acetic acid production. The change in ATP content of the sludge with time suggested that enzyme actiVity was changing independently of the actual viable biomass present. The bacterial composition of the anaerobic sludge granules was similar to that of other sludge bed systems, at the light and scanning electron microscope level. Isolated serum bottle cultures produced several acids involved in anaerobic carbohydrate metabolism. The overall performance of the UASB system indicated that higher loadings of soluble nutrients could have been tolerated by the system.

Sediment genotoxicity and its relationship to the frequency of chironomid labial plate deformities

Sediment samples were taken from seven locations in the WeIland River in December 1986 and April 1987. The DMSO extracts of these sediment samples showed a significant (pphosphatase inhib_ii~ion component of the 50S chromotest analyses. The toxicity of these samples was only evident once they had been activated by the 59 (liver extract) mixture.

THE ACUTE EFFECTS OF A SINGLE SESSION OF PLYOMETRIC EXERCISE ON MARKERS OF BONE TURNOVER IN BOYS AND MEN

The study objective was to compare the response of bone markers to an exercise session consisting of high mechanical loading (144 jumps) between boys (n=12, 10.2 ± 0.4 years) and men (n=18, 22.5 ± 0.7 years). Blood samples were collected at pre-, 5, 60 minutes post-, and 24 hours post-exercise) to measure bone-specific alkaline phosphatase (BAP), amino-terminal cross-linking telopeptide (NTx), osteoprotegrin (OPG) and receptor activator of nuclear factor kb ligand (RANKL). Boys had higher BAP levels at all time points, with an increase 24 hours post-exercise. No such increase was observed in men. Likewise, NTx levels were higher in boys, with a greater increase over time than in men. OPG and RANKL levels were similar in boys and men at all times. In summary, even one session of exercise stimulates bone turnover, as reflected in the increase in both BAP and NTx, in boys (but not men) within 24 hours.

Rooibos tea flavonoids increase mineral content in human osteoblast-like cells

Some cross-sectional and prospective studies have demonstrated a positive correlation between habitual tea consumption and bone mineral density in post-menopausal women. Rooibos tea contains no caffeine and is a rich source of flavonoids such as rutin, orientin, hyperoside and luteolin. These flavonoids have similar structures to estradiol, and therefore may act as estrogen mimics to promote favourable outcomes in bone. The overall objective of this research was to identify flavonoids that could enhance mineral content in human osteoblast Saos2 cells. Mineral was quantified by alizarin red staining and characterized by quantifying alkaline phosphatase (ALP) activity, cell mitochondria activity and toxicity, in addition to changes in regulatory markers of osteoblastic activity. Rutin (≥50μM), hyperoside (≥5.0μM), orientin (0.1μM-1.0μM, 15μM-100μM) and luteolin (5.0μM) enhanced mineral content. This was in part due to elevated ALP and mitochondrial activity, and lower toxicity, pro-inflammatory cytokines, and Wnt inhibitors.

Étude des récepteurs aux estrogènes dans les ostéoblastes de patients atteints de Scoliose Idiopathique de l'Adolescent

Plusieurs éléments de la pathogenèse de la scoliose idiopathique de l’adolescent indiquent que les estrogènes pourraient intervenir dans le développement et la progression de cette maladie. Ce projet avait donc pour but d’explorer l’expression et la fonctionnalité des récepteurs aux estrogènes ERα et ERβ ainsi que leurs isoformes dans les ostéoblastes de patients scoliotiques et sains. L’induction des gènes de facteurs influençant la minéralisation et la différenciation des ostéoblastes par les estrogènes a également été étudié. Par immunofluorescence, nous avons remarqué une augmentation de la présence protéique de ERβ dans les ostéoblastes de patients SIA comparé aux sujets contrôles. Les récepteurs aux estrogènes provenant des ostéoblastes des patients sont fonctionnels tout comme ceux des contrôles et aucune différence dans l'interaction ADN-protéine n’a été observée. Il y a également une augmentation de l’expression génique de l’ostéopontine, l’ostéocalcine, le collagène de type I, la phosphatase alkaline et BMP2 dans les ostéoblastes des patients SIA. Un début de minéralisation in vitro a été observé dans les ostéoblastes de patients SIA et contrôles. ERα et ERβ sont présents et fonctionnels dans les ostéoblastes des patients SIA et sains. Leur expression est variable, mais ces variations existent chez les patients SIA et les contrôles. L’implication des estrogènes dans la SIA ne serait donc pas au niveau des récepteurs aux estrogènes mais au niveau de l’interactions des estrogènes avec d’autres facteurs étiologiques tels que la mélatonine, la formation/résorption osseuse ou autres facteurs neuro-endocriniens.

Le rôle de la leptine dans le métabolisme anormal des ostéoblastes de patients atteints d’ostéoarthrose

L’ostéoarthrose (OA) est une pathologie qui touche les articulations principalement chez les personnes âgées. Il devient capital de mieux cerner cette pathologie à cause des coûts économiques qu’elle engendre mais surtout à cause du vieillissement de la population. Cette maladie se caractérise par une dégradation du cartilage articulaire, une sclérose osseuse, une inflammation de la membrane synoviale ainsi que la présence d’ostéophytes. L’étiologie de cette pathologie est restée nébuleuse car la recherche sur la maladie touchait principalement le cartilage articulaire. Toutefois, le rôle clé de l’os sous-chondral dans l’OA est maintenant reconnu. L’obésité étant un facteur de risque de l’OA, nous avons émis l’hypothèse que la leptine, une adipocytokine clé dans l’obésité, joue un rôle important dans l’OA. En effet, la leptine modifie le phénotype des ostéoblastes (Ob) normaux humain et puisque les Ob OA humains ont un phénotype altéré, notre objectif était de déterminer le rôle potentiel de la leptine dans ces cellules. Pour ce faire, nous avons préparé des cultures primaires d’Ob issus de la plaque sous-chondral du plateau tibial de patients OA et d’individus normaux (N). L’expression de la leptine et de son récepteur actif (OB-Rb) ont été mesurées par RT-PCR en temps réel, et leur production a été mesurée par ELISA et immunobuvardage (IB). La prolifération des Ob OA a été déterminée par incorporation de BrdU. La phosphorylation de p42/44 MAPK dans les Ob OA a été déterminée par IB. Le phénotype des Ob fut déterminé par la mesure de l’activité de la phosphatase alcaline (ALP) et la sécrétion d’ostéocalcine (OC), en présence ou non de leptine. De plus, les effets des ARNs d’interférences (SiRNA) anti-leptine et anti OB-Rb sur le phénotype des Ob OA furent déterminés via leur impact sur l’activité de l’ALP et sur la sécrétion d’OC. L’effet dose-réponse de la leptine sur les expressions d’OB-Rb, du facteur de croissance TGF-1 ou encore sur sa propre expression furent déterminées par RT-PCR en temps réel. Pour terminer, la signalisation de la leptine a été étudiée en évaluant l’effet dose réponse de celle-ci sur la production des protéines JAK2 et STAT3 phosphorylées par IB. Les résultats obtenus ont montrés que les Ob OA expriment et produisent plus de leptine que les Ob N. Au niveau phénotypique, ces Ob OA possèdent une activité de l’ALP ainsi qu’une sécrétion d’OC plus importante que celles observées chez les Ob N. L’ajout d’anticorps inactivant l’interaction leptine et OB-Rb ou d’inhibiteurs chimiques comme tyrphostin ou piceatannol diminuèrent l’activité de l’ALP ainsi que la sécrétion d’OC dans les Ob OA. Par contre, l’ajout de leptine exogène aux Ob OA augmenta l’activité de l’ALP sans pour autant faire varier la sécrétion d’OC. La leptine à des doses de 1ng/ml à 10mg/ml stimula la prolifération des Ob OA ainsi que la phosphorylation de p42/44 MAPK. La leptine exogène diminua l’expression de TFG-1 tandis qu’elle stimula la phosphorylation de JAK2 et STAT3 ou encore sa propre expression de manière dose-dépendante. Cependant, l’expression d’OB-Rb diminua de manière dose-dépendante. Enfin, le traitement des Ob OA avec des Si leptine ou Si OB-Rb diminua l’activité d’ALP, la sécrétion d’OC, l’expression de la leptine, l’expression d’OB-RB ainsi que l’expression du facteur TGF-1. L’ensemble de ces données démontre que la leptine endogène des Ob OA est sous contrôle des facteurs de croissance et qu’elle contribue à maintenir le phénotype anormal de l’os sous-chondral OA. De plus, ceci suggère que la leptine serait un acteur important dans la régulation du remodelage osseux.

La néoglucogenèse rénale : un nouvel aspect dans la restriction de croissance intra-utérine chez le rat

Bien que l’environnement intra-utérin défavorable soit associé à des conditions pathologiques à l’âge adulte, les mécanismes mis en place in utero ne sont pas encore élucidés. Nous avons établi un modèle de restriction de croissance intra-utérine (RCIU) en donnant une diète faible en sodium à la rate pendant la dernière semaine de gestation. Ce modèle se caractérise par une diminution de perfusion placentaire et une redistribution du flot sanguin, favorisant l’irrigation des organes nobles (cœur et cerveau) au détriment du rein fœtal. De plus, l’expression rénale du facteur de croissance endothéliale vasculaire (VEGF) est diminuée chez le fœtus. L’hypothèse de travail est que la néoglucogenèse hépatique et rénale augmente chez les fœtus RCIU afin de compenser la diminution de perfusion placentaire, et que l’expression rénale des récepteurs de VEGF (Flt-1 et Flk-1) est altérée à la suite de la redistribution du flot sanguin. Nos objectifs étaient de comparer l’expression protéique des enzymes de la néoglucogenèse et des récepteurs de VEGF entre les fœtus témoins et RCIU. L’aldolase B, la fructose-1,6-biphosphatase et la glucose-6-phosphatase augmentent dans les reins de fœtus RCIU par rapport aux témoins alors qu’aucun changement n’est observé dans le foie. De plus, l’expression de ces enzymes est différente selon le sexe du fœtus. Une diminution de Flt-1 est notée dans les reins de fœtus RCIU. Nos résultats démontrent que des adaptations surviennent chez le fœtus à la suite d’une insulte intra-utérine favorisant sa survie mais ayant des conséquences telles que la dysfonction rénale observée chez les adultes de ce modèle animal. À long terme, ces travaux pourront permettre d’entrevoir des avenues pour mieux identifier les approches de prévention lors de naissance à la suite d’une RCIU.

Mécanisme d’action du PBI-1402 impliqué dans l’expansion des progéniteurs érythroïdes humains et murins

Une des complications importantes d’un traitement intensif de chimio/radio-thérapie est l’aplasie de la moelle osseuse qui peut persister longtemps même après une greffe de cellules souches. Le PBI-1402 est un petit lipide qui a été associé à la diminution de l’apoptose des neutrophiles induite par des agents cytotoxiques. Nos travaux ont démontré que la culture in vitro de progéniteurs hématopoiétiques humains en présence de PBI-1402 induit une augmentation significative du nombre de progéniteurs érythroides (PEryth) (p<0,05). En évaluant la sensibilité des PEryth à l’érythropoietine (Epo), nous avons démontré que le PBI-1402 n’a pas d’effet sensibilisateur et que les cellules répondent de façon similaire aux cellules contrôles. De plus, la combinaison de l’Epo et du « stem cell factor » avec le PBI-1402 permet de prolonger et d’augmenter l’activation d’ERK1/2 (p<0,05), un important signal mitogène. Cet effet est associé à une inhibition de l’activation de la phosphatase MKP-1 dans les cellules exposées au PBI-1402. Nous démontrons aussi la capacité du PBI-1402 à amplifier la prolifération des PEryth et sa capacité à réduire la durée et l’intensité de l’anémie dans un modèle in vivo murin. Des souris ayant reçu une dose létale d’irradiation et subi une transplantation syngénique de moelle osseuse, ont été traitées oralement avec le PBI-1402 pendant 14 jours. Ces souris démontrent une réduction significative de l’anémie post-transplantation versus les souris contrôle (p<0,05). De plus, la moelle osseuse des souris traitées au PBI-1402 présente un nombre de BFU-E et CFU-E plus élevé comparativement au contrôle. Ces résultats démontrent donc le potentiel du PBI-1402 à réduire l’anémie post-transplantation et accélérer la reconstitution érythroïde.

Molecular mechanisms for a switch-like mating decision in Saccharomyces cerevisiae

Les changements évolutifs nous instruisent sur les nombreuses innovations permettant à chaque organisme de maximiser ses aptitudes en choisissant le partenaire approprié, telles que les caractéristiques sexuelles secondaires, les patrons comportementaux, les attractifs chimiques et les mécanismes sensoriels y répondant. L'haploïde de la levure Saccharomyces cerevisiae distingue son partenaire en interprétant le gradient de la concentration d'une phéromone sécrétée par les partenaires potentiels grâce à un réseau de protéines signalétiques de type kinase activées par la mitose (MAPK). La décision de la liaison sexuelle chez la levure est un événement en "tout–ourien", à la manière d'un interrupteur. Les cellules haploïdes choisissent leur partenaire sexuel en fonction de la concentration de phéromones qu’il produit. Seul le partenaire à proximité sécrétant des concentrations de phéromones égales ou supérieures à une concentration critique est retenu. Les faibles signaux de phéromones sont attribués à des partenaires pouvant mener à des accouplements infructueux. Notre compréhension du mécanisme moléculaire contrôlant cet interrupteur de la décision d'accouplement reste encore mince. Dans le cadre de la présente thèse, je démontre que le mécanisme de décision de la liaison sexuelle provient de la compétition pour le contrôle de l'état de phosphorylation de quatre sites sur la protéine d'échafaudage Ste5, entre la MAPK, Fus3, et la phosphatase,Ptc1. Cette compétition résulte en la dissociation de type « intérupteur » entre Fus3 et Ste5, nécessaire à la prise de décision d'accouplement en "tout-ou-rien". Ainsi, la décision de la liaison sexuelle s'effectue à une étape précoce de la voie de réponse aux phéromones et se produit rapidement, peut-être dans le but de prévenir la perte d’un partenaire potentiel. Nous argumentons que l'architecture du circuit Fus3-Ste5-Ptc1 génère un mécanisme inédit d'ultrasensibilité, ressemblant à "l'ultrasensibilité d'ordre zéro", qui résiste aux variations de concentration de ces protéines. Cette robustesse assure que l'accouplement puisse se produire en dépit de la stochasticité cellulaire ou de variations génétiques entre individus.Je démontre, par la suite, qu'un évènement précoce en réponse aux signaux extracellulaires recrutant Ste5 à la membrane plasmique est également ultrasensible à l'augmentation de la concentration de phéromones et que cette ultrasensibilité est engendrée par la déphosphorylation de huit phosphosites en N-terminal sur Ste5 par la phosphatase Ptc1 lorsqu'elle est associée à Ste5 via la protéine polarisante, Bem1. L'interférence dans ce mécanisme provoque une perte de l'ultrasensibilité et réduit, du même coup, l'amplitude et la fidélité de la voie de réponse aux phéromones à la stimulation. Ces changements se reflètent en une réduction de la fidélité et de la précision de la morphologie attribuable à la réponse d'accouplement. La polarisation dans l'assemblage du complexe protéique à la surface de la membrane plasmique est un thème général persistant dans tous les organismes, de la bactérie à l'humain. Un tel complexe est en mesure d'accroître l'efficacité, la fidélité et la spécificité de la transmission du signal. L'ensemble de nos découvertes démontre que l'ultrasensibilité, la précision et la robustesse de la réponse aux phéromones découlent de la régulation de la phosphorylation stoichiométrique de deux groupes de phosphosites sur Ste5, par la phosphatase Ptc1, un groupe effectuant le recrutement ultrasensible de Ste5 à la membrane et un autre incitant la dissociation et l'activation ultrasensible de la MAPK terminal Fus3. Le rôle modulateur de Ste5 dans la décision de la destinée cellulaire étend le répertoire fonctionnel des protéines d'échafaudage bien au-delà de l'accessoire dans la spécificité et l'efficacité des traitements de l'information. La régulation de la dynamique des caractères signal-réponse à travers une telle régulation modulaire des groupes de phosphosites sur des protéines d'échafaudage combinées à l'assemblage à la membrane peut être un moyen général par lequel la polarisation du destin cellulaire est obtenue. Des mécanismes similaires peuvent contrôler les décisions cellulaires dans les organismes complexes et peuvent être compromis dans des dérèglements cellulaires, tel que le cancer. Finalement, sur un thème relié, je présente la découverte d'un nouveau mécanisme où le seuil de la concentration de phéromones est contrôlé par une voie sensorielle de nutriments, ajustant, de cette manière, le point prédéterminé dans lequel la quantité et la qualité des nutriments accessibles dans l'environnement déterminent le seuil à partir duquel la levure s'accouple. La sous-unité régulatrice de la kinase à protéine A (PKA),Bcy1, une composante clé du réseau signalétique du senseur aux nutriments, interagit directement avec la sous-unité α des petites protéines G, Gpa1, le premier effecteur dans le réseau de réponse aux phéromones. L'interaction Bcy1-Gpa1 est accrue lorsque la cellule croit en présence d'un sucre idéal, le glucose, diminuant la concentration seuil auquel la décision d'accouplement est activée. Compromettre l'interaction Bcy1-Gpa1 ou inactiver Bcy1 accroît la concentration seuil nécessaire à une réponse aux phéromones. Nous argumentons qu'en ajustant leur sensibilité, les levures peuvent intégrer le stimulus provenant des phéromones au niveau du glucose extracellulaire, priorisant la décision de survie dans un milieu pauvre ou continuer leur cycle sexuel en choisissant un accouplement.

Rôles et régulation du PI(4,5)P2 dans le remodelage cortical et la morphogénèse cellulaire en mitose

Doctorat réalisé en cotutelle avec le laboratoire de François Payre au Centre de Biologie du Développement à Toulouse, France (Université de Toulouse III - Paul Sabatier)

Réparation par excision de nucléotides des dommages induits par rayons ultraviolets dans les mélanomes humains

Les mélanomes malins (MM) constituent le deuxième type de cancer le plus fréquent chez les jeunes adultes canadiens (entre 20 et 44 ans) ainsi qu’un des rares cancers dont l’incidence augmente annuellement. À moins que les MM ne soient excisés à temps par chirurgie, les chances de survie des patients sont pratiquement nulles puisque ce type de tumeur est très réfractaire aux traitements conventionnels. Il est bien connu que l’exposition aux rayons ultraviolets (UV), induisant des photoproduits génotoxiques, est une déterminante majeure dans l’acquisition de MM. À cet effet, la réparation par excision de nucléotides (NER) est la ligne de défense principale contre le développement des mélanomes puisqu’elle est la voie de réparation prépondérante en ce qui a trait aux dits photoproduits. Malgré cela, la contribution potentielle de défauts de la NER au développement des MM dans la population normale n’est toujours pas bien établie. Notre laboratoire a précédemment développé une méthode basée sur la cytométrie de flux qui permet de mesurer la NER en fonction du cycle cellulaire. Cette méthode a déjà mise en évidence qu’une déficience de l’activité de la protéine ATR peut mener à une déficience de la NER exclusive à la phase S dans des fibroblastes humains. Pareillement, nous avons démontré que plusieurs lignées cellulaires cancéreuses modèles comportent une déficience en NER en phase S, suggérant qu’une telle déficience puisse caractériser certains types de cancers. Nous avons voulu savoir si une déficience en NER en phase S pouvait être associée à une proportion significative de mélanomes et si le tout pouvait être attribuable à une diminution de l’activité d’ATR. Nos objectifs ont donc été de : (i) mesurer l’efficacité de la NER en fonction du cycle cellulaire dans les MM en comparaison avec les mélanocytes primaires, (ii) vérifier si le niveau d’activité d’ATR corrèle avec l’efficacité de la NER en phase S dans les lignées de MM et (iii) voir si un gène fréquemment muté dans les mélanomes (tels PTEN et BRAF) pouvait coopérer avec ATR pour réguler la NER en phase S dans les mélanomes. Nous avons démontré que 13 lignées de MM sur 16 ont une capacité grandement diminuée à réparer les photoproduits induits par UV spécifiquement en phase S. De plus, cette déficience corrèle fortement avec une réduction de l’activation d’ATR et, dans plusieurs lignées de MM, avec une phosphorylation d’Akt plus importante. L’utilisation d’ARN interférent ou d’un inhibiteur du suppresseur de tumeurs PTEN, a permis, en plus d’augmenter la phosphorylation d’Akt, de réduire la réparation des photoproduits et l’activation d’ATR dans les cellules en phase S. En addition, (i) l’expression ectopique de la protéine PTEN sauvage dans des lignées déficientes en PTEN (mais pas d’une protéine PTEN sans activité phosphatase) ou (ii) l’inhibition pharmacologique d’Akt a permis d’augmenter la réparation en phase S ainsi que l’activation d’ATR. En somme, cette étude démontre qu’une signalisation d’ATR dépendante de PTEN/Akt amenant à une réparation déficiente des photoproduits génomiques causés par les UV en phase S peut être déterminante dans le développement des mélanomes induits par UV.

Modulation de l'expression et de l'activité de la NADPH P450 réductase chez le lapin.

L’activité catalytique du cytochrome P450 dépend de la disponibilité d’électrons produits par la NADPH P450 réductase (NPR). Notre étude a pour but de déterminer comment l’expression de la NPR est modulée chez le lapin. Afin de comprendre comment l’expression de la NPR est modulée, des hépatocytes de lapins témoins ont été incubés pendant 2, 4, 24 et 48 heures en présence de plusieurs activateurs de facteurs de transcription connus du cytochrome P450. De plus, des lapins ayant reçu une injection sous-cutanée de térébenthine afin de produire une réaction inflammatoire aseptique sont sacrifiés 48 heures plus tard dans le but d’étudier les effets de l’inflammation sur l’expression de la NPR. La rosiglitazone, le fénofibrate, l’acétate de plomb et le chlorure de cobalt (des inducteurs des PPAR, PPAR, AP-1 et HIF-1), après 48 heures d’incubation, n’ont provoqué aucun changement d’expression ou d’activité de la NPR. Après 48 heures d’incubation, la dexaméthasone (Dexa) a augmenté la quantité d’ARNm (QT-PCR), l’expression et l’activité de la NPR (p<0,05), en plus d’augmenter l’ARNm des récepteurs nucléaires CAR (récepteur constitutif à l’androstane) et PXR (récepteur X prégnane) (p<0.05). Le phénobarbital (PB) a augmenté seulement l’activité de la NPR (p<0.05). Par contre, après 48 heures d’incubation, la combinaison PB et Dexa a augmenté la quantité d’ARNm, ainsi que l’expression et l’activité de la NPR (p<0.05). La combinaison de PB et Dexa a induit une augmentation d’ARNm des récepteurs nucléaires CAR, PXR et RXR (récepteur X du rétinoïde) plus précocement, soit après 2 heures d’incubation (p<0.05). Le PD098059 (PD), un bloqueur de l’activation de MAPK1 (mitogen-activated protein kinase), et l’acide okadaïque (OA), un inhibiteur de la protéine phosphatase 2A (PP2A), ont bloqué l'augmentation d'expression et d'activité de la NPR induite par le PB après 48 heures d’incubation. La réaction inflammatoire aseptique a diminué l’expression et l’activité de la NPR après 48 heures d’incubation (p<0.05). On conclue que la dexaméthasone et le phénobarbital sont des inducteurs potentiels de la NPR et que les voies de signalisation de CAR, PXR et RXR semblent être impliquées dans le contrôle de cette induction. Des études supplémentaires devront être complétées afin de confirmer ces résultats préliminaires.

Investigating the role of the isomerase Rrd1/PTPA : from yeast to human

Chez Saccharomyces cerevisiae, les souches mutantes pour Rrd1, une protéine qui possède une activité de peptidyl prolyl cis/trans isomérase, montrent une résistance marquée à la rapamycine et sont sensibles au 4-nitroquinoline 1-oxide, un agent causant des dommages à l’ADN. PTPA, l’homologue de Rrd1 chez les mammifères, est reconnu en tant qu’activateur de protéine phosphatase 2A. Notre laboratoire a précédemment démontré que la surexpression de PTPA mène à l’apoptose de façon indépendante des protéines phosphatase 2A. La fonction moléculaire de Rrd1/PTPA était encore largement inconnue au départ de mon projet de doctorat. Mes recherches ont d’abord montré que Rrd1 est associé à la chromatine ainsi qu’à l’ARN polymérase II. L’analyse in vitro et in vivo par dichroïsme circulaire a révélé que Rrd1 est responsable de changements au niveau de la structure du domaine C-terminal de la grande sous-unité de l’ARN polymérase II, Rpb1, en réponse à la rapamycine et au 4-nitroquinoline 1-oxide. Nous avons également démontré que Rrd1 est requis pour modifier l’occupation de l’ARN polymérase II sur des gènes répondant à un traitement à la rapamycine. Finalement, nous avons montré que suite à un traitement avec la rapamycine, Rrd1 médie la dégradation de l’ARN polymérase II et que ce mécanisme est indépendant de l’ubiquitine. La dernière partie de mon projet était d’acquérir une meilleure connaissance de la fonction de PTPA, l’homologue de Rrd1 chez les mammifères. Nos résultats montrent que le «knockdown» de PTPA n’affecte pas la sensibilité des cellules à différentes drogues telles que la rapamycine, le 4-nitroquinoline 1-oxide ou le peroxyde d’hydrogène (H2O2). Nous avons également tenté d’identifier des partenaires protéiques pour PTPA grâce à la méthode TAP, mais nous ne sommes pas parvenus à identifier de partenaires stables. Nous avons démontré que la surexpression de la protéine PTPA catalytiquement inactive n’induisait pas l’apoptose indiquant que l’activité de PTPA est requise pour produire cet effet. Finalement, nous avons tenté d’étudier PTPA dans un modèle de souris. Dans un premier lieu, nous avons déterminé que PTPA était exprimé surtout au niveau des tissus suivants : la moelle osseuse, le thymus et le cerveau. Nous avons également généré avec succès plusieurs souris chimères dans le but de créer une souris «knockout» pour PTPA, mais l’allèle mutante ne s’est pas transférée au niveau des cellules germinales. Mes résultats ainsi que ceux obtenus par mon laboratoire sur la levure suggèrent un rôle général pour Rrd1 au niveau de la régulation des gènes. La question demeure toujours toutefois à savoir si PTPA peut effectuer un rôle similaire chez les mammifères et une vision différente pour déterminer la fonction de cette protéine sera requise pour adresser adéquatement cette question dans le futur.