Investigations of the characteristics and mode of action of an algalytic bacterium isolated from Tai Lake

An algalytic bacterium provisionally designated as TL1 was isolated from Tai Lake, a large freshwater lake in the Yangtze Delta plain on the border of the Jiangsu and Zhejiang provinces and close to Wuxi city in the People's Republic of China. Strain TL1 was identified as Achromobacter sp. based on its biophysical and biochemical properties and the analysis of its 16S rRNA sequence. Microcystis aeruginosa, which is the most common toxic cyanobacterium in eutrophic freshwater, could be decomposed by strain TL1. The results showed that after inoculation with the algalytic bacterium, the content of chlorophyll-a, maximum PSII quantum yield, and maximum electron transport rates of the alga decreased sharply. At first, the algal cells enhanced the activities of some antioxidative enzymes, but subsequently, the activities of antioxidative enzymes fell sharply once damage of the algal cells was achieved. The filtrate from strain TL1 culture suspension, after autoclaving and treatments with proteinase K, strongly inhibited algal growth, indicating that the lytic metabolites were extracellular and thermostable, not a protein.

胶州湾海洋链霉菌抑菌活性筛选、2株抑菌活性菌株的鉴定及次级代谢产物的研究

本文对256株胶州湾海洋链霉菌进行了抑菌活性的筛选，并选取10株典型菌株进行化学筛选，获得2株有研究价值的菌株。通过大规模发酵，获得纯化的次级代谢产物，进行了结构解析。通过与其他5株活性菌株的16S rRNA基因序列比较，并结合生理生化、形态特征和培养特征分析，探讨了这两株菌的分类地位。 　　采用液体扩散法，选用金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、八叠球菌、隐球菌、白色念珠菌、Mucor miehei (TÜ 284)和Streptomyces viridochromogenes (TÜ57) 8株受试菌进行抑菌活性的筛选，结果22%的菌株显示出对至少一种受试菌具有抑制作用(抑菌圈Æ ³ 8 mm)。根据菌株的形态特征和抑菌活性特点，选择M024、M028、M042、M083、M086、M095、M097、M124、M134和M226 10株链霉菌进行化学筛选。考察了8种培养基和4种培养条件，结果发现菌株M095在Meat extract培养基、pH 6.5、28℃和95 r/min条件下，菌株M097在Meat extract培养基、pH 7.8、 28℃、95 r/min(条件Ⅰ)和M2+培养基、pH 7.8、 35℃、110 r/min(条件Ⅱ)条件下，可供进一步研究。 对菌株M095(24 L规模)和M097(Ⅰ为30 L规模，Ⅱ为14 L规模)进行发酵，采用乙酸乙酯提取和柱层析分离纯化次级代谢产物，通过ESI-MS、EI-MS、1H-NMR和13C-NMR等波谱解析，鉴定出次级代谢产物的结构。发现菌株M095产生一抑菌活性很强的化合物全霉素，首次证实该全霉素具有抑制丝状真菌的作用；菌株M097主要产生10个化合物，其中8个具有不同程度的生物活性，另外两个化合物中，Aloesaponaria Ⅱ为首次从微生物野生菌株(wild strain)中获得，化合物Cui D为一新结构的蒽醌类化合物。 经分子鉴定，初步认为本实验分离的7株活性海洋链霉菌分属于4个链霉菌类群，结合生理生化、形态特征和培养特征分析，认为菌株M095可能为灰色链霉菌的变种，M097可能为球孢类群中的一个新种。

牙鲆群体遗传多样性及鲽形目鱼类分子系统学初步研究

本文以山东近海野生和养殖牙鲆Paralichthys olivaceus(T．& S.)为研究对象，采用同工酶电泳和随机扩增多态性DNA(RAPD)两种方法，进行了群体遗传学研究；另外，用PCR扩增了牙鲆、桂皮斑鲆Pseudorhombus cinnamomeus(T．& S.)、石鲽Kareius bicoloratus，Basilewsky和大菱鲆Psetta maxima 4种鲽形目鱼类mtDNA 16s rRNA基因区的部分片段，采用生物信息、学方法构建了鲽形目分子系统树。主要结果如下：1．首先建立了适于牙鲆同工酶分析的水平淀粉凝胶和垂直聚丙烯酰胺凝胶电泳系统；对获得的牙鲆15种同工酶基本酶谱进行了生化遗传分析，进而对自然和养殖群体的生化遗传结构进行了分析，共记录了29个基因座位，发现了9个多态座位。2．野生群体的生化遗传参数多态基因座位比例(31．O％)、等位基因平均数(1．38)和群体平均杂合度(0．0802)都明显高于养殖群体(24．1％，1．28，O．0788)；在野生群体中有9个多态基因座位，而养殖群体仅7个多态基因座位；其中，除了Cat和Idhp-1(仅养殖群体)(P < 0．05)有显著差异、Ldh-C(P < O．01)完全偏离Hardy-Weinberg定律外，其余多态座位基因频率均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律。野生和养殖群体的遗传相似性系数(I)为0．9877，它们的遗传距离(D)是0．0124；两群体间的遗传分化系数G_(st)为0．0681，D_m为0．01，表明总变异中的6．8％的遗传变异产生于群体间的基因差异。3．采用11个随机引物对20个野生个体和24个养殖个体进行了RAPD群体遗传多样性分析，分别扩增出88条和86条DNA带，片段大小在200-2500bp之间，平均每个引物扩增的带数是7．8-8．0。两个群体的多态座位比例分别是43．2％和34．9％，平均杂合度是0．2739和0．2255，而Shannon遗传多样性指数表明两群体的遗传变异中有88．12％的遗传变异来自种群内，只有11．88％的变异来自群体间。遗传分化指数G_(st)的结果也验证了Shannon遗传多样性指数的结果：总群体的遗传变异中约有12％是由两群体间的基因差异产生的。4．本文对牙鲆两个群体的同一批样品分别采用经典的同工酶方法和RAPD方法进行了较系统的比较分析。发现，RAPD所显示的多态性要比同工酶的高得多，因为大部分RAPD的变异是源于非编码区和重复DNA，可以遍布整个基因组，而同工酶仅是功能基因的产物，只表现编码区的变异。因此，自然选择在同工酶编码区的作用要多于RAPD标记。在遗传相似性系数(I)和遗传距离(D)上，RAPD的分析结果与同工酶的分析结果也是有差异的，用同工酶分析两个群体遗传距离只有0．0124，而用RAPD研究可达0．0508。遗传分化指数的差异也很大，同工酶为0．0681，RAPD为0．1237。5．RAPD和同工酶的分析结果是类似的，即自然群体的多态座位比例和平均杂合度要比养殖群体高，降低幅度在同工酶中界于1．7～22．3％之间，在RAPD中则界于15．9～19．2％之间。这充分证明了养殖群体的遗传多样性水平已有明显的丧失，值得我们注意。6．构建了鲽形目鱼类mtDNA 16S rRNA基因的分子系统树。通过分子克隆法将牙鲆、桂皮斑鲆、大菱鲆和石鲽mtDNA 16S rRNA目的基因片段连接到质粒载体上，经MegaBACE测序仪测序，分别获得了590、595、582和590bp序列，通过生物信息学方法对其进行了序列分析和核酸变异比较，结合NCBI上6种鲽形目鱼类的同源序列探讨了这4种鱼类在鲽形目中的遗传分化和分子系统进化，构建了系统树，其中，桂皮斑鲆的16S rRNA基因在系统树中的位置与物种形态资料的系统演化不相符，而其它三种很好地呈现了它们在鲽形目中的系统位置。同时，可以看出mtDNA 16S rRNA基因片段可以构建一个相对准确的树，特别是NJ树和ML树比较接近，更为客观一些。由比对序列获得的物种之间的遗传距离也基本可以反映种、属、科间的不同变异水平。

织纹螺（Nassarius spp.）体内河豚毒素来源的研究

近几十年来，国内沿海地区频繁发生食用织纹螺中毒事件，并导致数十人死亡，这一问题得到了政府相关部门的高度重视。但是，由于织纹螺毒性变化很大，毒素来源不清楚，因此很难预测食用织纹螺中毒事件的发生，这在很大程度上限制了对食用织纹螺中毒事件的有效监测和管理。目前，对于中国沿海有毒织纹螺体内河豚毒素（tetrodotoxin, TTX）的来源还未见过系统研究。本文选取中国沿海常见的半褶织纹螺（Nassarius semiplicatus）、纵肋织纹螺（N. variciferus）和拟半褶织纹螺（N. semiplicatoides sp. nov.）作为实验对象，从毒素的微生物来源与食物链来源这两个角度分别展开研究，以探讨织纹螺体内 TTX 的可能来源，为提出相应的预防管理措施提供科学依据。 首先，我们先后从曾发生过中毒事件的江苏盐城和连云港采集了织纹螺样品，通过小鼠生物测试法和液-质联用分析技术（LC-MS），对织纹螺的毒性和毒素组成进行了测试和分析，分离培养了织纹螺体内及其生活环境中的细菌，应用河豚毒素单克隆抗体酶联免疫检测方法（ELISA）对细菌的产毒情况进行了测试，并通过 16S 核糖体（rRNA）部分基因序列测定对细菌种类进行了初步的分析。研究发现，采自江苏盐城和连云港的半褶织纹螺的毒性分别约为 2 MU/g 和 200 MU/g 组织，体内的毒素成分是河豚毒素及其同系物。从盐城的半褶织纹螺及其生活环境分离的菌株中随机挑出 14 个菌株中，9 个菌株河豚毒素检测结果呈现阳性。从连云港高毒性半褶织纹螺消化腺中分离到的 45 个菌株中，阳性菌株有 21 个。但是，有毒菌株毒素含量较低，毒素含量范围是 15-184ng/g。通过 16S rDNA 部分序列的测序结果发现，大部分有毒菌株与弧菌属（Vibrio）的细菌在遗传序列信息上比较相近。其余有毒菌株分别与希瓦氏菌属（Shewanella）、海单胞菌属（Marinomonas）、黄杆菌属（Tenacibaculum）、动性菌属（Planococcus）、发光杆菌属 (Photobacterium)和气单胞菌属（Aeromonas）的遗传序列比较相近。其中与海单胞菌属、动性菌属和发光杆菌属亲缘关系较近的产毒细菌是首次报道。这一研究表明织纹螺体内及其生活环境中的存在产河豚毒素的细菌，但由于产毒素的量较低，因此可能在织纹螺体内河豚毒素的产生和累积过程并不发挥主要作用。 织纹螺作为一类腐食性的海洋动物，也有可能通过进食含有河豚毒素的生物而累积河豚毒素。对此，我们开展了高毒性半褶织纹螺的室内培养实验，以及河豚毒素在不同种类织纹螺体内的累积和排出的模拟实验，并定期采样，通过液相色谱与串联质谱联用技术（LC-MS/MS）对织纹螺体内河豚毒素及其同系物的含量变化情况进行了分析。室内培养实验发现，从连云港赣榆县采集的高毒性半褶织纹螺，在实验初期，体内毒素含量呈下降的趋势，但从 7月上旬开始，毒素含量突然快速上升，与连云港赣榆县野外采集的织纹螺的毒素含量表现出相似的变化趋势。河豚毒素在不同种织纹螺体内的累积和排出的模拟实验发现，通过投喂高毒性的河豚鱼肝脏（毒性为5×103 MU/g），纵肋织纹螺在一段时间内能够快速累积少量的河豚毒素。当停止投喂有毒河豚鱼肝脏后，毒素含量会快速下降。而在曾导致中毒事件的拟半褶织纹螺中，投喂有毒河豚鱼的肝脏后，其体内毒素含量只有缓慢增加。但在投喂无毒的河豚鱼肝脏后，其毒性却出现了快速增加的现象，这与该地区野外样品的毒性变动状况类似。这些发现显示高毒性半褶、拟半褶织纹螺体内的河豚毒素应当不是食物链累积的结果，而可能是由其自身产生。并且，毒素含量的变化具有一定的生物节律，有可能与产卵、繁殖等自然节律相关。 通过对半褶、纵肋和拟半褶织纹螺的研究工作可以认为，产河豚毒素的细菌不是织纹螺体内河豚毒素的主要来源，并且毒素也不是来自其摄食的食物，推测可能主要是由织纹螺自身产生。织纹螺所表现出的河豚毒素含量的季节性变化，极有可能与产卵、繁殖等自然节律相关，这些发现为预防和管理食用织纹螺中毒事件提供了科学依据。但是，本研究并未完全阐明织纹螺体内河豚毒素的来源，对于织纹螺体内河豚毒素的确切来源以及河豚毒素的代谢和转化机制，还有待于更加深入地研究工作。

鄂霍次克海天然气水合物区与东海内陆架泥质区沉积物古菌多样性研究

为研究鄂霍次克海天然气水合物区沉积物古菌、甲烷厌氧氧化古菌和硫酸盐还原细菌的多样性分布，我们以PCR技术为基础构建mcrA、dsrAB和古菌16S rRNA 基因文库。对所获得的序列进行系统进化和统计学分析发现：鄂霍次克海古菌类群主要为Marine Benthic Group D (MBG-D)、Marine Benthic Group B (MBG-B)、Marine Crenarchaeotic Group I(MG- I)，另外少量古菌16S rRNA基因序列为Anaerobic Methanotrophs 2c（ANME-2c），主要分布在LV39-25H岩心的表层沉积物中。LV39-40H岩心表层的古菌群落结构与其他六个层位古菌群落结构相比有着显著的差异。mcrA基因序列主要为催化甲烷厌氧氧化的古菌ANME-2（c和d簇），在所研究的各个层位的沉积物中均广泛分布。少量的ANME-1（a簇）发现于LV39-40H岩心表层以下的沉积物中。产甲烷古菌数目不多，集中分布在LV39-25H岩心200cm和LV39-40H岩心180cm的沉积物中。dsrAB基因文库分析表明硫酸盐还原细菌种类丰富，表层沉积物中硫酸盐还原细菌多样性最高。在两个岩心所有层位的沉积物中都有一定数量的克隆属于DSS簇，它们可能与ANME共生催化甲烷的厌氧氧化作用。总之，所有数据表明在鄂霍次克海天然气水合物区存在着较活跃的甲烷厌氧氧化作用，揭示了参与甲烷厌氧氧化作用的微生物群落结构和多样性。 为研究东海内陆架闽浙沿岸泥质区不同深度沉积物中古菌群落垂向分布特征，通过古菌16S rRNA 基因文库共得到473个有效克隆50个OTUs (Operational Taxonomic Units)。16S rRNA基因序列系统进化和统计分析发现古菌分别归属于泉古生菌（Crenarchaeota）和广古生菌（Euryarchaeota），其中以Miscellaneous Crenarchaeotic Group（MCG）为主，仅含少量的MBG-B、South African Gold Mine Euryarchaeotic Group(SAGMEG)、 ANME-3、MG- I和MBG-D。该泥质区沉积物可能存在由ANME-3催化的甲烷厌氧氧化作用，同源序列分析表明其古菌群落分布与周边环境有较大联系。UniFrac与沉积物环境因子分析表明该泥质区古菌群落垂向分布与沉积物有机质含量和粒度变化密切相关。 通过对比发现，鄂霍次克海天然气水合物区甲烷厌氧氧化古菌主要为ANME-2和少量的ANME-1，而东海内陆架泥质区甲烷厌氧氧化古菌仅为极少量的ANME-3；鄂霍次克海天然气水合物区广古生菌和泉古生菌数量各占一半，主要为MBG-D、MBG-B、MG-I。东海内陆架泥质区沉积物古菌序列主要为泉古生菌（MCG）。海域类型的不同以及有机碳含量等环境因子的差异可能是这两个海域古菌群落结构差异的主要原因.

应用PCR-DGGE技术分析长江口低氧区和黄海冷水团的细菌群落组成

利用PCR-DGGE技术对长江口外低氧区海域和黄海冷水团海域的细菌群落组成进行了分析。 长江口外低氧区海域的细菌群落组成分析结果为：对获得的25条DGGE条带进行了克隆、测序，所得到的序列进行了系统进化分析（细菌16S rRNA基因V3区序列），分别归属于4个细菌类群：变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroides)、厚壁菌门(Firmicutes)和蓝细菌门(Cyanobacteria)。其中有16条分别与变形细菌亚群的γ和δ-Proteobacteria相似。通过时空分析发现，低氧水体的细菌群落组成与非低氧水体的组成是不同的。低氧水体的优势菌群是拟杆菌门(Bacteroides)中的Flavobacteria。 黄海冷水团海域的细菌群落组成和优势菌群分析结果为：细菌16S rDNA V3区特征片段经DGGE分离、条带切割，共得到24条DGGE条带，克隆、测序后，将所得序列进行系统进化分析，分别归属于2个细菌类群：变形细菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroides)。在24条序列中有16条分别与变形细菌亚群的γ和δ-Proteobacteria相似，有5条与拟杆菌门相似。通过时空分析发现，10月份（冷水团存在期），冷水团内部水体的细菌群落组成包括γ-Proteobacteria、δ-Proteobacteria和Bacteroides，而冷水团外部的水体的细菌群落组成包括γ-Proteobacteria和Bacteroides。冷水团内部水层的优势菌群为γ-Proteobacteria。4月份虽然冷水团没有形成，但是所调查的海域海水温度都不高，在7℃－12℃范围内，所以4月份所有站位，不管是底层的还是总的的细菌群落组成都与10月份冷水团内部（海水温度低于10℃）水体的相同，与10月份冷水团外部（海水温度大于19℃）的不同。

鄂霍次克海天然气水合物区柱状沉积物LV39-18H微生物多样性研究

冷泉是指温度接近于海水，而以高于周围水环境浓度的烃类化合物（主要为甲烷）、硫化物或二氧化碳为主要成分，受地质构造或压力梯度作用渗出沉积物表层的流体。对冷泉沉积物中微生物群落的调查，有助于认识该极端环境中某些生理未知微生物类群的功能并理解微生物活动对整个系统的影响。 本文对从鄂霍次克海冷泉区采集获得的沉积物样品按深度划分得到的11个断层中的6个断层进行了总基因组的提取，利用16S rDNA作为分子标记，构建克隆文库并结合总有机碳、总氮、硫等环境因子对该样品中的细菌和古菌群落结构沿沉积物断层的分布情况进行研究，结果显示该沉积物中的细菌和古菌均具有高度多样性且显示出明显的成层分布： 1.细菌群落主要来自10个细菌门，优势门类为绿弯菌、未定门JS1、γ-、δ-变形菌，同时还发现浮霉菌、未定门OP8、放线菌、酸杆菌、拟杆菌、疣微菌的存在。我们还在分布于表层沉积物δ-变形菌类群中发现了占该层群落15%以上的SRB（硫酸盐还原菌）类群，这强烈提示着该沉积物环境中存在着AOM（甲烷厌氧氧化）过程。 2.古菌类群主要划分为DSAG、MBG-D、MCG、MGI、MBG-A和MHVG等类群。其中MBG-D类群沿断层的垂直分布与沉积物中硫含量表现出相似的变化趋势，这提示MBG-D类群可能参与该环境中硫相关的地质化学过程。

东、西太平洋深海沉积物细菌多样性研究

深海生物圈有着不同于陆地和浅海的典型特点，例如高压、低温、永久黑暗及寡营养，并且深海微生物具有特殊的代谢途径及庞大的生物量，这使得深海成为一个巨大的有待开发利用的生物资源宝库。 本文研究的样品分别取自东太平洋E272站位(12°36’39"N, 104°19’28"W)和西太平洋Ph05-5站位(16°04’93"N, 124º34’48"E)。E272站位距离东太平洋13°N海隆45km，水深3 191m；而Ph05-5站位地处西菲律宾海盆，在黑潮源区附近，位于西太平洋暖池区边缘，水深3 382m，并且Ph05-5岩芯一共包含了五个明显的火山灰层。 本文采用了末端限制性片段长度多态性分析（T-RFLP）和16S rRNA 基因文库分析的方法在小尺度上对东太平洋E272站位的沉积物样品进行细菌群落结构的研究。研究结果表明沉积物细菌群落结构在小尺度上存在明显的垂直变化。系统进化分析表明，该沉积物样品的细菌多样性较高，共包含9个主要的门类，包括变形菌门、绿弯菌门（绿色非硫细菌）、浮霉菌门、酸杆菌门、放线菌门（高G+C革兰氏阳性菌）、拟杆菌门、硝化螺旋菌门、以及两个待定的门类OP8和TM6。其中变形菌门细菌是一类在海洋中非常常见的细菌，广泛分布于各个海洋环境，在我们的文库当中发现了变形菌门的三个纲，包括α-、-、-变形菌纲。本项研究充分表明该沉积物环境中具有较高的细菌多样性，在小尺度上细菌群落垂直分布明显，其结果也可从侧面反映深海沉积物近表层处的环境条件在小尺度上的垂直变化显著。 对西太平洋暖池区沉积物样品的细菌群落的研究也采用16S rRNA 基因文库分析的方法。系统进化分析表明该沉积物样品细菌的多样性相对较低，一共包含了六个不同的门类，包括变形菌门、浮霉菌门、放线菌门、厚壁菌门（低G+C革兰氏阳性菌）、绿弯菌门、酸杆菌门。在这个沉积物样品中也发现了变形菌门的三个纲包括α-、-和-变形菌纲。聚类分析和系统进化分析都表明表层的细菌群落同其它8层的细菌群落存在明显的差异，并且其它8层包括5个火山灰层和3个远洋粘土层的细菌群落结构差异不大，推测火山灰成分不仅对火山灰层的细菌群落产生影响，而且可能通过扩散对整个沉积物的微生物群落结构都产生影响。表层可能由于沉积时间较晚所以受影响相对较小或表层本身不同于较深层次的理化条件而使表层群落存在较大差异。 对东、西太平洋不同环境下的两个深海沉积物样品的细菌多样性进行比较，结合其它研究发现变形菌门细菌在不同深海环境中都普遍存在，是深海不同环境的广适类群。另外，两个环境中的细菌多样性存在很大差异，东太平洋沉积环境中的细菌多样性要远高于西太平洋沉积环境中的细菌多样性，推测其最可能的原因是西太平洋沉积物火山灰成分对细菌群落的影响，致使其细菌群落与东太平洋远洋粘土沉积物细菌群落产生很大差异；另外，不同洋区的环境差异也应该是造成细菌群落差异的一个重要方面。

Antimicrobial screening and active compound isolation from marine bacterium NJ6-3-1 associated with the sponge Hymeniacidon perleve

Twenty-nine marine bacterial strains were isolated from the sponge Hymeniacidon perleve at Nanji island, and antimicrobial screening showed that eight strains inhibited the growth of terrestrial microorganisms. The strain NJ6-3-1 with wide antimicrobial spectrum was identified as Pseudoalteromonas piscicida based on its 16S rRNA sequence analysis. The major antimicrobial metabolite, isolated through bioassay-guide fractionation of TLC bioautography overlay assay, was identified as norharman (a beta-carboline alkaloid) by EI-MS and NMR.

Isolation and characterization of a marine magnetotactic spirillum axenic culture QH-2 from an intertidal zone of the China Sea

Magnetotactic bacteria (MTB) are ubiquitous in aquatic habitats. Because of their fastidious requirements for growth conditions, only very few axenic MTB cultures have been obtained worldwide. In this study, we report a novel marine magnetotactic spirillum axenic culture, designated as QH-2, isolated from the China Sea. It was able to grow in semi-solid or liquid chemically defined medium. The cells were amphitrichously flagellated and contained one single magnetosome chain with an average number of 16 magnetosomes per cell. Phosphate and lipid granules were also observed in the cells. Both rock magnetism and energy-dispersive X-ray spectroscopy characterizations indicated that the magnetosomes in QH-2 were single-domain magnetites (Fe3O4). QH-2 cells swam mostly in a straight line at a velocity of 20-50 mu m/s and occasionally changed to a helical motion. Unlike other magnetotactic spirilla. QH-2 cells responded to light illumination. As a consequence of illumination, the cells changed the direction in which they swam from parallel to the magnetic field to antiparallel. This response appears to be similar to the effect of an increase in [O-2]. Analysis of the QH-2 16S rRNA sequence showed that it had greater than 11% sequence divergence from freshwater magnetotactic spirilla. Thus, the marine QH-2 strain seems to be both phylogenetically and magnetotactically distinct from the freshwater Magnetospirillum spp. studied previously. (C) 2010 Elsevier Masson SAS. All rights reserved.

淡水湖泊中类蛭弧菌的分离鉴定与多样性分析

类蛭弧菌(BALOs)是一种微小的，能够高速运动的革兰氏阴性捕食细菌。它通过裂解宿主细胞来获得自己生长发育所需的物质、能量。类蛭弧菌分布范围广泛，土壤、海洋、湖泊、河流、下水道的污水、水管和水池之中都有它的存在。目前将与蛭弧菌具有相似生活特性的一类细菌称为 “类蛭弧菌”。 该研究从阿哈湖、百花湖和滇池三个内陆淡水湖泊中分离鉴定了宿主菌。利用分离得出的两株宿主菌分离培养类蛭弧菌。进行了16S rRNA基因序列分析。对不同富营养化的高原湖泊中类蛭弧菌的多样性进行比较。在以下几个方面取得了一些进展： 1. 改进了对类蛭弧菌的分离培养方法。我们直接从类蛭弧菌生活的环境中去寻找并提取宿主细菌。这样可以最大程度的保证实验室条件下类蛭弧菌的生长和真实环境中的相似性。我们的实验也证明了这种方法的有效性，并且在实验中我们获得了肠杆菌和黄色假单胞菌这两种类蛭弧菌的宿主菌。 2. 用新分离出来的两种宿主菌，通过噬菌斑生成、吸光度检测，PCR扩增等一系列实验证明我们成功的从淡水湖泊中分离得到了类蛭弧菌。 3、经过对所得的类蛭弧菌的16S rRNA基因序列进行检测,获得了不同类群的类蛭弧菌，并且还发现了新的类群。 3. 构建了分离的类蛭弧菌的系统发生树，对三个湖泊中类蛭弧菌的多样性进行了分析。

Classificacao taxonomica, baseada na caracterizacao molecular, das estirpes de rizobio recomendadas para a culturas da soja e do feijoeiro.

As culturas da soja [Glycine max (L.) Merril] e do feijoeiro (Phaseolus vulgaris) sao de grande importancia economica e social para o Brasil e ambas podem ser capazes de suprir suas necessidades do nutriente nitrogenio pela simbiose com bacterias da familia Rhizobiaceae. Para garantir a maximizacao do processo biologico, porem, deve-se proceder a inoculacao das sementes com estirpes de rizobio eficientes e competitivas, recomendadas pela pesquisa. No Brasil, sao comercializadas, anualmente, cerca de 13 milhoes de doses de inoculantes, sendo 99% destinadas a cultura da soja. Neste trabalho, determinou-se a posicao taxonomica das estirpes de rizobio recomendadas comercialmente para as duas culturas por duas tecnicas, o RFLP-PCR da regiao correspondente ao 16S rRNA (regiao conservada entre bacterias mas suficientemente variavel e carregando informacoes que permitem a determinacao das relacoes filogeneticas entre bacterias) e o sequenciamento parcial dos genes desta regiao. O sequenciamento parcial permitiu definir que duas das estirpes recomendadas para a cultura da soja, SEMIA 587 e SEMIA 5019, pertencem a especie Bradyrhizobium elkanii e as duas outras, SEMIA 5079 e SEMIA 5080, a especie B. japonicum. As duas estirpes recomendadas para a cultura do feijoeiro, SEMIA 4077 e SEMIA 4080, pertencem a especie Rhizobium tropici. As sequencias obtidas para essas estirpes foram depositadas no banco mundial de genes.

Bioinformatyczna analiza struktury i oddziaływań z substratami metylotransferaz RNA odpowiedzialnych za oporność bakterii na antybiotyki

Wydział Biologii: Instytut Biologii Molekularnej i Biotechnologii

Comparative genomics of Bifidobacteria

Chapter 2 of this thesis describes the sequence analysis of 14 bifidobacterial genomes from various species of the genus Bifidobacterium, and the determination of their open pan-genome trend. This analysis first determined the total number of genes to be considered as the reservoir of functions available to representatives of this genus. Many identified genes are still uncharacterized, but may be involved in the adaptation to the gut environment. This comparative genomic analysis also determined a pool of ortholog functions used to infer their phylogenetic relationship, thereby providing a more robust approach compared to that based solely on the16S rRNA-encoding gene. The genome sequence of an isolate from the insect hindgut Bifidobacterium asteroides PRL2011 was fully characterized in Chapter 3, surprisingly revealing a putative respiratory metabolism, which was also found to be present in other insect isolates, suggesting that respiration was an ancient feature of this genus, but also an adaptative trait to different atmosferic oxygen levels. Chapter 4 of this thesis outlines a comparative study which focused on the analysis of representatives of the Bifidobacterium breve species, revealing that the genetic variability among members of this species principally consists of genes with a role in adaptation to host environment and gut colonization. Finally, Chapter 5 describes the analysis of the genome sequence of Bifidobacterium animalis subsp. lactis BLC1, a probiotic bacterium widely used in food industries as an ingredient of functional foods, providing information that will allow future investigations of this species.

Food preservation using antifungal lactic acid bacteria

Fungal spoilage of food and feed prevails as a major problem for the food industry. The use antifungal-producing lactic acid bacteria (LAB) may represent a safer, natural alternative to the use of chemical preservatives in foods. A large scale screen was undertaken to identify a variety of LAB with antifungal properties from plant, animal and human sources. A total of 6,720 LAB colonies were isolated and screened for antifungal activity against the indicator Penicillium expansum. 94 broad-spectrum producers were identified through 16S rRNA sequencing with the majority of the population comprising Lactobacillus plantarum isolates. Six broad-spectrum isolates were consequently characterised. Pedicococcus pentosaceous 54 displayed potent anti-mould capabilities in pear, plum and grape models and may represent an ideal candidate for use in the beverage industry. Two antifungal Lb. plantarum isolates were assessed for their technological robustness and potential as biopreservatives in refrigerated foods. Lb. plantarum 16 and 62 displayed high levels of tolerance to freeze-drying, low temperature exposure and high salt concentrations. Both lactobacilli were introduced as supplements into orange juice to retard the growth of the spoilage yeast Rhodotorula mucilaginosa. Furthermore the isolates were applied as adjuncts in yoghurt production to successfully reduce yeast growth. Lb. plantarum 16 proved to be the optimal inhibitor of yeast growth in both food matrices. To date there is limited information available describing the mechanisms behind fungal inhibition by LAB. The effects of concentrated cell-free supernatant (cCFS), derived from Lb. plantarum 16, on the growth of two food-associated moulds was assessed microscopically. cCFS completely inhibited spore, germ tube and hyphal development. A transcriptomic approach was undertaken to determine the impact of antifungal activity on Aspergillus fumigatus Af293. A variety of genes, most notably those involved in cellular metabolism, were found to have their transcription modulated in response to cCFS which is indicative of global cellular shutdown. This study provides the first insights into the molecular targets of antifungal compounds produced by LAB. The genome sequence of the steep water isolate Lb. plantarum 16 was determined. The complete genome of Lb. plantarum16 consists of a single circular chromosome of 3,044,738 base pairs with an average G+C content of 44.74 % in addition to eight plasmids. The genome represents the smallest of this species to date while harbouring the largest plasmid complement. Some features of particular interest include the presence of two prophages, an interrupted plantaricin cluster and a chromosomal and plasmid encoded polysaccharide cluster. The sequence presented here provides a suitable platform for future studies elucidating the mechanisms governing antifungal production.