Identification of Porphyra lines (Rhodophyta) by AFLP DNA fingerprinting and molecular markers

Twenty-seven Porphyra lines from 5 classes, including lines widely used in China, wild lines, and lines introduced to China from abroad in recent years, were screened by means of amplified fragment length polymorphism (AFLP) with 24 primer pairs. From the generated AFLP products, 13 bands that showed stable and repeatable AFLP patterns amplified by primer pairs M-CGA/E-AA and M-CGA/E-TA were scored and used to develop the DNA fingerprints of the 27 Porphyra lines. Moreover, the DNA fingerprinting patterns were converted into computer language expressed with digitals 1 and 0, which represented the presence (numbered as 1) or absence (numbered as 0) of the corresponding band. On the basis of these results, computerized AFLP DNA fingerprints were constructed in which each of the 27 Porphyra lines has its unique AFLP,fingerprinting pattern and can be easily distinguished from others. Software called PGI-AFLP (Porphyra germplasm identification-AFLP) was designed for identification of the 27 Porphyra lines. In addition, 21 specific AFLP markers from 15 Porphyra lines were identified; 6 AFLP markers from 4 Porphyra lines were sequenced, and 2 of them were successfully converted into SCAR (sequence characterized amplification region) markers. The developed AFLP DNA fingerprinting and specific molecular markers provide useful ways for the identification, classification, and resource protection of the Porphyra lines.

Assessment of genetic diversities of selected Laminaria (Laminariales, Phaeophyta) gametophytes by inter-simple sequence repeat analysis

Inter-simple sequence repeat (ISSR) analysis was used to assess genetic diversity among 10 pairs of male and female Laminaria gametophytes. A total of 58 amplification loci was obtained from 10 selected ISSR primers, of which 34 revealed polymorphism among the gametophytes. Genetic distances were calculated with the Dice coefficient ranging from 0.006 to 0.223. A dendrogram based on the unweighted pair-group method arithmetic (UPGMA) average showed that most male and female gametophytes of the same species were clustered together and that 10 pairs of gametophytes were divided into four groups. This was generally consistent with the taxonomic categories. The main group consisted of six pairs of gametophytes, which were selected from Laminaria japonica Aresch. by intensive inbreeding through artificial hybridization. One specific marker was cloned, but was not converted successfully into a sequence characterized amplified region (SCAR) marker. Our results demonstrate the feasibility of applying ISSR markers to evaluate Laminaria germplasm diversities.

Identification of 27 Porphyra lines (Rhodophyta) by DNA fingerprinting and molecular markers

Twenty-seven Porphyra lines, including lines widely used in China, wild lines and lines introduced to China from abroad in recent years, were screened by random amplified polymorphic DNA (RAPD) technique with 120 operon primers. From the generated RAPD products, 11 bands that showed stable and repeatable RAPD patterns amplified by OPC-04, OPJ-18 and OPX-06, respectively were scored and used to develop the DNA fingerprints of the 27 Porphyra lines. Moreover, the DNA fingerprinting patterns were converted into computer language expressed with two digitals, 1 and 0, which represented the presence (numbered as 1) or absence (numbered as 0) of the corresponding band, respectively. Based on the above results, computerized DNA fingerprints were constructed in which each of the 27 Porphyra lines has its unique fingerprinting pattern and can be easily distinguished from others. Software named PGI (Porphyra germplasm identification) was designed for identification of the 27 Porphyra lines. In addition, seven specific RAPD markers from seven Porphyra lines were identified and two of them were successfully converted into SCAR (sequence characterized amplification region) markers. The developed DNA fingerprinting and specific molecular markers provide useful ways for the identification, classification and resource protection of the Porphyra lines.

DNA fingerprinting of selected Laminaria (Phaeophyta) gametophytes by RAPD markers

Random amplified polymorphism DNA (RAPD) analysis was applied to germplasm characterization in 33 different selected Laminaria male and female gametophytes. The positional homology of the RAPD analysis using sequence characterized applied region (SCAR) method was successfully conducted. A total of 233 polymorphic loci were obtained from 18 selected primers after screening, of which 27 stable and clear bands were selected to construct a fingerprint map for discrimination of each gametophyte. Seven RAPD markers from five primers were finally determined by a computer program to construct the fingerprint map. Three specific markers closely related with gametophytes were obtained and were converted to gametophytic SCAR markers, the first SCAR marker report on Laminaria germplasm and applicable to cultivars identification. These results demonstrated the feasibility of applying RAPD markers to germplasm characterization in selected Laminaria gametophytes, and can provide a molecular basis for breeding new Laminaria strains. (C) 2004 Elsevier B.V. All rights reserved.

The genetic analysis and germplasm identification of the gametophytes of Undaria pinnatifida (Phaeophyceae) with RAPD method

Eleven pairs of Undaria pinnatifida (Harv.) Suringar gametophytes were identified with random amplified polymorphic DNA (RAPD) technique. After screening 100 primers, 20 ten-base primers were determined for the RAPD analysis. A total of 312 polymorphic loci were obtained, of which 97.7% were polymorphic. The primer S198 was found to distinguish all the selected Undaria pinnatifida gametophytes. The genetic distances between each two of the twenty-two U. pinnatifida gametophytes ranged from 0.080 to 0.428, while the distances to the Laminaria was 0.497 on average. After reexamination, two sequences characterized amplification region (SCAR) markers were successfully converted, which could be applied to U. pinnatifida germplasm identification. All these results demonstrated the feasibility of applying RAPD markers to germplasm characterization and identification of U. pinnatifida gametophytes, and to provide a molecular basis for Undaria breeding.

DNA分子标记技术在海带种质鉴定中的应用

本文在CTAB和SDS／K＋两种DAN提取方法基础上，综合与改进，建立了海带配子体DNA的提取和纯化方法。用此法得到了较高质量的海带配子体DNA，可有效地应用于海带分子标记的研究。采用RAPD，ISSR和AFLP三种DNA分子标记技术对海带配子体细胞系进行了种质鉴定和评价，结果表明：1）RAPD方法可以有效地应用于海带配子体细胞系的鉴定，用三个RAPD引物（OPC20，OPD20和OPD15）构建的DNA指纹图谱，不仅能将23个海带配子体细胞系区分开，而且能将每种海带的雌、雄配子体区分开。2）在没有其它海带配子体DNA分子标记背景资料的前提下，运用ISSR标记方法，辅证了RAPD方法的有效性及可靠性，排除了因原核生物的“污染”，所造成的RAPD标记方法的干扰，同时，也能辨别非海带配子体，这可以评价海带配子体保存的实际效果。3）AFLP分子标记结果表明，海带配子体细胞系具有高的多态性，这对海带具体性状进行连锁标记分析，可能是有效的方法。4）在RAPD标记的基础上，初步建立海带配子体SCAR标记，为海带分子标记辅助选种、育种打下基础。5）对3F、5F、12M三个实验材料，进一步用rDNA转录间隔区（ITS1）测序分析，与已知海带配子体ITS1的差别很大，说明不是海带配子体。综合上述，RAPD，ISSR和AFLP三种DNA分子标记技可以对海带种质资源进行鉴定、评估，为海带科学保种、选种提供依据。

羊栖菜养殖品系DNA指纹分析及遗传变异的研究

羊栖菜是重要的大型经济海藻之一，在食品、医药、化工领域都有广泛应用。本研究对羊栖菜养殖生产中常见的品系“鹿丰1号”及另外2种品系进行了DNA指纹分析及遗传变异的研究，构建了遗传指纹图谱，分析了不同种群的遗传关系，为羊栖菜的种质鉴定及遗传选育提供了理论依据。 运用RAPD分子标记技术，对5个羊栖菜的种群中共125个个体进行了分析，从300个引物中筛选出12条随机扩增引物共扩增135个位点，多态位点比率为84.4%。从中选择了4个多态性位点，构建了5种羊栖菜DNA指纹图谱，并获得了“鹿丰1号”SCAR标记。另外，进行了5种羊栖菜种群的遗传背景的分析，结果表明“鹿丰1号”与品系2可以明显的与野生种群分开。根据Dice常数计算所得的5个种群的遗传距离在0.1116-0.2563之间。 运用ISSR分子标记技术，对5个种群的125个羊栖菜个体进行分析，通过90条引物的筛选，获得10条ISSR引物，扩增出92个位点，多态位点比率为67.4%。5个种群的遗传距离在0.0863-0.1454之间。 本研究以铜藻作为外群，通过2种遗传标记分析，证明铜藻与5种羊栖菜种群的遗传距离均远远大于其种群之间的遗传距离；另外，“鹿丰1号”不同年份的种群之间的遗传距离均为其中的最小值，相关结果对羊栖菜遗传选育和种质鉴定等有参考价值。

Cytological and Molecular Identification of Alien Chromatin in Giant Spike Wheat Germplasm

Alien chromosomes of twelve giant spike wheat germplasm lines were identified by C-banding, genomic in situ hybridization (GISH), sequence characterized amplified region (SCAR), and random amplified polymorphic DNA (RAPD). All lines showed a chromosome number of 2n = 42, five of them carried both a pair of wheat-rye (Triticum aestivum-Secale cereal) 1BL/1RS translocation chromosomes and a pair of Agropyron intermedium (Ai) chromosomes, three carried a pair of Ai chromosomes only, three others carried a pair of 1BL/1RS chromosomes only, and one carried neither 1BL/1BS nor Ai chromosome. Further identification revealed that the identical Ai chromosome in these germplasm lines substituted the chromosome 2D of common wheat (Triticum aestivum L.), designated as 2Ai. The genetic implication and further utilization of 2Ai in wheat improvement were also discussed.

Computação da Seleção Genômica Ampla (GWS).

Métodos para GWS; Teoria dos métodos de regressão; Computação do método Random (Ridge) Regression BLUP (RR-BLUP/GWS); Fenótipos corrigidos; Frequências alélicas, variância dos marcadores e herdabilidade; Marcadores codominantes (SNP) ? Modelo genotípico; Marcadores dominantes (DArT) - Modelo genotípico; Marcadores codominantes (SNP) ? Modelo gamético ou alélico; Número de marcadores com efeitos significativos; Populações de estimação, validação e seleção; População de validação e Jacknife; Correlação e regressão entre valores genéticos preditos e fenótipos na população de validação; Análise de associação na GWAS; Software Selegen Genômica: Random (Ridge) Regression BLUP: RR-BLUP/GWS; Exemplo aplicado ao melhoramento do eucalipto.

A biotecnologia nos programas de melhoramento de forrageiras tropicais da Embrapa Gado de Corte.

Neste trabalho procurou-se apresentar e discutir, de forma ampla, o uso da biotecnologia e seu potencial para os programas de melhoramento de forrageiras tropicais realizados na Embrapa Gado de Corte. O uso da biotecnologia nesses programas é uma atividade recente, mas importantes resultados vêm sendo gerados a fim de auxiliar o processo de obtenção de novas cultivares forrageiras. A maioria dos trabalhos apresentados utiliza marcadores Random Amplification of Polymorphic DNA (RAPD) para aplicações em curto prazo: estudos de diversidade em acessos de bancos de germoplasma, identificação de híbridos e estimação da taxa de cruzamento. Aplicações em médio e longo prazos do uso de marcadores, como mapeamento genético e seleção auxiliada por marcadores moleculares (SAMM), ainda necessitam de maiores investimentos, tanto na busca de novos marcadores, quanto no desenvolvimento de populações adequadas para esses estudos. Em 2007, teve início uma nova linha de pesquisa nessa unidade, a prospecção de genes com características econômicas. Genes para a tolerância ao alumínio são o foco dessa pesquisa que pretende explorar a sintenia entre os genomas de gramíneas, visando ao desenvolvimento de cultivares de braquiária mais tolerantes ao alumínio. A Embrapa Gado de Corte vem investindo em pessoal e aquisição de equipamentos para avançar não só na produção de cultivares de forrageiras mais adaptadas às necessidades de um mercado cada vez mais exigente, como também no crescimento institucional do setor de biotecnologia.

Otimização de protocolo para análise de AFLP em Lolium multiflorum Lam.

ESTABELECIMENTO DE METODOLOGIA PARA ANÁLISE MOLECULAR DE AZEVÉM ANUAL COM MARCADORES AFLP. O uso de marcadores moleculares no manejo de bancos de germoplasma tem sido cada vez mais expressivo. Entre os diferentes tipos de marcadores moleculares, o AFLP, Amplified Fragment Length Polymorphism, apresenta algumas vantagens para uso na caracterização de recursos genéticos, como a detecção de grande número de bandas informativas por reação, com ampla cobertura do genoma e considerável reprodutibilidade, além de não necessitar de dados de seqüenciamento prévio da espécie para a construção de primers. Embora a análise de AFLP seja freqüentemente utilizada em estudos de variabilidade genética em diferentes espécies, o uso da técnica em Lolium multiflorum ainda é incipiente. Com a finalidade de estabelecer um protocolo para o emprego da técnica de AFLP em azevém anual foi conduzido este trabalho. Foram avaliadas as concentrações iniciais de DNA genômico de 100 e 250 ng, a digestão do DNA com 1,25 e 1U das enzimas EcoRI e MSe, e os respectivos tempos de reação de digestão: 3, 6 e 12 horas. Também foram avaliadas quatro concentrações da solução resultante da ligação dos adaptadores: solução sem diluição; diluída 1:5; 1:10 e 1:20 e duas diluições após a reação de pré-amplificação, de 1:25 e 1:50. Como resultado, foi estabelecido como melhor protocolo, no qual foi obtido um maior número e qualidade de fragmentos, o que utiliza a concentração inicial de DNA genômico de 100 ng, num volume final de reação de digestão 10 ?l, com 1U de cada enzima EcoRI e MseI e tempo de reação de 12h a 37°C, com reação de ligação de adaptadores realizada com a adição da solução de ligação de adaptadores, do Kit AFLP? Analysis System I (InvitroGen Life Technologies, Carlsbad, Calif., USA), e 0,4 U de T4 DNA ligase em um volume final de 10?l, por 2h a 20°C. Após a ligação de adaptadores a diluição deverá ser de 1:5. A reação de pré-amplificação deverá ocorrer a partir de 1?l desta última solução (diluída 1:5), 1,0 X PCR buffer com Mg Plus [Tris-HCl (pH 7.6) 20 mM, MgCl2 1,5 mM, KCl 50 mM], BSA 0,003% e 1 U de Taq DNA polimerase, completando com mix de pré-amplificação do Kit AFLP? Analysis System I até alcançar o volume final de 11?l. O produto da pré-amplificação deverá ser diluído 1:25 antes de ser procedida à amplificação seletiva, a qual deve ser realizada utilizando 2,5 ?l da solução de DNA pré-amplificado (diluído 1:25), 1 X PCR buffer com Mg Plus [Tris-HCl (pH 8,4) 20 mM, MgCl2 1,5 mM, KCl 50 mM], BSA (0,003%), 1 U de Taq DNA polimerase, 10 ng de primer EcoRI, 1,5 ng de primer MseI, 0,4mM de DNTps e H2O MilliQ? até completar o volume final de 10?l. Com este protocolo uma única combinação de primers permitiu identificar 58 bandas polimórficas na análise de duas populações de azevém anual.

Identificação morfológica de isolados de Colletotrichum spp. Causadores de antracnose em solanáceas.

As solanáceas são um grupo de plantas de elevado interesse econômico. Fungos do gênero Colletotrichum encontram-se dentre os principais patógenos das solanáceas. Os objetivos deste trabalho foram identificar isolados de Colletotrichum, coletados em hospedeiras solanáceas, ao nível de espécie por meio de caracteres morfológicos bem como estabelecer a espécie predominante em solanáceas. Quarenta e cinco isolados foram obtidos de várias espécies foram observados em microscópio óptico para determinar o tamanho e forma de seus conídios. Com base em caracteres morfológicos, observou-se uma prevalência de C. gloeosporioides em relação a C. acutatum entre a população de isolados avaliada. Houve diferença entre medidas de conídios dos isolados, porém uma relação com o formato dos mesmos não pôde ser encontrada. A morfologia pode ser utilizada para distinção de espécies de forma preliminar. No entanto, para se ter mais confiança na identificação das mesmas, estudos complementares utilizando marcadores moleculares são necessários.

Caracterização de isolados de Phytophthora nicotianae obtidos de tomate, berinjela e jiló.

O gênero Phytophthora apresenta várias espécies patogênicas a hortaliças, entre elas P. nicotianae destaca-se como agente causal de podridões de frutos em tomate, berinjela e jiló. É importante gerar conhecimento sobre o quão agressivo determinado organismo é, a qual grupo de compatibilidade ele pertence e seu nível de sensibilidade aos fungicidas empregados no seu controle, no sentido obter o máximo de informações sobre o patógeno, a fim de buscar formas eficientes no manejo das doenças. Este trabalho teve o objetivo de caracterizar isolados de P. nicotianae, obtidos de frutos de tomate berinjela e jiló. Para isto foram realizados três experimentos distintos no Laboratório de Fitopatologia da Embrapa Hortaliças, com os marcadores biológicos grupos de compatibilidade, agressividade e resistência ao metalaxyl. Dos 39 isolados, caracterizados quanto ao grupo de compatibilidade, 23 apresentaram o grupo A1 e 16 o grupo A2, sendo que em apenas de um campo de cultivo (localizado em Cristalina - GO) ocorreram isolados de ambos os grupos. Quanto à agressividade foi verificado neste trabalho que P. nicotianae não demonstrou especificidade por nenhum dos seus hospedeiros de origem. Foram testados 32 isolados de P. nicotianae para verificar a resistência ao metalaxyl e, destes, apenas um apresentou resistência, oito foram intermediários e os outros 23 foram sensíveis à ação do fungicida. Tais resultados demonstraram uma alta eficiência do metalaxyl no controle de P. nicotianae fato que pode ser explicado pelo não uso deste fungicida em doenças causadas por este patógeno.

Bioquímica molecular como ferramenta para conservação e uso da biodiversidade agrícola tropical: desenvolvimento de marcador imunoquímico para identificação da bactérias endofíticas do milho.

Marcadores moleculares estão sendo amplamente utilizados na agricultura. Entre as várias aplicações práticas, destacam-se a identificação de raças, linhagens e estirpes, eliminação de réplicas em bancos de germoplasma, identificação de genes associados com a performance da planta, entre outros. Em todos esses casos, a definição da estratégia que deverá ser adotada precisa considerar os custos para a obtenção dos marcadores. Ênfase crescente tem sido dada para identificar marcadores menos onerosos. Marcadores bioquímicos constituem um tipo especial de marcador molecular que se caracteriza pela análise do produto da expressão gênica. Destacam-se dois tipos principais: isoenzimas e proteínas. Esses marcadores também são definidos como marcadores fenotípicos, pois podem resultar da interação genótipo/ambiente. Embora de aplicação limitada, o uso desses marcadores em algumas áreas ou em casos especiais fornece informações seguras e úteis para a identificação de indivíduos. Recentemente, as técnicas de SDS-PAGE, RAPD-PCR, ARDRA e seqüenciamento de genes ribossomais foram empregadas no Laboratório de Bioquímica Molecular de Microrganismos da Embrapa Milho e Sorgo, para identificar bactérias endofíticas isoladas do milho. Naquele estudo, foi verificada, em todos os isolados, a presença de um polipeptídio de aproximadamente 42 kDa e cuja expressão era bastante elevada. O objetivo deste trabalho consistiu em aprofundar os estudos sobre o polipeptídio de 42 kDa, visando o desenvolvimento de marcadores imunoquímicos para identificar e estudar a dinâmica de colonização bactérias endofíticas em plantas de milho.

Milho Bt: teoria e prática da produção de plantas transgênicas resistentes a insetos-praga.

A biotecnologia moderna está gerando um grande número de genes passíveis de serem utilizados para a melhoria genética do milho, e as técnicas de transformação genética de plantas poderão ser empregadas para alterar a funcionalidade in vivo destes genes via complementação, superexpressão ou silenciamento. Progressos expressivos foram conseguidos no desenvolvimento da tecnologia de transformação genética de milho na última década. A transformação genética do milho, considerada por algum tempo problemática, tornou-se, atualmente, um procedimento de rotina para vários genótipos na maioria dos laboratórios públicos e privados trabalhando com esta cultura. Nesta Circular Técnica, serão abordados aspectos da produção e utilização em campo do milho Bt, englobando desde as pesquisas iniciais para o isolamento e caracterização dos genes cry, sua transferência para cultivares de milho via biobalística ou Agrobacterium, sua integração em programas de melhoramento clássico assistido por marcadores moleculares e utilização destas novas cultivares em campo.