Clinical proteomics : a focus on transformed human T and B lymphocytes

Résumé large public La protéomique clinique est une discipline qui vise l'étude des protéines dans un but diagnostique ou thérapeutique. Nous avons utilisé cette approche pour étudier les lymphocytes T «tueurs » ou cytotoxiques qui font partie des globules blancs du système sanguin et agissent dans la lutte contre les infections et les tumeurs. Ces cellules sont impliquées dans l'immunothérapie cellulaire qui se fonde sur la capacité naturelle des ces lymphocytes à repérer les cellules tumorales et à les détruire. L'introduction du gène de la télomérase dans les lymphocytes T résulte en une prolongation de leur longévité, ce qui en ferait des candidats intéressants pour l'immunothérapie cellulaire. Il subsiste cependant des doutes quant aux conséquences de l'utilisation de ces lymphocytes «immortalisés ». Pour répondre à cette question, nous avons comparé le profile protéique de lymphocytes T cytotoxiques «jeunes » et vieux » avec celui des lymphocytes «immortalisés ». Nous avons trouvé que ces derniers présentent une double face et partagent à la fois les caractéristiques de la jeunesse et de la vieillesse. Dans une seconde étude de protéomique clinique, nous nous sommes penchés sur les lymphocytes B «immortalisés » cette fois-ci non pas avec la télomérase, mais avec le virus d'Epstein-Barr. Ces derniers sont utilisés comme modèle dans l'étude de la leucodystrophie, une maladie génétique rare qui affecte le cerveau. Notre but est d'identifier des marqueurs biologiques potentiels qui pourraient aider le diagnostic et le traitement de cette maladie neurodégénérative. Nous avons pour ce faire comparé les profiles protéiques des lymphocytes B «immortalisés » provenant d'individus sains et malades. Malheureusement, notre analyse n'a pas révélé de différences notoires entre ces deux classes de lymphocytes. Ceci nous permet toutefois de conclure que la maladie n'affecte pas la synthèse des protéines de manière prépondérante dans ces cellules sanguines. En résumé, le travail présenté dans cette thèse montre à la fois le potentiel et les limites de l'analyse des protéines lymphocytaires, dans différentes situations biologiques. Résumé La protéomique clinique ouvre la porte vers de multiples horizons relatifs au traitement de diverses maladies. Ce domaine particulier alliant la protéomique à la médecine, implique l'intervention de la biologie moléculaire et cellulaire. Dans notre étude, nous nous sommes d'abord intéressés aux lymphocytes T CD8+ cytotoxiques dans le contexte de l'immunothérapie adoptive. Le fondement de cette thérapie repose sur la capacité naturelle de ces lymphocytes à reconnaître les cellules tumorales et à les détruire chez les patients atteints de cancer. L'introduction du gène de la transcriptase réverse de la télomérase (hTERT) dans les lymphocytes T humains permet de rallonger leur durée de vie, sans toutefois induire d'altérations liées à la transformation. Cependant, des incertitudes subsistent quant à la ressemblance physiologique et biochimique entre ces cellules surexprirnant la télomérase et les cellules normales. Afin de répondre à cette question, nous avons comparé l'expression des protéines de lymphocytes humains T CD8+ «jeunes » et «vieux »avec celle de lymphocytes transduits avec hTERT. Nous avons trouvé que les lymphocytes T surexprimant la télomérase ont un profile protéique intermédiaire, avec certaines expressions protéiques similaires aux jeunes cellules T et d'autres se rapprochant des cellules vieilles. Dans la seconde partie de notre étude, nous nous sommes intéressés aux lymphocytes B transformés avec le virus d'Epstein-Barr provenant de patients atteints d'une maladie génétique rare du cerveau, la leucodystrophie. Dans cette maladie, des mutations dans le facteur de transcription eIF2B, impliqué dans la synthèse protéique, ont été trouvées. Afin d'analyser les conséquences de ces mutations et de trouver des biomarqueurs spécifiques à cette maladie, nous avons effectué une analyse protéomique des lymphoblastes provenant de malades et d'individus sains. Nous avons trouvé que les mutations dans le complexe ubiquitaire eIF2B n'affectent pas de manière significative l'expression des protéines des lymphoblastes mutés. En conclusion, notre travail illustre le potentiel et les limitations des technologies protéomiques utilisées pour disséquer l'implication des protéines dans différentes situations biologiques. Summary Clinical proteomics opens the door to multiple applications related to the treatment of diseases. This particular field is at the crossroad of proteomics and medicine and involves tools from cellular and molecular biology. We focused first our investigations on cytotoxic T cells in the context of adoptive immunotherapy, which is an interesting and evolving field. The basis of this therapy relies on the natural capacity of cytotoxic CD8+ T lymphocytes in recognizing tumor cells and destroying them in cancer patients. As their number is reduced, the idea would be to use transformed T lymphocytes with extended life span. Overexpression of telomerase into human T lymphocytes results in the extension of their replicative life span, but it still remains unclear whether these cells are physiologically indistinguishable from normal ones. To address this question, we compared the proteome of young and aged CD8+ T lymphocytes with that of T cells transduced with hTERT and found that the latter cells displayed an intermediate protein pattern, sharing similar protein expression with young, but also with aged T cells. We were then interested in studying Epstein-Barr virus transformed B lymphocytes in the context of a rare human brain genetic disorder called leukodystrophy. In this disease, mutations in the ubiquitous factor eIF2B involved in protein synthesis and its regulation have been reported. In order to analyze the functional consequences of the mutations and to find out specific biomarkers of eIF2B-related disorders, proteomic and peptidomic studies were carried out on lymphoblasts from eIF2Bmutated patients versus healthy patients. Following two-dimensional gel electrophoresis and mass fingerprints, mutations in the eIF2B complex did not appear to significantly affect the proteome of the mutated lymphoblasts extracts. To conclude, our work emphasizes the potentials and the limitations of the proteomic technologies used to analyze the role of lymphocyte proteins in different biological situations.

Role of FGF and Wnt pathways in endoderm patterning and pancreas organogenesis

Summary Between gastrulation and gut tube formation, the endoderm becomes regionally specified along the anterior-posterior axis. An early sign of patterning is the expression of organ-specific genes in restricted endoderm domains. We studied the role of the fibroblast growth factor (FGF) and Wnt pathways in the establishment of the antero-posterior (A-P) axis domains. Here we report the first evidence that graded FGF4-mediated signaling establishes gut tube domains along the A-P axis in vivo from gastrulation to somitogenesis. At gastrulation, FGF4 may act cooperatively with Wnts, since both of them affect the gut tube patterning by promoting posterior and inhibiting anterior endoderm cell fate. The activity of the Wnt pathway is however time restricted, since. it does not affect patterning at somitogenesis. Our experiments point to a global mechanism that coordinates the A-P patterning of all three primary germ layers. Soon after regionalization of the gut tube, morphogenetic evidences of organogenesis appear. We focused our attention on one of these organs, the pancreas. We report a comprehensive investigation of the activity and the role of the Wnt pathway in pancreas organogenesis. We have used two mouse reporter lines to monitor canonical Wnt-pathway activity during development and after birth and demonstrate activity in early pancreatic bud, endocrine cells and in the mesenchyme. We have specifically deleted the ß-catenin .gene, a key component of the Wnt pathway, in the epithelium of the pancreas and duodenum using Pdxl -Cre mice. In agreement with Wnt pathway activity in pancreatic endocrine cells, we find a reduction in endocrine islet numbers. Our study reveals that ß-catenin deletion also affects cells in which Wnt pathway activity is not detected. Indeed, ß-catenin mutant cells have a competitive disadvantage during development that also' affects the exocrine compartment. Moreover, the conditional KO mice develop acute edematous pancreatitis perinatally due to the disruption of the epithelial structure of acini. These effects are likely to be due to the function of ß-catenin at the membrane. Résumé Entre la gastrulation et la formation du tube digestif, l'endoderme est progressivement régionalisé le long de l'axe antéropostérieur (A-P). Un des premiers signes de cette régionalisation est l'expression de gènes spécifiques à certains organes dans une région restreinte. Nous avons étudié l'implication des voies de signalisation FGF et Wnt dans l'établissement de la régionalisation A-P. Nous rapportons les premières preuves que FGF4 établit la ségrégation des domaines de l'endoderme le long de l'axe A-P in vivo de la gastrulation à la somitogenèse. Cette activité peut être menée en collaboration avec les Wnts, puisque ceux-ci influencent aussi l'endoderme en inhibant le destin antérieur et en induisant le destin postérieur des cellules. Cette activité des Wnts est perdue à la somitogenèse. Nos expériences démontrent une régionalisation coordonnée des trois feuillets germinaux le long de l'axe A-P. Peu après la régionalisation, les premiers signes morphologiques de l'organogenèse apparaissent. Nous nous sommes intéressés au rôle des Wnts dans un des dérivés de l'endoderme : le pancréas. Nous avons utilisés deux lignés de souris rapportrices de l'activité de la voie canonique des Wnts, qui montrent une activité dans le bourgeon précoce du pancréas avant la différentiation, puis plus tard dans les cellules endocrines et le mésenchyme. Nous avons utilisé la souris transgénique Pdxl -Cre pour inactiver spécifiquement le gène de la ß-caténine, un intermédiaire de la voie des Wnts, dans la région pancréatique. En accord avec l'activité de la voie de signalisation Wnt, la perte de la ßcaténine conduit à une réduction du nombre de cellules endocrines. De plus certaines cellules qui ne montrent aucune activité de la voie Wnt sont aussi affectées. En effet, les cellules ayant perdu la ß-caténine ont un désavantage compétitif face aux cellules sauvages dans un environnement mosaïque. Cette compétition résulte en l'absence de cellules déplétées en ßcaténine chez l'adulte. De plus, vers la naissance, les animaux déficients pour la ß-caténine développent une pancréatite aiguë due à la destruction de l'architecture des acini. Ceci est probablement aux fonctions d'adhésion de la ß-caténine à la membrane.

Defining molecular components of symbiotic phosphate uptake in rice

Phosphate (Pi) acquisition of crops via arbuscular mycorrhizal (AM) symbiosis acquires increasing importance due to the limited rock Pi reserves and the demand for environmentally sustainable agriculture. However, the symbiotic Pi uptake machinery has not been characterized in any monocotyledonous plant species. Among these, rice is the primary staple food for more than half of the human population and thus central for future food security. However, the relevance of the AM symbiosis for rice Pi nutrition is presently unclear. Here, we show that 70% of the overall Pi acquired by rice is delivered via the symbiotic route. To better understand this pathway we combined genetic, molecular and physiological approaches to determine the specific functions of the two rice Pi transporters, PT11 and PT13, which are expressed only during AM symbiosis. The PT11 lineage of proteins is present in mono- and dicotyledons whereas PT13, while found across the Poaceae, is absent from dicotyledons. Surprisingly, mutations in either PT11 or PT13 affected fungal colonization and arbuscule formation demonstrating that both genes are essential for AM symbiosis between rice and Glomus intra.rad.ices. Importantly, for symbiotic Pi uptake, only PT11 is necessary and sufficient. We found that mycorrhizal rice, remarkably, received almost all Pi via the symbiotic route. Such dominating mycorrhizal Pi uptake was found in plants grown under controlled conditions as well as in field soils, suggesting that the AM symbiosis is relevant for the Pi nutrition of field grown rice. Development of smaller arbuscules in PT11 mutants suggested that symbiotic Pi signaling is required for fungal nourishment by the plant. However, co-culture of mutant with wild type nurse plants did not restore normal arbuscule size in mutant roots, indicating that other factors than malnutrition accounted for the altered arbuscule phenotype. Surprisingly, the loss of PT13 did not affect symbiotic Pi uptake although it impacted arbuscule morphology, suggesting that PT13 is involved in signaling during arbuscule development. However, induction of PT13 was not only monitored in arbusculated cells but also in inner cortex cells of non-inoculated roots of plants grown under high Pi fertilization conditions. According to preliminary observations, PT13 localized at the tonoplast in arbusculated and non-arbusculated cells, suggesting that it might be involved in transporting Pi into the vacuole, possibly for maintaining cellular Pi homeostasis. The further investigation showed that fungal colonization level was significantly affected in the crown roots of two ptlS mutant alleles, but not in large lateral roots, implying the possible role of PT13 for maintaining Pi homeostasis in the crown roots. - L'acquisition de phosphate (Pi) par les plantes cultivées s'effectue grâce à une symbiose mycorhizienne arbasculaire (AM). L'étude de cette symbiose devient fondamentale puisque d'une part, les réserves en phosphate minéral sont limitées, et, d'autre part, la demande pour une agriculture écologiquement soutenable se renforce. La machinerie d'absorption symbiotique du phosphate n'est cependant pas encore élucidée chez les plantes monocotylédones. Parmi celles-ci, le riz occupe une place primordiale. Aliment de base pour plus de la moitié de la population mondiale, il revêt de ce fait une dimension essentielle en termes de sécurité alimentaire. Pourtant, l'importance de la symbiose AM chez le riz dans le processus d'acquisition du phosphate n'est, encore de nos jours, que peu comprise. Dans cette étude, nous montrons que 70% du phosphate acquis par le riz est mis à disposition de la plante grâce à la symbiose AM. Afin de mieux comprendre ce mécanisme, nous avons employé des approches physiologiques et génétiques nous permettant de déterminer les fonctions spécifiques de deux transporteurs de Pi, PT11 et PT13, présents chez le riz et exprimés uniquement durant la symbiose AM. La famille de gènes à laquelle appartient PT11 est présente chez les monocotylédones ainsi que chez les dicotylédones tandis que PT13, bien que retrouvé au sein des Poaceae, est absent chez les dicotylédones. Etonnamment, des versions mutées de PT11 ou de PT13 affectent la colonisation par le champignon endo-mycorhizien ainsi que la formation d'arbuscules, démontrant l'importance de ces deux gènes dans la symbiose AM entre le riz et Glomus intraradices. Il est à noter que seul PT11 se révèle nécessaire et suffisant pour l'apport de Pi grâce à la symbiose. Nous avons observé que la presque totalité du phosphate dont dispose le riz lors d'une symbiose AM provient du champignon. De telles proportions ont été observées tant chez des plantes cultivées en conditions contrôlées que chez des plantes cultivées dans les champs. Cela suggère l'importance de la symbiose AM dans le processus d'acquisition du Pi chez le riz cultivé à l'extérieur. Le développement d'arbuscules plus petits chez le mutant PT11 tend à montrer qu'une voie signalétique impliquant le Pi symbiotique est nécessaire pour l'entretien du champignon par la plante. Toutefois, une co-culture du mutant avec des plantes sauvages ne permet pas de restaurer des arbuscules de taille normale dans les racines du mutant. Ce résultat indique le rôle de facteurs autres que la malnutrition aboutissant à la formation d'arbuscules altérés. Si la perte de PT13 n'affecte pas l'acquisition de phosphate symbiotique, la morphologie de l'arbuscule est, quant à elle, modifiée. Ceci suggère un rôle de PT13 durant le développement de l'arbuscule. Or, l'induction de PT13 est non seulement détectée dans des cellules contenant des arbuscules mais également dans des cellules du cortex, ceci chez des plantes cultivées sans champignon mais dans des conditions de fortes concentrations en engrais phosphaté. En accord avec des observations précédentes, PT13 est localisé au niveau du tonoplaste des cellules contenant ou non des arbuscules. Ceci suggère que PT13 pourrait être impliqué dans le transport du Pi vers la vacuole, éventuellement pour maintenir une certaine homéostasie du phosphate. Dans cette étude, nous démontrons également que le niveau de colonisation par le champignon est affecté de manière significative dans les racines principales des deux allèles du mutants ptl3, mais pas dans les grosses racines latérales. Cela impliquerait un rôle possible de PT13 dans le maintien de l'homéostasie du phosphate dans les racines principales. RESUME POUR UN LARGE PUBLIC Le phosphate (Pi), l'un des éléments minéraux essentiel au développement des plantes, se trouve généralement en faible quantité dans le sol, limitant ainsi la croissance des plantes. Le rendement de la production agricole dépend dès lors de l'addition d'engrais contenant du phosphate inorganique (Pi), obtenu à partir de ressources minières riches en phosphate. Or, ces ressources devraient être épuisées d'ici la fin du siècle. Les racines des plantes possèdent des transporteurs de phosphate efficaces leur permettant d'acquérir rapidement le Pi présent dans le sol. Comme le Pi s'avère immobile dans le sol, l'absorption rapide par les racines crée des zones pauvres en Pi autour des systèmes racinaires. Pour surmonter cet obstacle, les plantes ont développé une symbiose avec des champignons endomycorhiziens, la symbiose mycorhizienne arbusculaire (AM). Cette association leur donne accès à d'autres ressources en phosphate puisque le mycélium de ces champignons se développe sur une surface 100 fois supérieure à celle des racines. Cela augmente considérablement la surface de nutrition, dépassant ainsi la zone appauvrie en Pi. Le phosphate, transporté grâce au champignon jusqu'à l'intérieur des racines, est fourni à la plante par le biais de structures établies à l'intérieur des cellules végétales, appelées arbuscules. De leur côté, les plantes possèdent des transporteurs spécifiques afin de recevoir le Pi fourni par les champignons. A l'heure actuelle, la machinerie nécessaire à cette absorption a été uniquement décrite chez des plantes dicotylédones. Or, comprendre l'apport de phosphate par les champignons mycorhiziens s'avère particulièrement pertinent dans le cas des espèces monocotylédones cultivées telles que les céréales. Ces dernières constituent en effet la majeure partie de l'alimentation humaine. Parmi les céréales, le riz demeure l'aliment de base de la population mondiale, d'où son importance en terme de sécurité alimentaire. Durant mon travail de thèse, j'ai identifié et caractérisé le transporteur du riz impliqué dans l'apport de phosphate par ce type de symbiose AM. J'ai également démontré que le riz, lorsqu'il vit en symbiose, bénéficie de la presque totalité du Pi transporté par le champignon. Environ 40% de la production globale de riz est cultivée dans des conditions permettant la symbiose avec des mycorhizes arbusculaires. Les variétés de riz adaptées à ces conditions aérobiques deviennent des alternatives favorables aux cultivars actuels nécessitant une forte irrigation. Elles se révèlent en effet plus tolérantes aux pénuries d'eau et permettent l'utilisation de pratiques agricoles moins intensives. Les données présentées dans cette étude enrichissent nos connaissances concernant l'absorption du phosphate chez le riz grâce à la symbiose AM. Ces connaissances peuvent s'avérer décisives pour le développement de cultivars du riz plus adaptés à une agriculture écologiquement soutenable.

The pleiotropic role of lipoxin A4 and its possible therapeutic use in endometriosis

L'endométriose est l'une des principales causes d'infertilité, caractérisée par une croissance ectopique de tissu endométrial. Sa Physiopathologie est encore mal comprise. En utilisant un modèle expérimental murin, nous avons étudié les mécanismes de développement et de progression de l'endométriose ainsi que l'effet d'un traitement systémique avec la lipoxine A4 (LXA4), un médiateur lipidique aux propriétés anti-inflammatoires. Le traitement à la LXA4 réduit de façon significative la taille des lésions endométriotiques et abaisse le taux de cytokines pro-inflammatoires telles que les interleukines (IL)-lß et d'IL-6. Une production aberrante de stéroïdes par les lésions ainsi qu'un contrôle immunitaire défaillant joue un rôle central dans la pathogenèse. LXA4 diminue l'expression du facteur induit par l'hypoxie (HIF)-la et ses gènes cibles, comme le facteur de croissance de Pendothélium vasculaire (VEGF) et la cyclo-oxygénase (COX)-2, qui diminue la production locale de Prostaglandines E2 ce qui résulterait en un environnement hypo-oestrogénique peritonéal. Outre ses effets anti¬inflammatoires, LXA4 régule l'expression des enzymes de remodelage de la matrice tels les métalloprotéinases matricielles (MMP)-2 et -9 ainsi que le facteur de croissance de transformation (TGF)-ß dans les lésions et les cellules du liquide péritonéal. De plus, le traitement à la LXA4 diminue l'expression de l'aromatase (CYP19A1) ainsi que celle du récepteur des oestrogènes (ER)-a qui module la signalisation des oestrogènes et des gènes impliqués dans la prolifération cellulaire (GREB1, cMyc et CCND1). Finalement, lorsque la LXA4 est donnée après l'apparition de la maladie, le traitement est encore efficace sur le contrôle de la croissance des lésions. En conclusion, ces nouvelles découvertes mettent en valeur un répertoire potentiel de cibles pour le traitement de l'endométriose et confirment un effet pléiotrope du traitement à la LXA4 sur la progression de la maladie : en diminuant les médiateurs pro-inflammatoires et angiogéniques, les enzymes de remodelage de la matrice, ainsi que le métabolisme et la signalisation de l'oestrogène, et en intervenant en aval de la cascade de gènes impliqués dans la prolifération. Ainsi, nos résultats désignent LXA4 comme agent thérapeutique potentiel pour le traitement de l'endométriose péritonéale.

SEPT4, a p53 target gene product, implicates p 53 in the regulation of exocytosis

Résumé : Le cancer, qui est responsable d'un quart des décès en Suisse, exhibe un état cellulaire désordonné, qui lui-même, est la conséquence d'un dérèglement des gènes. Le gène le plus fréquemment altéré, dans les cas de cancers humains, est p53. Ce gène encode un facteur de transcription, impliqué dans la régulation de nombreux gènes impliqués dans le cycle cellulaire, l'apoptose ou la différenciation. Notre laboratoire a récemment identifié seize nouveaux gènes, dont l'expression est régulée par p53, parmi lesquels sept4, su jet de cette thèse. La protéine 5EPT4 appartient à la famille des septines, qui est impliquée dans la cytokinèse. Dans ce travail, nous avons confirmé la régulation de l'expression de sept4 par p53 dans des tissus de souris, et étonnamment, seul un des deux promoteurs du gène sept4 est contrôlé par p53. En outre, l'approche immunohistologique nous a permis de supposer une implication de la protéine SEPT4 dans le mécanisme de l'exocytose. Cette hypothèse a été confirmée par l'interaction de SEPT4 avec la protéine syntaxine 1A, et par son activité inhibitrice sur la sécrétion stimulée. En élargissant l'étude de la protéine SEPT4, nous avons découvert que celle-ci avait comme partenaire fonctionnel, la protéine Pinl, une enzyme qui catalyse l'isomérisation cis-trans du lien peptidique précédant une proline. bans ce contexte, nous avons démontré que l'interaction entre ces deux protéines reposait sur le domaine WW de Pinl, un type de domaine reconnaissant les motifs phosphoséryl-prolyl et phosphothréonyl-prolyl. Ce dernier résultat nous a conduit à examiner la phosphorylation de 5EPT4. Nous avons démontré que la partie N-terminale de SEPT4 était phosphorylée par la kinase Cdk5. La co¬expression de Cdk5 et de SEPT4 stimule la dégradation de SEPT4, indépendamment de la voie du protéasome. Ainsi, l'ensemble de nos observations fournissent l'évidence de l'engagement de la protéine SEPT4 dans la régulation de l'exocytose, et soutiennent le rôle de p53 dans le contrôle de l'exocytose, via SEPT4, ce qui constituerait un nouveau rôle fonctionnel pour ce gardien du génome. Summary: Cancer, which is responsible for a quarter of the deaths in Switzerland, exhibits a disordered cellular state, which itself, is the consequence of an altered state of genes. The most frequently altered gene in human cancer is p53. This gene encodes a transcription factor, implicated in the regulation of numerous genes involved in cell cycle, apoptosis or differentiation. Our laboratory has recently identified sixteen new genes whose expression is regulated by p53, amongst them septin 4, which is the subject of this thesis. The SEPT4 protein belongs to the septin family which is implicated in cytokinesis. In the present work, we have confirmed the regulation of sept4 expression by p53 in mouse tissues, and surprisingly, only one of the two sept4 promoters is regulated by p53. In addition, the immunohistologic approach enabled us to suppose a role of SEPT4 in exocytosis. This assumption was confirmed by the interaction of SEPT4 with syntaxin 1A, and by its inhibiting activity on stimulated secretion. By widening the analysis of SEPT4, we identified Pin1 as an interacting protein. Pin1 is an enzyme which catalyzes the cis-trans isomerization of the peptide bond preceding a proline residue. In this context, we showed that the interaction between these two proteins depends on the WW domain of Pin 1. This domain has been shown to function as a phosphoserine- or phosphothreonine¬binding module. This last result prompted us to examine phosphorylation of SEPT4. We demonstrated that the N-terminal portion of SEPT4 was phosphorylated by the Cdk5 kinase. The co-expression of Cdk5 with 5EPT4 stimulates SEPT4 degradation, independently of the proteasome pathway. Thus, these observations provide evidence for the engagement of SEPT4 in the regulation of exocytosis, and supports the role of p53 in the control of exocytosis, via SEPT4, which constitutes a new functional role for this guardian of the genome.

La diminution de l'activité du répresseur ICER dans les adipocytes est responsable de la résistance à l'insuline dirigée par le facteur CREB dans l'obésité [The decreased activity of the repressor ICER in adipocytes is responsible for insulin resistance led by factor CREB in obesity.]

Introduction: Une élévation de l'activité des facteurs de transcription CREBs dans le tissu adipeux est en partie responsable de l'insulino-résistance systémique dans l'obésité. Le facteur «Inducible cAMP early repressor» (ICER) est un répresseur transcriptionnel passif dont le niveau d'expression antagonise l'activité des CREBs. L'objectif de ce travail adipocytaire des CREBs dans l'obésité chez l'Homme et la souris. Matériels et méthodes: Du tissu adipeux blanc (TAB) a été prélevé chez des souris obèses nourries sous une diète normale et des souris obèses nourries sous un régime riche en graisses pendant 12 semaines. Des biopsies de tissu adipeux viscéral (TAV) ont été prélevées chez les sujets humains minces (BMI = 24 ± 0,5 kg/m2) et obèses (BMI > 35 kg/m2). L'expression des gènes est quantifiée par RT-PCR quantitative. L'activité des CREBs et d'ICER est mesurée par des expériences de retard sur gel. L'activité des histones déacétylases est quantifiée par dosage colorimétrique. Résultats: L'expression et l'activité d'ICER sont diminuées dans le TAB des souris obèses, hyper-glycémiques et insulino-résistantes. De même, l'activité d'ICER est réduite dans le TAV des sujets humains obèses. Cette réduction corrèle avec une augmentation de l'activité des CREBs, une réduction de l'expression de Glut4 et de l'adiponectine, à la fois chez l'Homme et la souris. La diminution de l'expression d'ICER n'est observée que dans la fraction adipocytaire du tissu adipeux. L'expression d'ICER est contrôlée par l'activité des HDACs. L'inhibition des HDACs inhibe l'expression d'ICER dans les adipocytes. L'activité totale des HDACs est réduite dans les tissus adipeux chez les souris et chez les sujets humains obèses. Conclusion: La diminution de l'activité d'ICER dans les adipocytes par une modification de l'activité des HDACs serait responsable de l'augmentation de l'activité des CREBs dans l'obésité.

The role of the δ-opioid receptor in skin homeostasis and wound healing

Au regard des agressions environnementales constantes que la peau doit endurer, l'équilibre fragile entre l'expression et la répression des gènes épidermiques, nécessaire à la différentiation et la prolifération des kératinocytes, pourrait facilement être perturbé en l'absence des mécanismes de stabilisation robustes. La présence d'un système neuroendocrinien local est donc importante afin de coordonner une réponse aux éventuelles irritations. En effet, l'expression de plusieurs neurohormones, des neurotransmetteurs et des neuropeptides, y compris des dérivés pro-opiomélanocortine comme la ß-endorphine et [Met5]-enképhaline, ainsi que l'expression du récepteur 8-opioïde (DOR) a été démontré dans la peau. Cependant, les mécanismes moléculaires par lesquels ils modulent la fonction des kératinocytes sont mal connus. Le présent travail démontre que la voie de signalisation DOR active spécifiquement la voie ERK 1/2 MAPK dans les lignées cellulaires de kératinocytes humains, inhibant la prolifération des cellules et entraîne une diminution de l'épaisseur épidermique dans un modèle organotypique de peau. De plus, l'expression de DOR retarde nettement l'induction de la kératine 10 (KRT 10) et la kératine 1 (KRT 1) dans une modèle 2D de différentiation in vitro, et supprime l'induction de KRT 10 dans un modèle organotypique de peau. Ceci est accompagné de la dérégulation de l'involucrine (IVL), la loricrine (LOR) et la fïlaggrin (FLG), résultant en une induction nettement réduite de leur expression lors de l'initiation de la différentiation in vitro. De plus, POU2F3 a été identifié comme un facteur de transcription régulant les gènes de différentiation des kératinocytes modulés par DOR. Il a été démontré que la régulation négative de POU2F3 via la voie DOR-ERK affecte les principaux aspects de la fonction des kératinocytes. Toutefois, il est évident que des facteurs supplémentaires influencent la fonctionnalité de la voie DOR elle-même. Le calcium et le contact cellule-cellule augmentent la quantité des récepteurs à la surface cellulaire des kératinocytes. Les kératinocytes dont les récepteurs sont internalisés ne répondent pas de la même manière que ceux possédant des récepteurs fonctionnels localisée à la membrane. Ce travail suggère que lors de signaux intrinsèques ou extrinsèques spécifiques, les kératinocytes sont capable de répondre via le système opioïdergique neuro-epidermique. Cette réponse doit être spatialement et temporairement contrôlée afin d'éviter un déséquilibre de l'homéostasie épidermique et un retard de cicatrisation. La compréhension de ce processus très complexe pourrait permettre à terme le développement de meilleurs traitements des affections cutanées pathologiques. En complément des études précédentes sur des souris DOR-défïcientes, ces données suggèrent que l'activation de DOR dans les kératinocytes humains influence la morphogenèse et l'homéostasie de l'épiderme, et pourrait jouer un rôle lors du processus de cicatrisation. - In view of the constant environmental assaults that the skin must endure, the delicate balance of an eloquent sequence of epidermal gene expression and repression, that is required for appropriate differentiation and proliferation of keratinocytes, might easily become derailed in the absence of robust stabilizing mechanisms. The presence of a local neuroendocrine system is thereby important to coordinate a response towards irritations. In fact, the expression of several neurohormones, neurotransmitters, and neuropeptides, including proopiomelanocortin derivatives, such as ß- endorphin and [Met5]-enkephalin has been shown in skin, as well as expression of the 6-opioid receptor (DOR). However, there is currently a lack of understanding of the molecular mechanisms by which their signalling modulates keratinocyte function. The present work demonstrates that DOR signalling specifically activates the ERK 1/2 MAPK pathway in human keratinocyte cell lines. This activation inhibits cell proliferation, resulting in decreased epidermal thickness in an organotypic skin model. Furthermore, DOR expression markedly delays induction of keratin intermediate filament Keratin 10 (KRT 10) and KRT 1 during in vitro differentiation, and abolishes the induction of KRT 10 in the organotypic skin model. This is accompanied by deregulation of involucrin (IVL), loricrin (LOR), and filaggrin (FLG), illustrated by a markedly reduced induction of their expression upon initiation of differentiation in vitro. Additionally, POU2F3 was identified as a transcription factor mediating the DOR induced regulation of keratinocyte differentiation related genes. It was revealed that DOR-mediated ERK-dependent downregulation of this factor affects key aspects of keratinocyte function. However, it is evident that additional triggers influence the functionality of the DOR itself. Calcium at concentrations above 0.1 mM and cell-cell contact both enhance the presence of receptor molecules on the keratinocytes cell surface. Keratinocytes with internalized receptor do not respond to DOR ligands in the same way as keratinocytes with a functional membrane localized receptor.

Copy number variation modifies expression profiles over developmental time

Abstract : A preliminary understanding of the phenotypic effect of copy number variation (CNV) of DNA segments is emerging. These rearrangements were shown to influence, in a somewhat dose-dependent manner, the expression of genes mapping within them. They were also shown to modify the expression of genes located on their Hanks, sometimes at great distance. Here, we demonstrate by monitoring these effects at multiple life stages, that these controls over expression are effective throughout mouse development. Similarly, we observe that the more specific spatial expression patterns of CNV genes are maintained through life. However, 'we find that some brain- expressed genes mapping within CNVS appear to be under compensatory loops only at specific time-points, indicating that the effect of CNVS on these genes is modulated during development. Notably, we also observe that CNV genes are significantly enriched within transcripts that show variable time-course expression between strains. Thus, modifying the copy number of a gene may potentially alter not only its expression level, but its timing of expression as well. Résume : Nous commençons à comprendre les effets phénotypiques liés aux séquences d'ADN qui changent de nombre de copies d'un individu a l'autre. Des travaux précédents ont montré que ces variante de nombre de copies (CNVS) avaient une influence sur l'expression non seulement des gènes se trouvant dans le réarrangement, mais aussi sur ceux se trouvant à une certaine distance. Le présent travail étudie ces effets à différents stades du développement de la souris allant d'un embryon de deux semaines à la souris adulte. Nous avons observé que certains gènes exprimés dans le cerveau semblent soumis à un contrôle plus strict a certaines étapes du développement suggèrent que l'effet des CNVs est modulé différemment au cours de la vie. Notre travail sur trois souches différentes de souris a permis de montrer que les gènes ayant un profil d'expression différent dans le temps entre souches sont enrichis en gènes se trouvant dans des CNVs. Ceci nous amène à penser que les CNVs ont, non seulement une influence sur le niveau d'expression des gènes, mais aussi sur les moments durant lesquels ils seront exprimés. Résumé pour un large public : De nombreuses maladies sont dues soit a un gain (on parle alors de duplication) soit à une perte de matériel génétique (il s'agit dune délétion). Bien que les recherches visant à identifier les mécanismes moléculaires liés à ces réarrangements de notre génome progressent continuellement, la plupart des causes des maladies génétiques restent à élucider. Certaines parties de notre génome sont présentes en un nombre de copies qui diffère d'un individu à l'autre sans pour autant provoquer une ou des maladies. Ces segments d'ADN qui varient en nombre sont appelés Copy Number Variant (CNVs). Ils couvrent environ 12% de notre matériel génétique. Des études menées sur différents modèles animaux ont montré que les CNVs avaient une influence aussi bien sur les gènes qui sont a l'intérieur des CNVs que sur ceux qui sont dans leur voisinage. Ce travail étudie l'effet des CNVs à travers différents stades du développement de la souris. Nous avons démontré que les segments d'ADN qui varient en nombre de copies ont des effets variables selon le stade auxquels ils sont mesurés. Ainsi, les CNVs ont non seulement un impact sur l'expression des gènes présents dans ces régions et dans leur voisinage, mais influencent également leurs profils d'expression au cours du temps.

Perinuclear Mlp proteins down-regulate gene expression in response to a defect in mRNA export

Résumé Une caractéristique des cellules eucaryotes est le confinement du matériel génétique (ADN/DNA) dans le noyau. Pour décoder cette information, un ARN messager (mRNA) est d'abord transcrit sous forme d'un ARN prémessager (pré-mRNA). Ce-dernier doit subir plusieurs étapes de maturation pour aboutir à une particule ribonucléoprotéique (mRNP) qui sera exportée vers le cytoplasme et traduite en protéine. La protéine de levure Mex67p et son homologue humain TAP sont des récepteurs d'export médiant la translocation du mRNP au travers des complexes du pore nucléaire (NPC). Mex67p/TAP ne se lient pas directement au mRNA, mais nécessitent la présence de protéines adaptatrices, telles que Yra1p et son homologue humain REF1. Afin d'identifier de nouveaux facteurs impliqués dans l'export des mRNPs ou de nouvelles fonctions pour Yra1p, nous avons effectué un crible génétique avec un mutant thermosensible de Yra1p, GFP-yra 1 -8. Ce mutant présente un défaut d'export des mRNAs et une diminution des niveaux de transcrits du gène rapporteur LacZ ainsi que de certains transcrits endogènes. Nous avons trouvé que la perte de Mlp2p, ou d'une protéine hautement similaire, Mlp1p, restaure la croissance du mutant GFP-yra1-8 à température restrictive. Mlp1p et Mlp2p sont des protéines nucléaires, dont l'homologue humain est TPR. Les Mlp (myosin¬like proteins) ainsi que TPR forment des structures filamenteuses ancrées aux NPC. Bien que la fonction des Mlp ne soit pas clairement définie, un rôle dans la biogenèse et la surveillance des mRNPs a été récemment proposé. Notre étude montre que la perte des Mlp, non seulement restaure la croissance de GFP-yra1-8, mais augmente aussi les niveaux des transcrits LacZ et facilite leur apparition dans le cytoplasme. Des expériences d'immunoprécipitations de la chromatine révèlent que Mlp2p diminue le taux de synthèse du transcrit LacZ dans GFP-yra1-8. Des analyses du transcriptome montrent que Mlp2p réduit aussi les niveaux d'une population de transcrits endogènes dans le mutant. Finalement, des localisations in situ suggèrent que la transcription du rapporteur LacZ a lieu à la périphérie du noyau, à proximité des Mlp. Ainsi, les protéines Mlp pourraient préférentiellement diminuer la transcription de gènes exprimés à la périphérie nucléaire. Nous montrons aussi que Yra1p interagit génétiquement avec Nab2p une protéine liée au mRNA et impliquée dans son export, mais non avec d'autres protéines également impliquées dans l'export des mRNAs. Les résultats obtenus soutiennent un modèle où les protéines Yra1p et Nab2p sont nécessaires à l'arrimage des mRNPs sur la plate-forme des Mlp. Si ces signaux manquent ou sont défectueux, les mRNPs ne peuvent pas poursuivre leur trajet vers le canal central du NPC. Ce bloc induirait par la suite une diminution de la transcription d'une population de gènes potentiellement localisée à la périphérie nucléaire. Dans son ensemble, cette étude suggère que les protéines Mlp établissent un lien entre la transcription de certains mRNAs et leur export au travers du pore nucléaire. Summary A hallmark of the eukaryotic cell is the packaging of DNA in the nucleus. To decode the genetic information, a messenger RNA (mRNA) is first synthesized as a pre-mRNA molecule, which undergoes different maturation steps resulting in an mRNP (messenger RNA ribonucleoprotein), which can be actively transported to the cytoplasm and translated into a protein. Yeast Mex67p and its human homologue TAP are export receptors mediating mRNP translocation through the nuclear pore complex (NPC). The recruitment of Mex67p/TAP to mRNA is mediated by mRNA export adaptors of the evolutionarily conserved REF (RNA and Export Factor binding) family: yeast Yra1p and human REF1. To uncover new functions of Yra1p or new factors implicated in mRNA export, we performed a genetic screen with a themiosensitive (ts) yra1 mutant, GFP-yra1-8. This mutant exhibits mRNA export defects and a decrease in the levels of LacZ reporter and certain endogenous transcripts. We found that the loss of Mlp2p, or the related Mlp1p protein, substantially rescues the growth defect of the GFP-yra1 -8 mutant. Mlp1p and M1p2p are large non-essential proteins, homologous to human TPR, proposed to form intra-nuclear filamentous structures anchored at the NPC. Their role is not clearly defined, but they have been implicated in mRNP biogenesis and surveillance. Our study shows that loss of Mlp proteins not only restores growth of GFP-yra1-8, but also rescues LacZ mRNA levels and increases their appearance in the cytoplasm. Chromatin immunoprecipitation and pulse chase experiments indicate that Mlp2p down-regulates LacZ mRNA synthesis in GFP-yra1-8. DNA micro- array analyses reveal that Mlp2p also reduces the levels of a subset of cellular transcripts in the yra1 mutant strain. In situ localizations suggest that LacZ transcription occurs at the nuclear periphery, in close proximity to Mlp proteins. Thus, Mlp proteins may preferentially down-regulate genes expressed at the nuclear periphery. Finally, we show that Yra1p genetically interacts with the shuttling mRNA-binding protein Nab2p and that loss of Mlp proteins rescues the growth defect of yra1 and nab2, but not other mRNA export mutants. The data support a model in which Nab2p and Yra1p are required for rnRNP docking to the Mlp platform. Lack of these signals prevents mRNPs from crossing the Mlp gate. This block may then negatively feed-back on the transcription of a subset of genes, potentially located at the nuclear envelope. Overall, this study suggests that perinuclear Mlp proteins establish a link between mRNA transcription and export.

Analyse des modifications de la chromatine impliquées dans l'effet barrière de CTF1 aux télomères humains

Eukaryotic genomes are compartmentalized in different structural domains that can affect positively or negatively gene expression. These regions of euchromatin and heterochromatin are characterized by distinct histones marks which can facilitate or repress gene transcription. The chromatin environment represents thus one of the main problems to control gene expression in biotechnological applications or gene therapy, since its expression is affected by the chromatin neighboring its locus of insertion. Some chromatin regions like telomeres are composed of constitutive heterochromatin which leads to the telomeric position effect (TPE) that silences genes adjacent to the telomere. TPE is known to spread by the selfrecruitment of the SIR histone deacetylase complex from the telomere in S.cerevisiae, but the histone marks that are associated to telomeric chromatin in mammalian cells remain mostly unknown. The transcription factor CTF1 has shown antisilencing properties in mammalian cells and also a boundary activity against TPE in yeast cells when fused to the yeast Gal4 DNA binding domain. In the work presented here, we describe a dual-reporter system to assess the boundary activity of proteins such as CTF1 at human telomeres. When located between the two reporter genes, CTF1 shields the telomere distal gene from TPE, while the telomereproximal gene remains silenced by telomeric heterochromatin. The boundary activity of CTF1 is shown to act regardless its function of transcriptional activator, by opposition to the transcriptional activator VP16 which activates indifferently both transgenes. Moreover, this study shows that CTF1 boundary activity is linked to its H3 binding function, as expected from a chromatin remodeler. ChIP experiments showed that histone deacetylation is the main histone modification involved in gene silencing at mammalian cell telomeres. Distinctly to yeast cells, the histone deacetylation signal in human cells extented over a short range along the chromosome. CTF1 may help to block this propagation and therefore to restore histones acetylation level on telomere protected locus. Surprisingly, other histone marks such as trimethyl-H3K9 or trimethyl-H4K20 were found on telomere protected locus, while in another clone, unsilencing of telomere distal transgene was associated with recruitment of the histone variant H2A.Z. Thus, I conclude that CTF1 displays a chromatin boundary function which is independent of its transcriptional activity and therefore exhibit features required for use as chromatin insulator in biotechnological applications. RESUME Les génomes eucaryotes sont compartementalisés en domaines structurels qui peuvent affecter positivement ou négativement l'expression des gènes avoisinants. Ces régions dites d'euchromatine ou d'hétérochromatine sont caractérisées par des modifications posttraductionnelles des histones qui peuvent faciliter ou au contraire inhiber la transcription des gènes qui s'y trouvent. Ainsi, isoler un gène de son environnement chromatinien est problème fréquent lorsqu'il s'agit de contrôler son expression dans le cadre d'applications en biotechnologie ou encore en thérapie génique. Certaines régions de chromatine telles que les télomères sont composées d'hétérochromatine constitutive qui mène au silençage des gènes avoisinants. Cet effet de position télomérique (TPE) est connu dans la levure S.cerevisiae comme se propageant par auto-recrutement du complexe de déacétylation d'histone SIR, alors que peu de modifications de chromatine ont pu être associées à ce phénomène dans les cellules de mammifères. Le facteur de transcription CTF1 a montré des propriétés d'anti-silençage dans les cellules de mammifères, ainsi qu'une activité barrière contre le silençage télomérique dans les cellules de levures lorsqu'il est fusionné au domaine de liaison à l'ADN de la protéine de levure Gal4. Dans le travail présenté ci-après est décrit un système à deux gènes rapporteurs permettant de mesurer l'activité barrière de protéines telles que CTF1 aux télomères humains, et les modifications de chromatine qui y sont associées. Lorsque CTF1 est placé entre les deux gènes rapporteurs, le gène distant du télomère est protégé du silençage qui lui est associé, alors que le gène proche du télomère reste soumis à ce silençage induit par l'hétérochromatine télomérique. L'activité barrière de CTF1 est montrée ici comme agissant indépendamment de son activité transcriptionnelle, par opposition à l'activateur transcriptionnel VP16 qui active indifféremment les deux transgènes. En outre, cette étude appuie l'hypothèse stipulant que CTF1 agisse comme remodeleur chromatinien puisqu'elle démontre que son activité barrière est directement dépendante de son activité de liaison avec l'histone H3. De plus, des expériences d'immuno-précipitation de la chromatine démontrent que la déacétylation des histones est le majeur phénomène intervenant dans le silençage télomérique. Par opposition à la levure, ce signal de déacétylation ne se propage dans les cellules humaines que sur une courte distance le long du chromosome. CTF1 agit ainsi en bloquant cette propagation et en restaurant le niveau d'acétylation des histones sur le locus protégé du télomère. De manière surprenante et inattendue, d'autres modifications d'histones telles que 4 les H3K9 et H4K20 triméthylées sont aussi observées à ce locus, tandis le recrutement du variant H2A.Z peut aussi être suffisant à restaurer l'expression du gène distant du télomère. En terme de cette analyse, CTF1 exhibe ainsi une fonction de barrière chromatinienne qui exclue une activité transcriptionnelle non désirée - propriété qui est requise dans l'établissement des isolateurs visant à permettre le contrôle d'un transgène dans le cadre d'applications en biotechnologies.

Une méta-analyse GWA de la glycémie après 2h d'HGPO révèle que GIPR est associé avec la sécrétion de l'insuline en réponse au glucose et que l'ADCY5 est un nouveau gène de suseptibilité au diabète de type 2. [A meta-analysis of GWA blood glucose after 2 h of OGTT revealed that GIPR is associated with the secretion of insulin based on glucose and ADCY5 is a new susceptibility gene for type 2 diabetes.]

Introduction: Les études GVvA (Genome-wide association ,-studies) ont identifié et confirmé plus de 20 gènes de susceptibilité au DT2 et ont contribué à mieux comprendre sa physiopathologie. L'hyperglycémie à jeun (GJ), et 2 heures après une HGPO (G2h) sont les deux mesures cliniques du diagnostic du DT2. Nous avons identifié récemment la G6P du pancréas (G6PC2) comme déterminant de la variabilité physiologique de la GJ puis Ie récepteur à la mélatonine (MTNRIB) qui de plus lie la régulation du rythme circadien au DT2. Dans ce travail nous avons étudié la génétique de la G2h à l'aide de l'approche GWA. Résultats: Nous avons réalisé une méta-analyse GWA dans le cadre de MAGIC (Meta-Analysis of Glucose and Insulin related traits Consortium) qui a inclus 9 études GWA (N=15'234). La réplication de 29 loci (N=6958-30 121, P < 10-5 ) a confirmé 5 nouveaux loci; 2 étant connus comme associés avec Ie DT2 (TCF7L2, P = 1,6 X 10-10 ) et la GJ (GCKR, p = 5,6 X 10-10 ); alors que GIPR (p= 5,2 X 10-12), VSP13C (p= 3,9 X 10-8) et ADCY5 (p = 1,11 X 10-15 ) sont inédits. GIPR code Ie récepteur au GIP (gastric inhibitory polypeptide) qui est sécrété par les ceIlules intestinales pour stimuler la sécrétion de l'insuline en réponse au glucose (l'effet incrétine). Les porteurs du variant GIPR qui augmente la G2h ont également un indice insulinogénique plus bas, (p= 1,0 X 10-17) mais ils ne présentent aucune modification de leur glycémie suite à une hyperglycémie provoquée par voie veineuse (p= 0,21). Ces résultats soutiennent un effet incrétine du locus GIPR qui expliquerait ~9,6 % de la variance total de ce trait. La biologie de ADCY5 et VPS13C et son lien avec l'homéostasie du glucose restent à élucider. GIPR n'est pas associé avec le risque de DT2 indiquant qu'il influence la variabilité physiologique de la G2h alors que le locus ADCY5 est associé avec le DT2 (OR = 1,11, P = 1,5 X 10-15). Conclusion: Notre étude démontre que l'étude de la G2h est une approche efficace d'une part pour la compréhension de la base génétique de la physiologie de ce trait clinique important et d'autre part pour identifier de nouveaux gènes de susceptibilité au DT2.

Phenotypic plasticity in salmonid embryos : characterizing pathogen-induced stress effects on heritable variation in traits and reaction norms

Les pressions écologiques peuvent varier tant en nature qu'en intensité dans le temps et l'espace. C'est pourquoi, un phénotype unique ne peut pas forcément conférer la meilleure valeur sélective. La plasticité phénotypique peut être un moyen de s'accommoder de cette situation, en augmentant globalement la tolérance aux changements environnementaux. Comme pour tout trait de caractère, une variation génétique doit persister pour qu'évoluent les traits plastiques dans une population donnée. Cependant, les pressions extérieures peuvent affecter l'héritabilité, et la direction de ces changements peut dépendre du caractère en question, de l'espèce mais aussi du type de stress. Dans la présente thèse, nous avons cherché à élucider les effets des pressions pathogéniques sur les phénotypes et la génétique quantitative de plusieurs traits plastiques chez les embryons de deux salmonidés, la palée (Coregonus palaea), et la truite de rivière (Salmo trutta). Les salmonidés se prêtent à de telles études du fait de leur extraordinaire variabilité morphologique, comportementale et des traits d'histoire de vie. Par ailleurs, avec le déclin des salmonidés dans le monde, il est important de savoir combien la variabilité génétique persiste dans les normes de réaction afin d'aider à prédire leur capacité à répondre aux changements de leur milieu. Nous avons observé qu'une augmentation de la croissance des communautés microbiennes symbiotiques entraînait une mortalité accrue et une éclosion précoce chez la palée, et dévoilait la variance génétique additive pour ces deux caractères (Chapitres 1-2). Bien qu'aucune variation génétique n'ait été trouvée pour les normes de réaction, nous avons observé une variabilité de la plasticité d'éclosion. Néanmoins, on a trouvé que les temps d'éclosion étaient corrélés entre les environnements, ce qui pourrait limiter l'évolution de la norme de réaction. Le temps d'éclosion des embryons est lié à la taille des géniteurs mâles, ce qui indique des effets pléiotropiques. Dans le Chapitre 3, nous avons montré qu'une interaction triple entre la souche bactérienne {Pseudomonas fluorescens}, l'état de dévelopement de l'hôte ainsi que ses gènes ont une influence sur la mortalité, le temps d'éclosion et la taille des alevins de la palée. Nous avons démontré qu'une variation génétique subsistait généralement dans les normes de réaction des temps d'éclosion, mais rarement pour la taille des alevins, et jamais pour la mortalité. Dans le même temps, nous avons exhibé que des corrélations entre environnements dépendaient des caractères phénotypiques, mais contrairement au Chapitre 2, nous n'avons pas trouvé de preuve de corrélations transgénérationnelles. Le Chapitre 4 complète le chapitre précédent, en se plaçant du point de vue moléculaire, et décrit comment le traitement d'embryons avec P. fluorescens s'est traduit par une régulation négative d'expression du CMH-I indépendemment de la souche bactérienne. Nous avons non seulement trouvé une variation génétique des caractères phénotypiques moyens, mais aussi de la plasticité. Les deux derniers chapitres traitent de l'investigation, chez la truite de rivière, des différences spécifiques entre populations pour des normes de réaction induites par les pathogènes. Dans le Chapitre 5, nous avons illustré que le métissage entre des populations génétiquement distinctes n'affectait en rien la hauteur ou la forme des normes de réaction d'un trait précoce d'histoire de vie suite au traitement pathogénique. De surcroît, en dépit de l'éclosion tardive et de la réduction de la taille des alevins, le traitement n'a pas modifié la variation héritable des traits de caractère. D'autre part, dans le Chapitre 6, nous avons démontré que le traitement d'embryons avec des stimuli contenus dans l'eau de conspécifiques infectés a entraîné des réponses propre à chaque population en terme de temps d'éclosion ; néanmoins, nous avons observé peu de variabilité génétique des normes de réaction pour ce temps d'éclosion au sein des populations. - Ecological stressors can vary in type and intensity over space and time, and as such, a single phenotype may not confer the highest fitness. Phenotypic plasticity can act as a means to accommodate this situation, increasing overall tolerance to environmental change. As with any trait, for plastic traits to evolve in a population, genetic variation must persist. However, environmental stress can alter trait heritability, and the direction of this shift can be trait, species, and stressor-dependent. In this thesis, we sought to understand the effects of pathogen stressors on the phenotypes and genetic architecture of several plastic traits in the embryos of two salmonids, the whitefish (Coregonus palaea), and the brown trout (Salmo trutta). Salmonids lend themselves to such studies because their extraordinary variability in morphological, behavioral, and life-history traits. Also, with declines in salmonids worldwide, knowing how much genetic variability persists in reaction norms may help predict their ability to respond to environmental change. We found that increasing growth of symbiotic microbial communities increased mortality and induced hatching in whitefish, and released additive genetic variance for both traits (Chapters 1-2). While no genetic variation was found for survival reaction norms, we did find variability in hatching plasticity. Nevertheless, hatching time was correlated across environments, which could constrain evolution of the reaction norm. Hatching time in the induced environment was also correlated to sire size, indicating pleiotropic effects. In Chapter 3 we report that a three-way interaction between bacterial strain (Pseudomonas fluorescens), host developmental stage, and host genetics impacted mortality, hatching time, and hatchling size in whitefish. We also showed that genetic variation generally persisted in hatching age reaction norms, but rarely for hatchling length, and never for mortality. At the same time, we demonstrated that cross-environmental correlations were trait-dependent, and unlike Chapter 2, we found no evidence of cross-generational correlations. Chapter 4 expands on the previous chapter, moving to the molecular level, and describes how treatment of embryos with P. fluorescens resulted in strain-independent downregulation of MHC class I. Genetic variation was evident not only in trait means, but also in plasticity. In the last two chapters, we investigated population level differences in pathogen- induced reaction norms in brown trout. In Chapter 5, we found that interbreeding between genetically distinct populations did not affect the elevation or shapes of the reaction norms of early life-history traits after pathogen challenge. Moreover, despite delaying hatching and reducing larval length, treatment produced no discernable shifts in heritable variation in traits. On the other hand, in Chapter 6, we found that treatment of embryos with water-borne cues from infected conspecifics elicited population-specific responses in terms of hatching time; however, we found little evidence of genetic variability in hatching reaction norms within populations. We have made considerable progress in understanding how pathogen stressors affect various early life-history traits in salmonid embryos. We have demonstrated that the effect of a particular stressor on heritable variation in these traits can vary according to the trait and species under consideration, in addition to the developmental stage of the host. Moreover, we found evidence of genetic variability in some, but not all reaction norms in whitefish and brown trout.

El discurs polític: la immigració com a pretext

El treball és una d’anàlisi del discurs polític que apareix en els programes electorals dels candidats a les presidencials franceses 2012, centrant l’atenció en el terme immigration. L’objectiu és identificar de quina manera expressen la seva ideologia, concretar les semblances, les divergències i els matisos que determinen en els seus discursos.

Phenotypic and molecular characterization of the onset of neuropathy in rodent models of diabetes mellitus

Abstract : The principal focus of this work was to study the molecular changes leading to the development of diabetic peripheral neuropathy (DPN). DPN is the most common complication associated with both type I and II diabetes mellitus (DM). This pathology is the leading cause of non-traumatic amputations. Even though the pathological and morphological changes underlying DPN are relatively well described, the implicated molecular mechanisms remain poorly understood. The following two approaches were developed to study the development of DPN in a rodent model of DM type I. As a first approach, we studied the implication of lipid metabolism in DPN phenotype, concentrating on Sterol Response Element Binding Protein (SREBP)-lc which is the key regulator of storage lipid metabolism. We showed that SREBP-1c was expressed in peripheral nerves and that its expression profile followed the expression of genes involved in storage lipid metabolism. In addition, the expression of SREBP-1c in the endoneurium of peripheral nerves was dependant upon nutritional status and this expression was also perturbed in type I diabetes. In line with this, we showed that insulin elevated the expression of SREBP-1c in primary cultured Schwann cells by activating the SREBP-1c promoter. Taken together, these findings reveal that SREBP-1c expression in Schwann cells responds to metabolic stimuli including insulin and that this response is affected in type I diabetes mellitus. This suggests that disturbed SREBP-1c regulated lipid metabolism may contribute to the pathophysiology of DPN. As a second approach, we performed a comprehensive analysis of the molecular changes associated with DPN in the Akital~1~+ mouse which is a model of spontaneous early-onset type I diabetes mellitus. This mouse expresses a mutated non-functional isoform of insulin, leading to hypoinsulinemia and hyperglycaemia. To determine the onset of DPN, weight, blood glucose and motor nerve conduction velocity (MNCV) were measured in Akital+/+ mice during the first three months of life. A decrease in MNCV was evident akeady one week after the onset of hyperglycemia. To explore the molecular changes associated with the development of DPN in these mice, we performed gene expression profiling using sciatic nerve endoneurium and dorsal root ganglia (DRG) isolated from early diabetic male Akita+/+ mice and sex-matched littermate controls. No major transcriptional changes were detected either in the DRG or in the sciatic nerve endoneurium. This experiment indicates that the phenotypic changes observed during the development of DPN are not correlated with major transcriptional alterations, but mainly with alterations at the protein level. Résumé Lors ce travail, nous nous sommes intéressés aux changements moléculaires aboutissant aux neuropathies périphériques dues au diabète (NPD). Les NPD sont la complication la plus commune du diabète de type I et de type II. Cette pathologie est une cause majeure d'amputations. Même si les changements pathologiques et morphologiques associés aux NPD sont relativement bien décrits, les mécanismes moléculaires provoquant cette pathologie sont mal connus. Deux approches ont principalement été utilisées pour étudier le développement des NPD dans des modèles murins du diabète de type I. Nous avons d'abord étudié l'impact du métabolisme des lipides sur le développement des NPD en nous concentrant sur Sterol Response Element Binding Protein (SREBP)-1 c qui est un régulateur clé des lipides de stockage. Nous avons montré que SREBP-1 c est exprimé dans les nerfs périphériques et que son profil d'expression suit celui de gènes impliqués dans le métabolisme des lipides de stockage. De plus, l'expression de SREBP-1c dans l'endoneurium des nerfs périphériques est dépendante du statut nutritionnel et est dérégulée lors de diabète de type I. Nous avons également pu montrer que l'insuline augmente l'expression de SREBP-1c dans des cultures primaires de cellules de Schwann en activant le promoteur de SREBP-1c. Ses résultats démontrent que l'expression de SREBP-1c dans les cellules de Schwann est contrôlée par des stimuli métaboliques comme l'insuline et que cette réponse est affectée dans le cas d'un diabète de type I. Ces données suggèrent que la dérégulation de l'expression de SREBP-1c lors du diabète pourrait affecter le métabolisme des lipides et ainsi contribuer à la pathophysiologie des NPD. Comme seconde approche, nous avons réalisé une analyse globale des changements moléculaires associés au développement des NPD chez les souris Akita+/+, un modèle de diabète de type I. Cette souris exprime une forme mutée et non fonctionnelle de l'insuline provoquant une hypoinsulinémie et une hyperglycémie. Afin de déterminer le début du développement de la NPD, le poids, le niveau de glucose sanguin et la vitesse de conduction nerveuse (VCN) ont été mesurés durant les 3 premiers mois de vie. Une diminution de la VCN a été détectée une semaine seulement après le développement de l'hyperglycémie. Pour explorer les changements moléculaires associés avec le développement des NPD, nous avons réalisé un profil d'expression de l'endoneurium du nerf sciatique et des ganglions spinaux isolés à partir de souris Akital+/+ et de souris contrôles Akita+/+. Aucune altération transcriptionnelle majeure n'a été détectée dans nos échantillons. Cette expérience suggère que les changements phénotypiques observés durant le développement des NPD ne sont pas corrélés avec des changements importants au niveau transcriptionnel, mais plutôt avec des altérations au niveau protéique. Résumé : Lors ce travail, nous nous sommes intéressés aux changements moléculaires aboutissant aux neuropathies périphériques dues au diabète (NPD). Les NPD sont la complication la plus commune du diabète de type I et de type II. Cette pathologie est une cause majeure d'amputations. Même si les changements pathologiques et morphologiques associés aux NPD sont relativement bien décrits, les mécanismes moléculaires provoquant cette pathologie sont mal connus. Deux approches ont principalement été utilisées pour étudier le développement des NPD dans des modèles murins du diabète de type I. Nous avons d'abord étudié l'impact du métabolisme des lipides sur le développement des NPD en nous concentrant sur Sterol Response Element Binding Protein (SREBP)-1c qui est un régulateur clé des lipides de stockage. Nous avons montré que SREBP-1 c est exprimé dans les nerfs périphériques et que son profil d'expression suit celui de gènes impliqués dans le métabolisme des lipides de stockage. De plus, l'expression de SREBP-1c dans l'endoneurium des nerfs périphériques est dépendante du statut nutritionnel et est dérégulée lors de diabète de type I. Nous avons également pu montrer que l'insuline augmente l'expression de SREBP-1c dans des cultures primaires de cellules de Schwann en activant le promoteur de SREBP-1c. Ses résultats démontrent que l'expression de SREBP-1c dans les cellules de Schwann est contrôlée par des stimuli métaboliques comme l'insuline et que cette réponse est affectée dans le cas d'un diabète de type I. Ces données suggèrent que la dérégulation de l'expression de SREBP-1c lors du diabète pourrait affecter le métabolisme des lipides et ainsi contribuer à la pathophysiologie des NPD. Comme seconde approche, nous avons réalisé une analyse globale des changements moléculaires associés au développement des NPD chez les souris Akita~~Z~+, un modèle de diabète de type I. Cette souris exprime une forme mutée et non fonctionnelle de l'insuline provoquant une hypoinsulinémie et une hyperglycémie. Afin de déterminer le début du développement de la NPD, le poids, le niveau de glucose sanguin et la vitesse de conduction nerveuse (VCN) ont été mesurés durant les 3 premiers mois de vie. Une diminution de la VCN a été détectée une semaine seulement après le développement de l'hyperglycémie. Pour explorer les changements moléculaires associés avec le développement des NPD, nous avons réalisé un profil d'expression de l'endoneurium du nerf sciatique et des ganglions spinaux isolés à partir de souris Akital+/+ et de souris contrôles Akita+/+. Aucune altération transcriptionnelle majeure n'a été détectée dans nos échantillons. Cette expérience suggère que les changements phénotypiques observés durant le développement des NPD ne sont pas corrélés avec des changements importants au niveau transcriptionnel, mais plutôt avec des altérations au niveau protéique.

Susceptibilitat genètica al càncer gàstric: caracterització de les interaccions de segon ordre entre gens i variants identificades en l’estudi EPIC‐EURGAST

En aquest Treball de Final de Grau s’exposen els resultats de l’anàlisi de les dades genètiques del projecte EurGast2 "Genetic susceptibility, environmental exposure and gastric cancer risk in an European population”, estudi cas‐control niat a la cohort europea EPIC “European Prospective lnvestigation into Cancer and Nutrition”, que té per objectiu l’estudi dels factors genètics i ambientals associats amb el risc de desenvolupar càncer gàstric (CG). A partir de les dades resultants de l’estudi EurGast2, en el què es van analitzar 1.294 SNPs en 365 casos de càncer gàstric i 1.284 controls en l’anàlisi Single SNP previ, la hipòtesi de partida del present Treball de Final de Grau és que algunes variants amb un efecte marginal molt feble, però que conjuntament amb altres variants estarien associades al risc de CG, podrien no haver‐se detectat. Així doncs, l’objectiu principal del projecte és la identificació d’interaccions de segon ordre entre variants genètiques de gens candidats implicades en la carcinogènesi de càncer gàstric. L’anàlisi de les interaccions s’ha dut a terme aplicant el mètode estadístic Model‐based Multifactor Dimensionality Reduction Method (MB‐MDR), desenvolupat per Calle et al. l’any 2008 i s’han aplicat dues metodologies de filtratge per seleccionar les interaccions que s’exploraran: 1) filtratge d’interaccions amb un SNP significatiu en el Single SNP analysis i 2) filtratge d’interaccions segons la mesura Sinèrgia. Els resultats del projecte han identificat 5 interaccions de segon ordre entre SNPs associades significativament amb un major risc de desenvolupar càncer gàstric, amb p‐valor inferior a 10‐4. Les interaccions identificades corresponen a interaccions entre els gens MPO i CDH1, XRCC1 i GAS6, ADH1B i NR5A2 i IL4R i IL1RN (que s’ha validat en les dues metodologies de filtratge). Excepte CDH1, cap altre d’aquests gens s’havia associat significativament amb el CG o prioritzat en les anàlisis prèvies, el que confirma l’interès d’analitzar les interaccions genètiques de segon ordre. Aquestes poden ser un punt de partida per altres anàlisis destinades a confirmar gens putatius i a estudiar a nivell biològic i molecular els mecanismes de carcinogènesi, i orientades a la recerca de noves dianes terapèutiques i mètodes de diagnosi i pronòstic més eficients.