Mechanism of Inducible Costimulator (ICOS)-mediated calcium signaling

Le Costimulateur Inductible (ICOS) est un récepteur exprimé à la surface des cellules T CD4 auxiliaires et T CD8 cytotoxiques. Il fut démontré à l’aide de modèles murins de transplantation de moelle osseuse que ICOS joue un rôle important dans l’induction de la maladie du greffon contre l’hôte aigüe (GVHD). ICOS potentialise deux signaux médiés par le récepteur de cellules T (TCR) : l’activation de la phosphoinositide 3-kinase (PI3K) ainsi que la mobilisation interne de calcium. En conditions in vitro, dans les cellules CD4 et CD8, ICOS réussi à potentialiser le flux de calcium médié par le TCR indépendamment de PI3K. La voie de signalisation de ICOS impliquée dans la GVHD demeure inconnue. Cependant, en utilisant une lignée de souris ‘knock-in’ nommée ICOS-Y181F, dans laquelle le cellules T ont sélectivement perdu la capacité d’activer PI3K par l’entremise d’ICOS, nous avons démontré que les cellules T peuvent utiliser un mécanisme ICOS indépendant de PI3K afin d’induire la GVHD. La mobilisation interne du Ca2+ mène à l’activation de NFAT, un facteur de transcription clé régulant des gènes comme IFN-γ, qui exprime une des cytokines clés impliquées dans la GVHD. Nous émettons comme hypothèse que la capacité pathogénique intacte des cellules T ICOSY181F à induire la GVHD, repose sur la signalisation du Ca2+ indépendante de PI3K. Le but de mon projet est d’identifier les résidus responsables de cette signalisation de Ca2+ médiée par ICOS ainsi que le mécanisme par lequel ce récepteur fonctionne. À l’aide de la mutagénèse dirigée, j’ai généré des mutants d’ICOS et j’ai analysé par cytométrie en flux leur capacité à activer le flux de Ca2+. J’ai ainsi identifié un groupe de lysine sur la queue cytoplasmique d’ICOS situé à proximité de la membrane comme étant essentiel à la fonction de potentialisation du flux de Ca2+. Je fournis également des preuves de l’implication de la kinase Lck, membre de la famille de kinases Src, dans la voie de signalisation de ICOS médiant la potentialisation du flux de Ca2+. Ainsi, ICOS s’associe à Lck et mène à une augmentation de l’activation de PLCγ1, la protéine effectrice clé causant la sortie de Ca2+ de la réserve intracellulaire. En conclusion, notre étude permet de comprendre davantage une des voies de signalisation d’ICOS. L’influx de Ca2+ dans les cellules T implique la voie ICOS-Lck-PLCγ1. Une compréhension plus approfondie de cette voie de signalisation pourrait s’avérer bénéfique afin d’élaborer de nouvelles stratégies menant à la prévention de maladies reliées à ICOS, comme la GVHD.

Rat protease-activated receptor–1 (rPAR1) expression and characterization in Sf9 cells

Connue pour son rôle dans la cascade de coagulation, la thrombine, une protéase à sérine, peut également agir par l’intermédiaire de PAR1, un récepteur activé par protéase et couplé aux protéines G liant le GTP (GPCR). La thrombine se lie et clive l’extrémité N-terminale du PAR1 entre l’Arg41 et la Ser42, exposant une nouvelle extrémité terminale qui agit elle-même comme un ligand. La thrombine et une séquence peptidique de cinq acides aminés, composée des résidus Ser42 à Arg46, nommée PAR1-AP, déclenchent dans diverses cellules de mammifères une réponse intracellulaire comportant une composante calcique. Dans cette étude, le système d’expression par baculovirus dans les cellules Sf9 d'insecte nous a permis d'exprimer le récepteur PAR1 du rat à la surface de ces cellules et de réaliser son couplage fonctionnel à leur signalisation intracellulaire (modèle rPAR1-Sf9). La composante calcique de celle-ci, en réponse au PAR1-AP, a ensuite été étudiée en détail à l’aide de la sonde fluorescente Fura-2 et de plusieurs inhibiteurs agissant sur les canaux calciques ou d'autres éléments de la cascade de signalisation du calcium intracellulaire. Lorsque le milieu extracellulaire contient du calcium (Ca2+), la thrombine ou PAR1-AP déclenchent un signal calcique qui consiste en une augmentation rapide de [Ca2+]i suivi d’un plateau relativement soutenu, puis d'un retour lent vers le niveau de base initial. En l'absence de Ca2+ dans le milieu extracellulaire, l'augmentation initiale rapide de [Ca2+]i est suivie d'un retour rapide vers le [Ca2+]i de base. À l’aide d’inhibiteurs de canaux calciques, tels que le lanthane, la nifédipine et le D-600, l'entrée du calcium du milieu extracellulaire dans les cellules est inhibée, abolissant le plateau soutenu de [Ca2+]i. L’inhibition de la pompe Ca2+-ATPase par la thapsigargine supprime la réponse au PAR1-AP après épuisement des sites de stockage de Ca2+intracellulaire. Le TMB-8 agit de façon discordante quant à l’inhibition de la libération de Ca2+ des sites de stockage intracellulaires. La réponse à PAR1-AP n’est pas affectée par le D-609, un inhibiteur de la phospholipase β. L’inhibition de la protéine kinase C (PKC) par le bisindolylmaléimide induit des oscillations en présence de Ca2+ extracellulaire et atténue fortement le signal calcique en absence de Ca2+ extracellulaire. En présence de Ca2+ extracellulaire, l’activation de la PKC par le PBDu tronque le flux de [Ca2+]i tandis que la réponse calcique est abolie en absence de Ca2+ dans le milieu extracellulaire. Le H-89, un inhibiteur de la protéine kinase A (PKA), cause une prolongation de la durée du plateau de [Ca2+]i dans un milieu riche en calcium et la suppression de la réponse à PAR1-AP lorsque le milieu extracellulaire est dépourvu de Ca2+. Les résultats obtenus nous permettent de conclure que la PKC et possiblement la PKA jouent un rôle critique dans la mobilisation du Ca2+ induite par le PAR1-AP dans le modèle rPAR1-Sf9.

Relation entre CaMKII et les dynamiques calciques endothéliales : impact de l'hypertension arterielle.

L’endothélium vasculaire joue un rôle prépondérant dans la régulation du tonus vasculaire en générant l’oxyde nitrique (NO), la prostacycline (PGI2) et les facteurs hyperpolarisants dérivés de l’endothélium (EDHF) comme puissants vasodilatateurs. Ces mécanismes requièrent le calcium (Ca2+) à divers niveaux, démontrant l’importance des dynamiques calciques endothéliales. Une perturbation de l’homéostasie calcique est observée dans une dysfonction endothéliale liée à l’hypertension artérielle. Il est impératif d’approfondir nos connaissances sur les signalisations calciques endothéliales impliquées dans le contrôle du tonus vasculaire. Des études récentes ont montré qu’une variation locale de la concentration en Ca2+ libre intracellulaire ([Ca2+]i) est suffisante pour générer une réponse physiologique importante. Les pulsars calciques sont caractérisés par une augmentation de [Ca2+]i spontanée et transitoire spécifiquement localisée au niveau des projections myoendothéliales (PMEs). Ces PMEs sont des sites de communication privilégiés entre les cellules endothéliales (CEs) et les cellules musculaires lisses vasculaires (CMLVs). Les pulsars calciques sont impliqués dans le mécanisme de l’EDHF via l’activation des canaux potassiques Ca2+-dépendant de moyenne conductance (KCa3.1 ou IKCa). Les travaux de cette thèse visent à améliorer nos connaissances sur les signalisations calciques locales en caractérisant une nouvelle voie de signalisation pouvant être impliquée dans la régulation du tonus vasculaire en condition physiopathologique. Outre les canaux KCa3.1 peu d’informations sont disponibles sur les cibles sensibles aux pulsars calciques. Une première étude a permis d’identifier la protéine kinase II dépendante du complexe Ca2+/calmoduline (CaMKII) sous ses isoformes α, β et δ dans les CEs d’artères natives de souris comme une cible pouvant être modulée par les pulsars calciques. Des études en immunofluorescence ont permis d’observer la localisation particulière de CaMKII endothéliale dans les PMEs, les sites des pulsars calciques. Une stimulation spécifique des pulsars calciques par la phényléphrine (PE) engendre un recrutement de CaMKII dans les PMEs. Sachant que CaMKII active l’oxyde nitrique synthase endothéliale (NOS3), nous avons évalué l’impact d’une stimulation des pulsars calciques sur la production de NO en présence d’un inhibiteur de CaMKII, le KN-93. Nous avons démontré que la production de NO est en partie dépendante de l’activation de CaMKII par les pulsars calciques. En utilisant un modèle d’hypertension induite par l’infusion chronique de PE, nous avons permis de mettre en évidence une perturbation dans la relation entre les pulsars calciques et CaMKII. Dans une seconde étude nous avons établi deux modèles (normo- et hypertendus) d’infusion chronique à l’angiotensine II (AngII) afin évaluer l’impact des ROS et de l’hypertension sur la voie de signalisation pulsars/CaMKII/NO. Nos résultats ont montré une augmentation des pulsars calciques accompagnée d’un recrutement de CaMKII dans les PMEs. Une stimulation aigue à l’AngII suggère que les ROS modulent les dynamiques calciques et que l’AngII stimule la production de NO. Cette étude propose que ces voies de signalisations impliquent les récepteurs de type 1 et 2 à l’AngII (AT1 et AT2). L’étude des pulsars calciques dépend fortement de la structure native des artères qui permet de conserver la formation des PMEs. La dernière étude présentée dans cette thèse a permis d’établir une relation entre les PMEs et les pulsars calciques dans trois lits vasculaires distincts (artères mésentériques, pulmonaires et coronariennes). Nos résultats ont montré que les paramètres cinétiques des pulsars calciques sont fortement conservés entre les différents lits vasculaires. Toutefois, la fréquence globale ainsi que le nombre de sites actifs des pulsars calciques diffèrent avec une proportion plus élevée dans les artères mésentériques et coronariennes comparativement aux artères pulmonaires. Ces résultats corrèlent avec le nombre plus élevé de PMEs retrouvé dans les artères mésentériques et coronariennes. Ces travaux suggèrent que les pulsars calciques sont fondamentaux pour les artères de résistance. Les études de cette thèse ont mené à l’identification d’une nouvelle voie de signalisation impliquant les pulsars calciques et CaMKII endothéliale dans la stimulation de la production de NO. Cette nouvelle voie de signalisation pourrait être impliquée dans la régulation du tonus vasculaire en condition physiopathologique. Les pulsars calciques semblent être fortement conservés entre les différentes artères de résistances et ce malgré la disparité dans les PMEs, suggérant un rôle prépondérant dans la fonction vasculaire. Ces travaux ouvrent une avenue pour le développement de potentielles cibles thérapeutiques pouvant contrer la dysfonction endothéliale associée à l’hypertension artérielle.

Interannual and interdecadal oscillations in hydrological variables: Sources and modeling of the persistence in the Elbe River Basin

Wenn man die Existenz von physikalischen Mechanismen ignoriert, die für die Struktur hydrologischer Zeitreihen verantwortlich sind, kann das zu falschen Schlussfolgerungen bzgl. des Vorhandenseins möglicher Gedächtnis (memory) -Effekte, d.h. von Persistenz, führen. Die hier vorgelegte Doktorarbeit spürt der niedrigfrequenten klimatischen Variabilität innerhalb den hydrologischen Zyklus nach und bietet auf dieser "Reise" neue Einsichten in die Transformation der charakteristischen Eigenschaften von Zeitreihen mit einem Langzeitgedächtnis. Diese Studie vereint statistische Methoden der Zeitreihenanalyse mit empirisch-basierten Modelltechniken, um operative Modelle zu entwickeln, die in der Lage sind (1) die Dynamik des Abflusses zu modellieren, (2) sein zukünftiges Verhalten zu prognostizieren und (3) die Abflusszeitreihen an unbeobachteten Stellen abzuschätzen. Als solches präsentiert die hier vorgelegte Dissertation eine ausführliche Untersuchung zu den Ursachen der niedrigfrequenten Variabilität von hydrologischen Zeitreihen im deutschen Teil des Elbe-Einzugsgebietes, den Folgen dieser Variabilität und den physikalisch basierten Reaktionen von Oberflächen- und Grundwassermodellen auf die niedrigfrequenten Niederschlags-Eingangsganglinien. Die Doktorarbeit gliedert sich wie folgt: In Kapitel 1 wird als Hintergrundinformation das Hurst Phänomen beschrieben und ein kurzer Rückblick auf diesbezügliche Studien gegeben. Das Kapitel 2 diskutiert den Einfluss der Präsenz von niedrigfrequenten periodischen Zeitreihen auf die Zuverlässigkeit verschiedener Hurst-Parameter-Schätztechniken. Kapitel 3 korreliert die niedrigfrequente Niederschlagsvariabilität mit dem Index der Nord-Atlantischen Ozillations (NAO). Kapitel 4-6 sind auf den deutschen Teil des Elbe-Einzugsgebietes fokussiert. So werden in Kapitel 4 die niedrigfrequenten Variabilitäten der unterschiedlichen hydro-meteorologischen Parameter untersucht und es werden Modelle beschrieben, die die Dynamik dieser Niedrigfrequenzen und deren zukünftiges Verhalten simulieren. Kapitel 5 diskutiert die mögliche Anwendung der Ergebnisse für die charakteristische Skalen und die Verfahren der Analyse der zeitlichen Variabilität auf praktische Fragestellungen im Wasserbau sowie auf die zeitliche Bestimmung des Gebiets-Abflusses an unbeobachteten Stellen. Kapitel 6 verfolgt die Spur der Niedrigfrequenzzyklen im Niederschlag durch die einzelnen Komponenten des hydrologischen Zyklus, nämlich dem Direktabfluss, dem Basisabfluss, der Grundwasserströmung und dem Gebiets-Abfluss durch empirische Modellierung. Die Schlussfolgerungen werden im Kapitel 7 präsentiert. In einem Anhang werden technische Einzelheiten zu den verwendeten statistischen Methoden und die entwickelten Software-Tools beschrieben.

Calcium carbonate solubilization through H-proton release from some legumes grown in calcareous saline-sodic soils

Increasing levels of CO2 and H+ proton in the rhizosphere from some legumes may play an important role in calcite dissolution of calcareous salt affected soils. Soils planted with white and brown varieties of cowpea (Vigna unguiculata L.) and hyacinth bean (Dolichos lablab L.) relying on either fertilizer N (KNO3) or N-fixation were compared against soils to which gypsum was applied and a control without plants and gypsum application to study the possibility of Ca2+ release from calcite and Na+ leaching. As compared to plants relying on inorganic N, leachates from all pore volumes (0·5, 1·0, 1·5, 2·0 pore volume) in lysimeters planted with N-fixing hyacinth bean contained significantly higher concentrations of HCO with lower concentrations from lysimeters planted with white cowpea relying on N-fixation. However, the lowest concentrations of HCO were recorded in the gypsum and control treatments. In initial leaching, lysimeters planted with N-fixing plants maintained similar leachate Ca2+ and Na+ concentrations compared to gypsum amended soils. However, gypsum amended soils were found to have a prolonged positive effect on Na+ removal. It might be concluded that some legumes that are known to fix N in calcareous salt affected soils may be an alternative ameliorant to the extremely expensive gypsum through calcite solubilization and a consequent release of Ca2+.

Tumour necrosis factor alpha induces rapid reduction in AMPA receptor-mediated calcium entry in motor neurones by increasing cell surface expression of the GluR2 subunit: relevance to neurodegeneration

The AMPA receptor (AMPAR) subunit GluR2, which regulates excitotoxicity and the inflammatory cytokine tumour necrosis factor alpha (TNF alpha) have both been implicated in motor neurone vulnerability in Amyotrophic Lateral Sclerosis/Motor Neurone Disease. TNF alpha has been reported to increase cell surface expression of AMPAR subunits to increase synaptic strength and enhance excitotoxicity, but whether this mechanism occurs in motor neurones is unknown. We used primary cultures of mouse motor neurones and cortical neurones to examine the interaction between TNF alpha receptor activation, GluR2 availability, AMPAR-mediated calcium entry and susceptibility to excitotoxicity. Short exposure to a physiologically relevant concentration of TNFalpha (10 ng/ml, 15 min) caused a marked redistribution of both GluR1 and GluR2 to the cell surface as determined by cell surface biotinylation and immunofluorescence. Using Fura-2 AM microfluorimetry we showed that exposure to TNFalpha caused a rapid reduction in the peak amplitude of AMPA-mediated calcium entry in a PI3-kinase and p38 kinase-dependent manner, consistent with increased insertion of GluR2-containing AMPAR into the plasma membrane. This resulted in a protection of motor neurones against kainate-induced cell death. Our data therefore, suggests that TNF alpha acts primarily as a physiological regulator of synaptic activity in motor neurones rather than a pathological drive in ALS

Comparison of ammonium lactate, sodium bicarbonate and double calcium lactate methods for extraction of phosphorus from wetland peat soils

Procedures for routine analysis of soil phosphorus (P) have been used for assessment of P status, distribution and P losses from cultivated mineral soils. No similar studies have been carried out on wetland peat soils. The objective was to compare extraction efficiency of ammonium lactate (PAL), sodium bicarbonate (P-Olsen), and double calcium lactate (P-DCaL) and P distribution in the soil profile of wetland peat soils. For this purpose, 34 samples of the 0-30, 30-60 and 60-90 cm layers were collected from peat soils in Germany, Israel, Poland, Slovenia, Sweden and the United Kingdom and analysed for P. Mean soil pH (CaCl2, 0.01 M) was 5.84, 5.51 and 5.47 in the 0-30, 30-60 and 60-90 cm layers, respectively. The P-DCaL was consistently about half the magnitude of either P-AL or P-Olsen. The efficiency of P extraction increased in the order P-DCaL < P-AL &LE; P-Olsen, with corresponding means (mg kg(-1)) for all soils (34 samples) of 15.32, 33.49 and 34.27 in 0-30 cm; 8.87, 17.30 and 21.46 in 30-60 cm; and 5.69, 14.00 and 21.40 in 60-90 cm. The means decreased with depth. When examining soils for each country separately, P-Olsen was relatively evenly distributed in the German, UK and Slovenian soils. P-Olsen was linearly correlated (r = 0.594, P = 0.0002) with pH, whereas the three P tests (except P-Olsen vs P-DCaL) significantly correlated with each other (P = 0.017850.0001). The strongest correlation (r = 0.617, P = 0.0001) was recorded for P-AL vs P-DCaL) and the two methods were inter-convertible using a regression equation: P-AL = -22.593 + 5.353 pH + 1.423 P-DCaL, R-2 = 0.550.

Uneven distribution of nutrients in the root zone affects the incidence of blossom end rot and concentration of calcium and potassium in fruits of tomato

Tomato plants ( Lycopersicon esculentum Mill. var. DRK) were grown hydroponically to determine the effect of an uneven distribution of nutrients in the root zone on blossomend rot (BER) and Ca and K concentrations in the fruits. The plants were grown in rockwool with their root system divided into two portions. Each portion was irrigated with nutrient solutions with either the same or the different electrical conductivity (EC) in the range 0 to 6 dS m(-1). Solutions with high EC supplied to both sides of the root system significantly increased the incidence of BER. However, when only water or a solution of low EC was supplied to one portion, BER was reduced by 80%. Fruit yields were significantly higher ( P < 0.01) for plants that received solutions of the uneven EC treatments (6/0 or 4.5/0 EC treatment). Plants supplied with solutions of uneven EC generally had higher leaf and fruit concentrations of Ca but lower concentrations of K than those supplied with solutions of high EC. There was no difference in Ca concentration at the distal end of young fruits of the uneven EC treatment but it was reduced in the high EC treatments. The concentration of K in the mature fruits of the uneven EC treatments was lower than that of the high EC treatments and higher or similar that of the 3/3 or 2.5/2.5 EC treatments ( controls). A clear relationship was found between the incidence of BER and the exudation rate. High rate of xylem exudation was observed in the uneven EC treatments. Reduction of BER in the uneven EC treatments is most likely to be the effect of high exudation rate on Ca status in the young fruits. It was concluded that high EC of solution had positive effects on Ca concentration and incidence of BER provided that nutrient solution with low EC or water is supplied to the one portion of the root system.

The effect of calcium removal from milk on casein micelle stability and structure

The total calcium level of raw skimmed milk was reduced by 10, 19, 29, 40 and 51% using Duolite® ion-exchange resin. The products were examined for concentrations of ionic calcium, sodium and potassium and the pH, ethanol stability, micelle diameter and ζ-potential were also measured. Ionic calcium decreased with removal of calcium and pH increased. Calcium removal resulted in an increase in the ethanol stability from 88% to above 100%. Casein micelle diameter increased as calcium was removed. The ζ-potential of the skimmed bulk milk was -24.4 mV, gradually becoming more negative with calcium removal to -30.6 mV after 51% calcium removal. The milk became more translucent as calcium was removed. To investigate the reversibility of this process, calcium chloride was added back to the depleted samples to restore their original total calcium content. At 51% removal, restoration of the total calcium level resulted in formation of clots. At levels of 10 and 19% calcium removal, the ethanol stability remained above 100%, but at higher levels of calcium removal the alcohol stability was adversely affected when the calcium was added back. Adding back calcium resulted in partial restoration of the original casein micelle diameter.

Effects of different calcium salts on properties of milk related to heat stability

Insoluble calcium salts were added to milk to increase total calcium by 30 mM, without changing properties influencing heat stability, such as pH and ionic calcium. There were no major signs of instability associated with coagulation, sediment formation or fouling when subjected to ultra high temperature (UHT) and in-container sterilisation. The buffering capacity was also unaltered. On the other hand, addition of soluble calcium salts reduced pH, increased ionic calcium and caused coagulation to occur. Calcium chloride showed the largest destabilising effect, followed by calcium lactate and calcium gluconate. Milk became unstable to UHT processing at lower calcium additions compared to in-container sterilisation.

Measurement of ionic calcium, pH and soluble divalent cations in milk at high temperature

Dialysis and ultrafiltration were investigated as methods for measuring pH and ionic calcium and partitioning of divalent cations of milk at high temperatures. It was found that ionic calcium, pH, and total soluble divalent cations decreased as temperature increased between 20 and 80°C in both dialysates and ultrafiltration permeates. Between 90 and 110°C, ionic calcium and pH in dialysates continued to decrease as temperature increased, and the relationship between ionic calcium and temperature was linear. The permeabilities of hydrogen and calcium ions through the dialysis tubing were not changed after the tubing was sterilized for 1h at 120°C. There were no significant differences in pH and ionic calcium between dialysates from raw milk and those from a range of heat-treated milks. The effects of calcium chloride addition on pH and ionic calcium were measured in milk at 20°C and in dialysates collected at 110°C. Heat coagulation at 110°C occurred with addition of calcium chloride at 5.4mM, where pH and ionic calcium of the dialysate were 6.00 and 0.43mM, respectively. Corresponding values at 20°C were pH 6.66 and 2.10mM.

A shift to randomness of brain oscillations in people with autism

BACKGROUND: Resting-state functional magnetic resonance imaging (fMRI) enables investigation of the intrinsic functional organization of the brain. Fractal parameters such as the Hurst exponent, H, describe the complexity of endogenous low-frequency fMRI time series on a continuum from random (H = .5) to ordered (H = 1). Shifts in fractal scaling of physiological time series have been associated with neurological and cardiac conditions. METHODS: Resting-state fMRI time series were recorded in 30 male adults with an autism spectrum condition (ASC) and 33 age- and IQ-matched male volunteers. The Hurst exponent was estimated in the wavelet domain and between-group differences were investigated at global and voxel level and in regions known to be involved in autism. RESULTS: Complex fractal scaling of fMRI time series was found in both groups but globally there was a significant shift to randomness in the ASC (mean H = .758, SD = .045) compared with neurotypical volunteers (mean H = .788, SD = .047). Between-group differences in H, which was always reduced in the ASC group, were seen in most regions previously reported to be involved in autism, including cortical midline structures, medial temporal structures, lateral temporal and parietal structures, insula, amygdala, basal ganglia, thalamus, and inferior frontal gyrus. Severity of autistic symptoms was negatively correlated with H in retrosplenial and right anterior insular cortex. CONCLUSIONS: Autism is associated with a small but significant shift to randomness of endogenous brain oscillations. Complexity measures may provide physiological indicators for autism as they have done for other medical conditions.