Amostragem Adaptativa em Redes de Sensores

Uma nova área tecnológica está em crescente desenvolvimento. Esta área, denominada de internet das coisas, surge na necessidade de interligar vários objetos para uma melhoria a nível de serviços ou necessidades por parte dos utilizadores. Esta dissertação concentra-se numa área específica da tecnologia internet das coisas que é a sensorização. Esta rede de sensorização é implementada pelo projeto europeu denominado de Future Cities [1] onde se cria uma infraestrutura de investigação e validação de projetos e serviços inteligentes na cidade do Porto. O trabalho realizado nesta dissertação insere-se numa das plataformas existentes nessa rede de sensorização: a plataforma de sensores ambientais intitulada de UrbanSense. Estes sensores ambientais que estão incorporados em Data Collect Unit (DCU), também denominados por nós, medem variáveis ambientais tais como a temperatura, humidade, ozono e monóxido de carbono. No entanto, os nós têm recursos limitados em termos de energia, processamento e memória. Apesar das grandes evoluções a nível de armazenamento e de processamento, a nível energético, nomeadamente nas baterias, não existe ainda uma evolução tão notável, limitando a sua operacionalidade [2]. Esta tese foca-se, essencialmente, na melhoria do desempenho energético da rede de sensores UrbanSense. A principal contribuição é uma adaptação do protocolo de redes Ad Hoc OLSR (Optimized Link State Routing Protocol) para ser usado por nós alimentados a energia renovável, de forma a aumentar a vida útil dos nós da rede de sensorização. Com esta contribuição é possível obter um maior número de dados durante períodos de tempo mais longos, aproximadamente 10 horas relativamente às 7 horas anteriores, resultando numa maior recolha e envio dos mesmos com uma taxa superior, cerca de 500 KB/s. Existindo deste modo uma aproximação analítica dos vários parâmetros existentes na rede de sensorização. Contudo, o aumento do tempo de vida útil dos nós sensores com recurso à energia renovável, nomeadamente, energia solar, incrementa o seu peso e tamanho que limita a sua mobilidade. Com o referido acréscimo a determinar e a limitar a sua mobilidade exigindo, por isso, um planeamento prévio da sua localização. Numa primeira fase do trabalho analisou-se o consumo da DCU, visto serem estes a base na infraestrutura e comunicando entre si por WiFi ou 3G. Após uma análise dos protocolos de routing com iv suporte para parametrização energética, a escolha recaiu sobre o protocolo OLSR devido à maturidade e compatibilidade com o sistema atual da DCU, pois apesar de existirem outros protocolos, a implementação dos mesmos, não se encontram disponível como software aberto. Para a validação do trabalho realizado na presente dissertação, é realizado um ensaio prévio sem a energia renovável, para permitir caracterização de limitações do sistema. Com este ensaio, tornou-se possível verificar a compatibilidade entre os vários materiais e ajustamento de estratégias. Num segundo teste de validação é concretizado um ensaio real do sistema com 4 nós a comunicar, usando o protocolo com eficiência energética. O protocolo é avaliado em termos de aumento do tempo de vida útil do nó e da taxa de transferência. O desenvolvimento da análise e da adaptação do protocolo de rede Ad Hoc oferece uma maior longevidade em termos de tempo de vida útil, comparando ao que existe durante o processamento de envio de dados. Apesar do tempo de longevidade ser inferior, quando o parâmetro energético se encontra por omissão com o fator 3, a realização da adaptação do sistema conforme a energia, oferece uma taxa de transferência maior num período mais longo. Este é um fator favorável para a abertura de novos serviços de envio de dados em tempo real ou envio de ficheiros com um tamanho mais elevado.

Development of advanced human robot interaction systems

O trabalho aqui apresentado é a Dissertação da minha Tese do curso de Mestrado em Engenharia Eletrotécnica e de Computadores do ISEP, realizada em parceria com o INESC TEC. O trabalho consiste no desenvolvimento de um sistema avançado de interação entre homem-robô, usando ferramentas de software livres e de domínio público e hardware pouco dispendioso e facilmente acessível. Pretende-se que o sistema desenvolvido possa ser adotado por pequenas ou micro empresas, daí a restrição monetária. Este tipo de empresas tem, por norma, uma capacidade de investimento pequena, e ficam impossibilitadas de aceder a este tipo de sistemas automatizados se estes forem caros. No entanto, o robô continua a ser um componente fundamental, sendo dispendioso. Os trabalhos realizados pelos sistemas robóticos podem por um lado, ser repetitivos sem necessidade de grandes ajustes; por outro lado, o trabalho a realizar pode ser bastante diverso, sendo necessários bastantes ajustes com (possivelmente) programação do robô. As empresas podem não ter disponível mão-de-obra qualificada para realização da programação do robô. Pretende-se então um sistema de “ensino” que seja simples e rápido. Este trabalho pretende satisfazer as necessidades de um sistema de interação homem-robô intuitivo mesmo para operadores que não estejam familiarizados com a robótica. Para simplificar a transferência de informação da tarefa a desempenhar pelo sistema robótico é usado um sistema de infravermelhos para delinear a operação a desempenhar, neste caso concreto uma operação de soldadura. O operador usa um apontador com marcadores, a posição destes marcadores é detetada usando duas câmaras para permitir o posicionamento tridimensional no espaço. As câmaras possuem filtros infravermelhos para separar o espectro de luz. Para o controlo do sistema e interface com o robô é usado um computador de baixos recursos computacionais e energéticos, e também de baixo custo. O sistema desenvolvido é portanto computacionalmente leve para poder ser executado neste computador.

Dimensionamento de ligações aço-betão segundo a prEN1992-4:2013

O presente relatório documenta o estágio desenvolvido na empresa SE2P – Sociedade de Engenharia, Projeto e Planeamento Lda. no âmbito da unidade curricular de DIPRE (Dissertação/Projeto/ Estágio) do Mestrado em Engenharia Civil – Ramo de Estruturas do Instituto Superior de Engenharia do Porto. A frequência no estágio curricular teve como objetivo principal o desenvolvimento de uma ferramenta de cálculo que permitisse o dimensionamento de ligações aço-betão segundo a prEN1992-4:2013. O desenvolvimento desta ferramenta resulta da necessidade do dimensionamento de soluções leves, económicas e esteticamente agradáveis tendo em conta a uniformização da legislação existente em toda a União Europeia. Atualmente, os projetistas têm utilizado programas de cálculo automático desenvolvidos por fabricantes de sistemas de ancoragens, como é o caso do Profis Anchor da Hilti. Esses programas de cálculo têm como base de dados as Diretrizes de Aprovação Técnica Europeia, a ETAG001- anexo C para dimensionamento de ancoragens mecânicas em betão e o relatório técnico EOTA TR029 para o dimensionamento de ancoragens químicas, apresentando até métodos de cálculo simplificados para uma rápida resposta ao cliente. A publicação da prEN1992-4:2013 é um marco importante, pois há já algum tempo que a construção metálica e mista está regulamentada apresentando algumas falhas no que diz respeito às ligações aço-betão. Esta norma é o culminar de anos de pesquisas, estudos e testes efetuados aos diferentes tipos de ligação tendo em conta além dos modos de rotura possíveis, os princípios de transferência de esforços.

Desenvolvimento de Primer universal de SBE para codificação espectral de SNP

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Biotecnologia

Ownserver: sistema doméstico de prestação de serviços cloud

Neste trabalho foi considerada a possibilidade de incorporar serviços remotos, normalmente associados a serviços web e cloud computing, numa solução local que centralizasse os vários serviços num único sistema e permitisse aos seus utilizadores consumir e configurar os mesmos, quer a partir da rede local, quer remotamente a partir da Internet. Desta forma seria possível conciliar o acesso a partir de qualquer local com internet, característico nas clouds, com a simplicidade de concentrar num só sistema vários serviços que são por norma oferecidos por entidades distintas e ainda permitir aos seus utilizadores o controlo e configuração sobre os mesmos. De forma a validar que este conceito é viável, prático e funcional, foram implementadas duas componentes. Um cliente que corre nos dispositivos dos utilizadores e que proporciona a interface para consumir os serviços disponíveis e um servidor que irá conter e prestar esses serviços aos clientes. Estes serviços incluem lista de contactos, mensagens instantâneas, salas de conversação, transferência de ficheiros, chamadas e conferências de voz e vídeo, pastas remotas, pastas sincronizadas, backups, pastas partilhadas, VoD (Video-on Demand) e AoD (Audio-on Demand). Para o desenvolvimento do cliente e do servidor foi utilizada a framework Qt que recorre à linguagem de programação C++ e ao conjunto de bibliotecas que possui, para o desenvolvimento de aplicações multiplataforma. Para as comunicações entre clientes e servidor, foi utilizado o protocolo XMPP (Extensible Messaging and Presence Protocol), pela forma da biblioteca qxmpp e do servidor XMPP ejabberd. Pelo facto de conter um conjunto de centenas de extensões atualmente ativas que auferem funcionalidades como salas de conversação, transferências de ficheiros e até estabelecer sessões multimédia, graças à sua flexibilidade permitiu ainda a criação de extensões personalizada necessárias para algumas funcionalidades que se pretendeu implementar. Foi ainda utilizado no servidor a framework ffmpeg para suportar algumas funcionalidades multimédia. Após a implementação do cliente para Windows e Linux, e de implementar o servidor em Linux foi realizado um conjunto de testes funcionais para perceber se as funcionalidades e seus mecanismos funcionam corretamente. No caso onde a análise da performance e do consumo de recursos era importante, foram realizados testes de performance e testes de carga.

Tratamento pela periferia de falhas na internet

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia Informática

Tradução, adaptação e legendagem de textos poéticos

A legendagem, sendo um modo de tradução audiovisual muito peculiar, implica verter um discurso oral, real ou ficcionado, para texto escrito. A primeira questão que nos colocamos é, como será isto exequível, sem se perder uma parte significativa do discurso oral: os elementos paralinguísticos? Depois, o que acontece nesta passagem da oralidade para a escrita? Haverá forma de contornar as perdas evidentes? Como ponto de partida para este projecto de legendagem, escolhemos dois filmes ainda não legendados em português, cujos argumentos, coincidentemente, também ainda não se encontravam traduzidos em português. Os filmes escolhidos foram Pull My Daisy e The Last Clean Shirt, documentos visuais da cultura da Beat Generation, movimento sediado nos Estados Unidos da América. A partir da tradução, adaptação e legendagem destas obras, procurámos, então, analisar as dificuldades levantadas pela tradução e introdução das marcas de oralidade existentes nos textos de partida, bem como as suas possibilidades de adaptação, tendo em conta as características do público-alvo e os constrangimentos impostos pela própria natureza deste modo de tradução. Procurou tomar-se em consideração também os problemas relacionados com a transferência da cultura da língua de partida para a língua de chegada. A legendagem destas duas curtas-metragens foi realizada através do programa de software SPOT. Depois de concluído, foi analisado todo o processo de tradução, adaptação e legendagem, considerando a necessidade de contextualizar os filmes a nível literário, artístico e cultural, bem como as decisões relativamente a alguns aspectos do resultado final da legendagem, nomeadamente no que respeita às dificuldades impostas pela transposição da oralidade para a escrita. O argumento de Pull My Daisy, nas palavras do autor Jack Kerouac, baseia-se no Acto III da peça “The Beat Generation”. Esta peça foi escrita em 1957, mas foi recentemente redescoberta em 2005, em forma manuscrita, num armazém de New Jersey. Na sua essência, este argumento consiste num improviso de Kerouac elaborado em voz off durante o filme realizado por Robert Frank e Alfred Leslie, em 1959. Desde então, ambos os realizadores desenvolveram as suas criações artísticas, tendo, por exemplo, Alfred Leslie estreado o seu trabalho mais recente, o vídeo The Cedar Bar no London Film Festival em 2002 e Robert Frank realizado vídeos para canções dos New Order, Run de 1989, e de Patti Smith, em 1996, para Summer Cannibals. A curta-metragem começa com um canção cuja letra é um excerto do poema Pull My Daisy de Allen Ginsberg e Jack Kerouac. Depois, Jack Kerouac representa e encarna com a sua própria voz cada uma das personagens do filme, enquadrando, descrevendo e comentando a acção. O argumento do filme é, assim, um exercício livre de improviso sobre as imagens montadas pelos realizadores. The Last Clean Shirt é um filme experimental de Alfred Leslie, realizado em 1964, cujas legendas originais incluídas no filme são textos do poeta americano Frank O’Hara. Este filme tem sempre o mesmo enquadramento de câmara, ao passo que a “acção” nos é sugerida pelo conteúdo das legendas que integram a obra. Isto é, se por um lado o cenário e os protagonistas do filme são os mesmos do início ao fim do filme, é o texto de O’Hara, associado ao momento da inserção dos segmentos no filme, que atrai ou distrai a atenção do espectador para uma viagem que pode ter vários destinos. Estas duas curtas-metragens constituem textos-limite que põem em evidência os desafios do processo de legendagem, graças às suas características muito especiais, enquanto obras de arte cinematográfica. Para além das dificuldades emergentes que todos os trabalhos de tradução envolvem, neste trabalho considerou-se essencial tentar tratar da melhor forma a estrutura poética livre e conferir significado suficiente e coeso no texto de chegada ao fluxo de pensamento exteriorizado no texto de partida, procurando, especialmente, não prejudicar a característica poética dos textos.

Avaliação e Modificação do Risco de Queda em Idosos com Recurso à Posturografia Dinâmica Computorizada

Introdução: As quedas na população idosa associam-se a considerável mortalidade, morbilidade, défice funcional e institucionalização prematura, sendo o principal factor de risco de fractura. Os programas de exercício reduzem o risco de quedas no idoso e podem ter custos inferiores aos do tratamento das lesões resultantes. A Posturografia Dinâmica Computorizada é utilizada na avaliação postural. Também permite treino de equilíbrio, que tem sido pouco investigado. Objectivos: Avaliação do risco de queda antes e depois do treino de equilíbrio em Posturografia Dinâmica Computorizada. População e métodos: Foram avaliados 22 indivíduos com idade superior a 65 anos. A avaliação inicial inclui o teste “timed up and go”, a escala de confiança no equilíbrio específica para a actividade e a Posturografia Dinâmica Computorizada. Foi seguidamente realizado um programa de treino de equilíbrio em Posturografia Dinâmica Computorizada. Por fim, foi realizada uma reavaliação, repetindo procedimentos da avaliação inicial. Os valores registados foram comparados através do cálculo da respectiva evolução. Foi aplicado o teste de Shapiro-Wilk para testar a normalidade dos valores de cada variável em cada avaliação e o teste de Wilcoxon para amostras emparelhadas para se proceder à comparação dos valores observados em cada uma das avaliações. Resultados: No teste “timed up and go”, ocorreram evoluções significativas. Na escala de confiança no equilíbrio específica para a actividade, ocorreram evoluções significativas no teste modificado de interacção sensorial sobre o equilíbrio, no teste dos limites de estabilidade, no teste de transferência sedestação/ortostatismo e no teste de marcha na plataforma. Conclusões: Os indivíduos estudados apresentaram uma evolução significativa, com melhoria, de diversos parâmetros associados ao equilíbrio. As evoluções verificadas poderão traduzir benefícios clínicos do programa de treino efectuado.

Localização Ótima de Aparelhos de Corte Normalmente Abertos e Normalmente Fechados em Redes de Distribuição

Tipicamente as redes elétricas de distribuição apresentam uma topologia parcialmente malhada e são exploradas radialmente. A topologia radial é obtida através da abertura das malhas nos locais que otimizam o ponto de operação da rede, através da instalação de aparelhos de corte que operam normalmente abertos. Para além de manterem a topologia radial, estes equipamentos possibilitam também a transferência de cargas entre saídas, aquando da ocorrência de defeitos. As saídas radiais são ainda dotadas de aparelhos de corte que operam normalmente fechados, estes têm como objetivo maximizar a fiabilidade e isolar defeitos, minimizando a área afetada pelos mesmos. Assim, na presente dissertação são desenvolvidos dois algoritmos determinísticos para a localização ótima de aparelhos de corte normalmente abertos e fechados, minimizando a potência ativa de perdas e o custo da energia não distribuída. O algoritmo de localização de aparelhos de corte normalmente abertos visa encontrar a topologia radial ótima que minimiza a potência ativa de perdas. O método é desenvolvido em ambiente Matlab – Tomlab, e é formulado como um problema de programação quadrática inteira mista. A topologia radial ótima é garantida através do cálculo de um trânsito de potências ótimo baseado no modelo DC. A função objetivo é dada pelas perdas por efeito de Joule. Por outro lado o problema é restringido pela primeira lei de Kirchhoff, limites de geração das subestações, limites térmicos dos condutores, trânsito de potência unidirecional e pela condição de radialidade. Os aparelhos de corte normalmente fechados são localizados ao longo das saídas radiais obtidas pelo anterior algoritmo, e permite minimizar o custo da energia não distribuída. No limite é possível localizar um aparelho de corte normalmente fechado em todas as linhas de uma rede de distribuição, sendo esta a solução que minimiza a energia não distribuída. No entanto, tendo em conta que a cada aparelho de corte está associado um investimento, é fundamental encontrar um equilíbrio entre a melhoria de fiabilidade e o investimento. Desta forma, o algoritmo desenvolvido avalia os benefícios obtidos com a instalação de aparelhos de corte normalmente fechados, e retorna o número e a localização dos mesmo que minimiza o custo da energia não distribuída. Os métodos apresentados são testados em duas redes de distribuição reais, exploradas com um nível de tensão de 15 kV e 30 kV, respetivamente. A primeira rede é localizada no distrito do Porto e é caraterizada por uma topologia mista e urbana. A segunda rede é localizada no distrito de Bragança e é caracterizada por uma topologia maioritariamente aérea e rural.

Marketing social nas políticas públicas

Tese apresentada para cumprimento dos requisitos necessários à obtenção do grau de Doutor em Ciência Política, variante de Políticas Públicas

Comparison of different techniques for mouse transgenesis

RESUMO: O uso de ratinhos transgénicos em neurociências aumentou consideravelmente nos últimos anos devido ao crescente interesse em compreender o cérebro e a necessidade de solucionar situações clínicas do foro neurológico e psiquiátrico. Para esse efeito, diferentes métodos de produção de animais transgénicos têm sido testados. O objectivo desta tese foi comparar métodos de integração aleatória de um transgene no genoma de ratinhos em termos de eficiência, estabilidade da integração do transgene, número de animais e de horas de trabalho necessárias para cada método. Assim, foi comparado o método mais utilizado - microinjecção pronuclear (PNMI) - com duas outras técnicas cujo desempenho foi considerado promissor – a transferência génica através dos testículos por electroporação e transfecção por lentivírus in vivo. As três técnicas foram realizadas usando um gene repórter sob o controlo de um promotor constitutivo, e depois reproduzidas usando um gene de interesse de modo a permitir obtenção de um animal capaz de ser usado em experimentação laboratorial. O transgene de interesse utilizado codifica uma proteína de fusão correspondendo a uma variante da rodopsina (channelrhodopsin) fundida à proteína enhanced yellow fluorescente protein ((EYFP) resultando num produto designado ChR2-EYFP. Este animal transgénico apresentaria expressão deste canal iónico apenas em células dopaminergicas, o que, com manipulação optogenética, tornaria possivel a activação especifica deste grupo de neurónios e, simultaneamente, a observação do impacto desta manipulação no comportamento num animal em livre movimento. Estas ferramentas são importantes na investigação básica em neurociências pois ajudam a esclarecer o papel de grupos específicos de neurónios e compreender doenças como a doença de Parkinson ou a esquizofrenia onde a função de certos tipos de neurónios de encontra alterada. Quando comparados os três métodos realizados verifica-se que usando um gene repórter PMNI resulta em 31,3% de, a de animais transgénicos obtidos, a electroporação de testículos em 0% e a injecção de lentivírus em 0%. Quando usado o gene de interesse, os resultados obtidos são, respectivamente, 18,8%, 63,9% e 0%.--------------ABSTRACT: The use of transgenic mice is increasing in all fields of research, particularly in neuroscience, due to the widespread need of animal models to solve neurological and psychiatric medical conditions. Different methodologies have been tested in the last decades in order to produce such transgenic animals. The ultimate goal of this thesis is to compare different methods of random integration of a transgene in the genome of mice in terms of efficiency, stability of the transgene integration, number of animals required and the labour intensity of each technique. We compared the most used method – pronuclear microinjection (PNMI) – with two other promising techniques – Testis Mediated Gene Transfer (TMGT) by electroporation and in vivo lentiviral transfection. The three techniques were performed using a reporter gene – green fluorescent protein (GFP), whose transcription was driven by the constitutive cytomegalovirus (CMV) promoter. These three techniques were later reproduced using the tyrosine hydroxylase promoter (TH) and the neuronal manipulator, channelrhodopsin-2 fused to the enhanced yellow fluorescent reporter protein (ChR2-EYFP). The transgenic animal we sough to produce would express the light driven channel only in dopaminergic cells, making possible to specifically activate this group of neurons, while simultaneously observe the behaviour in a freely moving animal. This is a very important tool in basic neuroscience research since it helps to clarify the role of specific groups of neurons, map circuits in the brain, and consequently understand neurological diseases such as Parkinson’s disease or schizophrenia, where the function of certain types of neurons is affected. When comparing the three methods, it was verified that using a reporter gene PNMI resulted in 31.3% of transgenic mice obtained, testis electroporation in 0% and lentiviral injection in 0%. When using the gene of interest, the results obtained were, respectively, 18.8%, 63.9% and 0%.

Pesquisa e desenvolvimento de um sistema termoelétrico do tipo linear fresnel reflector

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Energias Renováveis – Conversão Elétrica e Utilização Sustentável

O2/CO2-sensitive cyclic AMP-signalling pathway in peripheral chemoreceptors

RESUMO: O corpo carotídeo (CB) é um pequeno órgão sensível a variações na PaO2, PaCO2 e pH. As células tipo I (células glómicas) do corpo carotídeo, as unidades sensoriais deste órgão, libertam neurotransmissores em resposta às variações dos gases arteriais. Estes neurotransmissores atuam quer em recetores pré-sinápticos, localizados nas células tipo I, quer em recetores póssinápticos, localizados nas terminações do nervo do seio carotídeo, ou em ambos. A activação dos recetores pré-sinápticos modula a atividade do corpo carotídeo, enquanto que, a activação dos recetores pós-sinápticos, de carater excitatório, desencadeia um aumento da frequência de descarga das fibras do CSN, com subsequente despolarização dos neurónios do gânglio petroso, e posterior despolarização de um grupo específico de neurónios do centro respiratório central, desencadeando, como resposta final, hiperventilação. Estes recetores pré- e pós-sinápticos podem ser classificados em ionotrópicos ou metabotrópicos, estando os últimos acoplados a adenilatos ciclases transmembranares (tmAC). O mecanismo exato pelo qual as variações dos gases arteriais são detetadas pelo CB não se encontra ainda completamente elucidado, mas tem sido sugerido que alterações nos níveis de cAMP estejam associadas ao mecanismo de deteção de variações de O2 e CO2. Os níveis de cAMP podem ser regulados através da sua via de síntese, mediada por dois tipos de adenilatos ciclases: tmAC sensível aos eurotransmissores e adenilato ciclase solúvel (sAC)sensível a variações de HCO3/CO2, e pela sua via de degradação mediada por fosfodiesterases. A via de degradação do cAMP pode ser manipulada farmacologicamente, funcionando enquanto alvo terapêutico para o tratamento de patologias do foro respiratório (e.g. asma, hipertensão pulmonar, doença pulmonar obstructiva crónica e apneia do sono), que induzem um aumento da actividade do CB.O trabalho descrito nesta dissertação partiu da hipótese de que a actividade do CB é manipulada por fármacos, que interferem com a via de sinalização do cAMP, tendo sido nosso objectivo geral, investigar o papel do cAMP na quimiotransdução do CB de rato, e determinar se a actividade dos enzimas responsáveis pela via de sinalização do cAMP é ou não regulada por variações de O2/CO2. Assim, a relevância deste trabalho é a de estudar e identificar possíveis alvos moleculares (sAC, isoformas de tmAC e PDE) com potencial para serem usados no tratamento de patologias relacionadas com o controlo respiratório. A primeira parte do presente trabalho, centrou-se na caracterização farmacológica da PDE4 no CB e em tecidos não quimiorecetores (e.g. gânglio cervical superior e artérias carótidas), e na observação do efeito de hipóxia aguda na acumulação dos níveis de cAMP, induzidos pelos inibidores de PDE, nestes tecidos. A quantificação de cAMP foi efectuada por técnica imunoenzimática (EIA), tendo sido elaboradas curvas de dose-resposta para os efeitos de inibidores, não específicos (IBMX) e específicos para a PDE2 e PDE4 (EHNA, Rolipram e Ro 20-1724), nos níveis de cAMP acumulados, em situações de normóxia (20%O2/5%CO2) e hipóxia (5%O2/5%CO2). A caracterização das PDE no gânglio cervical superior foi aprofundada, utilizando-se a técnica de transferência de energia de ressonância por fluorescência (FRET) em culturas primárias de neurónios, na presença de inibidores não específicos (IBMX) e específicos para a PDE3 e PDE4 (milrinone e rolipram, respetivamente). Foram igualmente estudadas, através de RT-qPCR, as alterações na expressão de PDE3A-B e PDE4A-D, no gânglio cervical superior, em resposta a diferentes percentagens de oxigénio. Na segunda parte do trabalho investigou-se a via de síntese do cAMP no CB em resposta a variações na concentração de HCO3/CO2. Em concreto, o protocolo experimental centrou-se na caracterização da sAC, dado que a sua actividade é regulada por variações de HCO3/CO2. A caracterização da expressão e regulação da sAC, em resposta a variações de HCO3/CO2 ,foi efectuada no CB e em tecidos não quimioreceptores periféricos (e.g. gânglio cervical superior, petroso e nodoso) por qRT-PCR. A actividade deste enzima foi caracterizada indirectamente através da quantificação dos níveis de cAMP (quantificação por EIA), induzidos por diferentes concentrações de HCO3/CO2, na presença de MDL-12,33-A, um inibidore da tmAC. A expressão das isoformas da tmAC no CB e gânglio petroso foi determinada por RT-qPCR. Adicionalmente, estudámos a contribuição relativa da tmAC e sAC no mecanismo de sensibilidade ao CO2 no CB. Para o efeito foram estudadas as alterações: 1) nos níveis de cAMP (quantificado por EIA) na presença de diferentes concentrações de HCO3/CO2 e ao longo do tempo (5-30 min); 2) na ativação da proteína cinase A (PKA, FRET baseado em sensores) em células tipo I do CB; e 3) na frequência de descarga do CSN (registos) na presença e ausência de ativadores e inibidores da sAC,tmAC e PKA. Por último, foi caracterizada a expressão e actividade da sAC nos quimioreceptors centrais (locus ceruleus, rafe e medula ventro-lateral) através de técnicas de RT-qPCR e EIA. A expressão das isoformas da tmAC foi aprofundada no locus coeruleus através de RT-qPCR. Por fim, comparámos a contribuição da tmAC e sAC nos níveis de cAMP no locus coeruleus em condições de normocapnia e hipercapnia.O nosso trabalho teve os seguintes resultados principais: 1) PDE4 está funcional no corpo carotídeo, artérias carótidas e gânglio cervical superior de rato, embora a PDE2 só se encontre funcional neste último; 2) Os efeitos dos inibidores de PDE nos níveis de acumulação de cAMP foram exacerbados em situações de hipóxia aguda no CB e artérias carótidas, mas foram atenuados no gânglio cervical superior; 3) No gânglio cervical superior, diferentes tipos de células apresentaram uma caracterização específica de PDEs, sugerindo uma subpopulação de células neste gânglio com funções fisiológicas distintas; 4) Embora todas as isoformas de PDE4 e PDE3 estivessem presentes no gânglio, a PDE3a, PDE4b e a PDE4d foram as isoformas mais expressas. Por outro lado, incubações de gânglio cervical superior, em diferentes percentagens de oxigénio, não alteraram (não regularam) significativamente a expressão das diferentes isoformas de PDE neste órgão; 5) a sAC encontra-se expressa e funcional no CB e nos quimiorecetores centrais estudados (locus coeruleus, rafe e medula ventrolateral). A sAC apresenta maior expressão no CB comparativamente aos restantes orgãos estudados, exceptuando os testículos, orgão controlo. Variações de HCO3/CO2 de 0/0 para 24/5 aumentaram os níveis de cAMP no CB e quimiorecetores centrais, tendo sido o aumento mais significativo observado no CB. Concentrações acima dos 24mM HCO3/5%CO2 não induziram alterações nos níveis de cAMP, sugerindo que a actividade da sAC se encontra saturada em condições fisiológicas (normocapnia) e que este enzima não desempenha qualquer papel na deteção de situações de hipercapnia; 6) No CB, a expressão das isoformas tmAC1, tmAC4, tmAC6 e tmAC9 é mais elevada comparativamente à expressão da sAC; 7) Utilizamos diferentes inibidores da tmAC (MDL 12-330A, 500μM, 2’5’-ddADO, 30-300μM, SQ 22536, 200μM) e da sAC (KH7, 10-100μM) para estudar a contribuição relativa destes enzimas na acumulação do cAMP no CB. Tanto a tmAC como a sAC contribuem para a acumulação dos níveis de cAMP em condições de hipercapnia. Contudo, existe um maior efeito destes inibidores nas condições de 12 mM HCO3/2.5%CO2 do que em condições de normocapnia e hipercapnia, sugerindo um papel relevante destes enzimas na atividade do CB em situações de hipocapnia; 8) Não se observaram variações nos níveis de cAMP em resposta a diferentes concentrações de HCO3/CO2 ao longo do tempo (5-30 min). O efeito inibitório induzido por ddADO e KH7 foi sobreponível após 5 ou 30 minutos de incubação em todas as concentrações de HCO3/CO2 estudadas; 9) Por último, verificou-se um aumento na frequência da descarga do nervo do seio carotídeo entre as condições de normocapnia e hipercapnia acídica. Ao contrário do KH7 (10μM), o 2’5’-ddADO reduziu significativamente a frequência de descarga do nervo, quer em condições de normocapnia quer de hipercapnia acídica. Contudo, não se verificou aumento na frequência de descarga do nervo entre normocapnia e hipercapnia isohídrica, sugerindo que a sensibilidade à hipercapnia no CB é mediada por variações de pH. Em conclusão, os resultados decorrentes deste trabalho permitiram demonstrar que, embora os enzimas que medeiam a via de sinalização do cAMP possam ser bons alvos terapêuticos em condições particulares, a sua actividade não é específica para o CB. Os resultados sugerem ainda que o cAMP não é um mediador específico da transdução à hipercapnia neste orgão. Contudo, os nossos resultados demonstraram que os níveis de cAMP são mais elevados em condições fisiológicas, o que sugere que o cAMP possa ter uma função homeostática neste orgão. Por último, o presente trabalho demonstrou que os aumentos de cAMP descritos por outros em condições de hipercapnia, não são observáveis quando o pH se encontra controlado. ------------------ ABSTRACT: The work presented in this dissertation was aimed to establish how specific is cAMP-signaling pathways in the CB mainly in different CO2 conditions and how O2 concentrations alter/drives the manipulation of cAMP signaling in the CB. The experimental studies included in this thesis sought to investigate the role of cAMP in the rat CB chemotransduction mechanisms and to determine whether the enzymes that participate in cAMP signal transduction in the CB are regulated by O2/CO2. We characterized the enzymes involved in the cAMP-signaling pathway in the CB (sAC, tmAC, PDE) under different O2/CO2 conditions. Our results demonstrated that many of these enzymes are involved in CO2/O2 sensing and while they may be useful in treating conditions with alterations in CO2/O2 sensing,they will not be specific to chemoreception within the CB: 1) PDE4 is ubiquitously expressed in CB and non-chemoreceptor related tissues and their affinity to inhibitors change with O2 tensions in both CB and carotid arteries, and 2) sAC and tmAC are expressed in peripheral and central chemo- and non-chemoreceptor tissues and their effect on cAMP levels do not change between normocapnic and isohydric hypercapnic conditions. Our results provide evidence against a specific role of cAMP as a mediator for O2 and CO2 chemotransduction in the rat CB and emphasized the role of pH in CO2 sensitivity of the CB. Furthermore, our results demonstrate that cAMP levels are maintained higher under physiological conditions, supporting recent finding from our lab, which all together suggests that cAMP has a homeostatic function in this organ.

Análise da vida à fadiga de ligações soldadas em T

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia Mecânica

Levantamento de espólios fonográficos em fita magnética. Avaliação do Estado de Conservação das Fitas

Dissertação no âmbito do Mestrado em Artes Musicais: Estudos em Música e Tecnologias