A carbohydrate-based mechanism of species recognition in sea urchin fertilization

In the present review, we describe a systematic study of the sulfated polysaccharides from marine invertebrates, which led to the discovery of a carbohydrate-based mechanism of sperm-egg recognition during sea urchin fertilization. We have described unique polymers present in these organisms, especially sulfated fucose-rich compounds found in the egg jelly coat of sea urchins. The polysaccharides have simple, linear structures consisting of repeating units of oligosaccharides. They differ among the various species of sea urchins in specific patterns of sulfation and/or position of the glycosidic linkage within their repeating units. These polysaccharides show species specificity in inducing the acrosome reaction in sea urchin sperm, providing a clear-cut example of a signal transduction event regulated by sulfated polysaccharides. This distinct carbohydrate-mediated mechanism of sperm-egg recognition coexists with the bindin-protein system. Possibly, the genes involved in the biosynthesis of these sulfated fucans did not evolve in concordance with evolutionary distance but underwent a dramatic change near the tip of the Strongylocentrotid tree. Overall, we established a direct causal link between the molecular structure of a sulfated polysaccharide and a cellular physiological event - the induction of the sperm acrosome reaction in sea urchins. Small structural changes modulate an entire system of sperm-egg recognition and species-specific fertilization in sea urchins. We demonstrated that sulfated polysaccharides - in addition to their known function in cell proliferation, development, coagulation, and viral infection - mediate fertilization, and respond to evolutionary mechanisms that lead to species diversity.

Effects of the conditioned medium of mesenchymal stem cells on mouse oocyte activation and development

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been reported to secrete a variety of cytokines and growth factors acting as trophic suppliers, but little is known regarding the effects of conditioned medium (CM) of MSCs isolated from femurs and tibias of mouse on the artificial activation of mouse oocytes and on the developmental competence of the parthenotes. In the current study, we investigated the effect of CM on the events of mouse oocyte activation, namely oscillations of cytosolic calcium concentration ([Ca²+]i), meiosis resumption, pronucleus formation, and parthenogenetic development. The surface markers of MSCs were identified with a fluorescence-activated cell sorter. The dynamic changes of the spindle and formation of pronuclei were examined by laser-scanning confocal microscopy. Exposure of cumulus-oocyte complexes to CM for 40 min was optimal for inducing oocyte parthenogenetic activation and evoking [Ca²+]i oscillations similar to those evoked by sperm (95 vs 100%; P > 0.05). Parthenogenetically activated oocytes immediately treated with 7.5 µg/mL cytochalasin B (CB), which inhibited spindle rotation and second polar body extrusion, were mostly diploid (93 vs 6%, P < 0.01) while CB-untreated oocytes were mostly haploid (5 vs 83%, P < 0.01). Consequently, the blastocyst rate was higher in the CB-treated than in the CB-untreated oocytes. There was no significant difference in developmental rate between oocytes activated with CM and 7% ethanol (62 vs 62%, P > 0.05), but the developmental competence of the fertilized oocytes was superior to that of the parthenotes (88 vs 62%, P < 0.05). The present results demonstrate that CM can effectively activate mouse oocytes, as judged by the generation of [Ca²+]i oscillations, completion of meiosis and parthenogenetic development.

From epithelial to mesenchymal: regulation of invasive cancer cell motility

Metastasis is the main cause of death among cancer patients. In order to initiate the metastatic cascade cancer cells have to undergo epithelial-to-mesenchymal transition (EMT). In EMT epithelial cells lose their cell-cell and cell-extracellular matrix (ECM) contacts and become more motile. The expression of the transcription factor Slug and of the mesenchymal intermediate filament vimentin is induced during EMT. Vimentin is often overexpressed in malignant epithelial cancers but the functional role of vimentin remains incompletely understood. In addition, kinases such as AKT and ERK are known to be involved in the regulation of EMT and cancer cell motility but the mechanisms underlining their functions are often unclear. Integrins are heterodimeric receptors that attach cells to the surrounding tissue and participate in regulating cell migration and invasion. Changes in integrin activity are linked to increased cell motility and further cancer metastasis. The aim for my PhD studies was to investigate the role of cellular signalling pathways and vimentin in the regulation of cancer cell motility and EMT. Our results revealed that in prostate cancer the downregulation of AKT1 and AKT2, but not AKT3, induces activation of cell surface 1-integrins leading to enhanced cell adhesion, migration and invasion. In addition, our findings demonstrated a reciprocal regulatory interaction between vimentin and ERK2 facilitating ERK-mediated phosphorylation of Slug at serine-87 (S87) in breast cancer. Surprisingly, Slug S87 phosphorylation is dispensable for E-cadherin repression but essential for the induction of vimentin and Axl expression in early onset of EMT. Our findings reveal previously unknown mechanistic information of how prostate and breast cancer cell motility and disease progression is regulated

The Chromatoid body entourage: Molecular characterization of the Chromatoid body‐associated cytoplasmic vesicles

Spermatogenesis is a unique process compared to cell differentiation in somatic tissues. Germ cells undergo a considerable number of metabolic and morphological changes during their differentiation: they initially proliferate by mitosis to increase in number; at some point they scramble their genetic material by meiosis, to create new genetic combinations that are the basis for evolution through natural selection and, finally, they change their shape and produce specialized structures characteristic of the mature sperm. Germ cells display an astonishingly broad transcription of their genome compared to differentiated somatic cells. Moreover, the different RNAs need to be specifically regulated in space and time for sperm production to occur appropriately. Different proteins localized in specific subcellular compartments, along with regulatory small RNAs, have an essential role in the proper execution of the different steps of spermatogenesis. These ribonucleoprotein granules interact with cytoplasmic vesicles and organelles to accomplish their role during sperm development. In this study, we characterized the most prominent ribonucleoprotein granule found in germ cells, the Chromatoid body (CB). For the first time we investigated the interaction of the CB with the cytoplasmic vesicles that surround it. These studies directed us to the description of Retromer proteins in germ cells and their involvement with the CB and the acrosome formation. Moreover, we discovered the interplay between the CB and the lysosome system in haploid round spermatids, and identified FYCO1, a new protein central to this interaction. Our results suggest that the vesicular transport system participates in the CB-mediated RNA regulation during sperm development.

Family rivalry in the testis: Retinoblastoma protein and E2F transcription factors in testicular development and adult spermatogenesis

Disorders of male reproductive health are becoming increasingly prevalent globally. These defects, ranging from decreasing sperm counts to an increasing rate of infertility and testicular cancer, have a common origin in the early phases of testicular development, but the exact mechanisms that cause them remain unknown. Testicular development and adult spermatogenesis are complex processes in which different cell types undergo mitosis, meiosis, differentiation and apoptosis. The retinoblastoma protein family and its associated E2F transcription factors are key regulators of these cellular events. In the present study, the functions of these factors in postnatal testicular development and adult spermatogenesis were explored using different animal models. In addition, a new application of flow cytometry to study testicular cell dynamics was developed. An ablation of retinoblastoma protein in mouse Sertoli cells resulted in their cell cycle re-entry in adult testes, dedifferentiation and a severe spermatogenic defect. We showed that deregulated E2F3 contributed to these changes. Our results indicated that the E2F1 transcription factor is critical for the control of apoptosis in the developing postnatal testis. In the adult testis, E2F1 controls the maintenance of the spermatogonial stem cell pool, in addition to inhibiting apoptosis of spermatocytes. In summary, this study elucidated the complex interdependencies of the RB and E2F transcription factor families in the control of postnatal testicular development and adult spermatogenesis. Furthermore, this study provided a new methodology for the analysis of testicular cells.

Sexual behavior and factors affecting female reproduction in house and field crickets

The objective of this investigation was to clarify the adaptive significance of female sexual behaviours in the house cricket, Acheta domesticus, and the Texas field cricket, Gryllus integer. Experiments were focussed primarily on: nutritional factors affecting female reproductive success; the ontogeny of female sexual behaviours; female mating frequency and progeny production; and the pattern of sperm competition. Reproduction of singly mated female A. domesticus assigned to 3 nutritional regimes was compared . Females fed a vitamin and protein-enriched mouse chow, cannibalistic females, and starved females produced on the average, 513 , 200 and 68 offspring, respectively. Cannibals probably could not obtain the same amounts of essential nutrients as females fed mouse chow. Reabsorption of oocytes was likely the major factor contributing to the decreased reproduction of starved females. In addition, female !. domesticus fed mouse chow, but allowed constant access to males produced 11 times as many offspring than did females fed corn meal. Females fed corn meal probably could not absorb or synthesize enough dietary lipids, thus resulting in poor ovariole growth. Female !. domesticus first mate at an average adult age of 7 days, closely corresponding to when they first exhibit positive phonotaxis. Females mate repeatedly and often consume the externally attached spermatophore. In ~. domesticus, females allowed constant access to males produced significantly more offspring than did single maters. Similarly, doubly mated G. integer females produced more offspring than did single maters. This difference resulted largely from the failure of many single maters to reproduce. Remating by female crickets partly functions in offsetting the possibility of a failed initial mating. Nymph production increased significantly with the time the spermatophore was attached in singly mated ~. domesticus. Spermatophore consumption by the female was not affected by male guarding behaviour, and the interval between mating and eating of the spermatophore may often be shorter than the time required for maximum insemination. Some degree of sperm depletion in singly mated !. domesticus and G. integer may have occurred. The patterns of daily offspring production of singly and multiplymated females suggests that a factor provided by a male during mating stimulates female oviposition and/or egg production. Female crickets also might acquire nutrition from spermatophore consumption, a benefit that is augmented by female multiple mating. The electrophoretic examination of various allozymes in ~. integer did not permit determination of a pattern of sperm competition. However, the possibility of last male sperm predominance is related to male guarding behaviour.

The Influence of Male Diet on Life History Traits of Female Mosquitoes

In the field, mosquitoes characteristically feed on sugars soon after emergence and intermittently during their adult lives. Sugar meals are commonly derived from plant nectar and homopteran honeydew, and without them, adults can only survive for a few days on larval reserves. In addition to sugar, females of most species rely on blood for the initiation and maintenance of egg development; thus their reproductive success depends to some extent on the availability of blood hosts. Males, on the other hand, feed exclusively on sugars. Consequently, their sexual maturation and reproductive success is largely dependent upon access to sugar sources. Plant nectar and homopteran honeydew are the two main sugar sources utilized by mosquitoes in the wild. Previous laboratory studies had shown that differences between nectar sources can affect the survivorship and biting frequency of disease vectoring mosquitoes. However, little is known on how sugar composition influence the reproductive processes in male mosquitoes. Male mosquitoes transfer accessory gland proteins and other hormones to their mates along with sperm during mating. In the female, these seminal fluid constituents exert their influence on reproductive genes that control ovulation and vitellogenesis. The present study tests the hypothesis that the mates of males consuming different sugar meals will exhibit varying levels of induction of vitellogenin (a gene which regulates the expression of egg yolk precursor proteins). Real-time quantitative RT-PCR was used to investigate how each sugar meal indirectly influences vitellogenin mRNA abundance in female Anopheles stephensi following mating. Results indicate that mates of nectar-fed males exhibit 2-fold greater change in vitellogenin expression than the mates of honeydew-fed males. However, this response did not occur in non-blood fed controls. These findings suggest that the stimulatory effect of mating on vitellogenesis in blood meal-reliant (i.e. anautogenous) mosquitoes may only be synergistic in nature. The present study also sought to compare the potential fitness costs of mating incurred by females that do not necessarily require a blood meal to initiate a reproductive cycle (i.e., exhibit autogeny). Females of the facultatively autogenous mosquito, Culex molestus were allowed to mate with males sustained on either nectar or honedyew. Mean lifetime fecundity and survivorship of females under the two different mating regimes were then recorded. Additionally, one-dimensional gel electrophoresis was used to verify the transfer of male accessory gland proteins to the sperm storage organs of females during mating.While there was no significant difference in survival between the test treatments, the mates of nectar-fed males produced 11% more eggs on average than mates of honeydew-fed males. However, additional data are needed to justify the extrapolation of these findings to natural settings. These findings prompt further investigation as the differences caused by diet variation in males may be reflected across other life history traits such as mating frequency and insemination capacity.

Les gènes et protéines BSP chez la souris et l’humain : clonage, caractérisation, expression sous forme recombinante et étude des fonctions biologiques

L’infertilité affecte environ 15% des couples en âge de se reproduire. Dans près de la moitié des cas, des facteurs masculins sont à la base de l’infertilité, quoique les causes exactes demeurent souvent inconnues. Les spermatozoïdes de mammifères subissent une série d’étapes de maturation avant d’acquérir la capacité de féconder un ovocyte. Les premiers changements ont lieu à l’intérieur de l’épididyme, où les spermatozoïdes gagnent la capacité de se mouvoir ainsi que de reconnaître et d’interagir avec l’ovocyte. Suite à l’éjaculation, ils doivent subir une seconde série de modifications à l’intérieur du tractus génital femelle, nommée capacitation. Nous avons préalablement démontré que chez le bovin, la famille de protéines BSP (Binder of SPerm) est essentielle à la capacitation. Des homologues des BSP ont aussi été isolés du fluide séminal de porc, de bouc, de bélier, de bison et d’étalon. Malgré la détection d’antigènes apparentés aux BSP dans le fluide séminal de souris et d’humain, les homologues des BSP n’ont jamais été caractérisés chez ces espèces. Nous avons émis l’hypothèse que des homologues des BSP seraient exprimés chez la souris et l’humain et joueraient un rôle dans la maturation des spermatozoïdes. Nous avons démontré que des séquences homologues aux BSP sont présentes dans les génomes murin et humain. Le génome murin contient trois séquences; Bsph1, Bsph2a et Bsph2b, tandis qu’une seule séquence (BSPH1) a été identifée chez l’humain. Les séquences d’ADNc de Bsph1, Bsph2a et BSPH1 ont été clonées, tandis que Bsph2b serait probablement un pseudogène. Les trois gènes sont exprimés uniquement dans l’épididyme et font partie d’une sous-famille distincte à l’intérieur de la famille des BSP. Chez les ongulés, les BSP sont exprimées par les vésicules séminales, sont ajoutées aux spermatozoïdes lors de l’éjaculation et représentent une proportion significative des protéines du plasma séminal. Au contraire, les BSP épididymaires ne sont retrouvées qu’en faibles quantités dans le fluide séminal. L’étude de leur rôle dans les fonctions spermatiques était donc plus difficile que chez les ongulés, où l’isolement des protéines natives du plasma séminal à l’aide de techniques de chromatographie était possible. Afin d’étudier sa fonction, nous avons exprimé BSPH1 recombinante dans E. coli. Les ponts disulfure des domaines de type-II caractéristiques de ces protéines ont fait en sorte que l’expression de BSPH1 fusionnée à une étiquette hexahistidine ou glutathion-S-transférase a donné lieu à des protéines insolubles dans les corps d’inclusion. La production de BSPH1 soluble a été possible grâce à l’ajout d’une étiquette thiorédoxine et l’expression dans une souche au cytoplasme oxidatif. BSPH1 a été purifiée par affinité et sa liaison aux partenaires connus des BSP, la phosphatidylcholine, les lipoprotéines de faible densité et la membrane des spermatozoïdes, suggérait que la protéine recombinante possédait sa conformation native et pouvait être utilisée pour des essais fonctionnels. La forme native de BSPH1 a été détectée dans le plasma séminal humain suite au fractionnement par gel filtration. La liaison de BSPH1 native à une colonne d’affinité à l’héparine a indiqué qu’elle partage aussi cette propriété de liaison avec la famille des BSP, et pourrait lier les GAGs semblables à l’héparine du tractus génital féminin. Une colonne d’immunoaffinité anti-BSPH1 a été préparée à l’aide d’anticorps générés contre des protéines recombinantes, et a permis d’isoler BSPH1 native à partir d’extraits de spermatozoïdes humains. Nos résultats montrent que BSPH1 native serait localisée dans les microdomaines « rafts » de la membrane. Sa masse moléculaire apparente était de 32 kDa, ce qui est supérieur à la masse prédite selon sa séquence en acides aminés, indiquant la présence probable de modifications post-traductionnelles, ou d’une migration anormale. L’effet de BSPH1 recombinante et des anticorps anti-BSPH1 sur la motilité, la viabilité et la capacitation a aussi été étudié. Les deux dernières variables ont été mesurées par un essai de cytométrie en flux, optimisé dans cette étude. Aucun effet des protéines recombinantes ou des anticorps sur la motilité et la viabilité des spermatozoïdes n’a été noté. Quoiqu’une stimulation modeste, quoique significative, de la capacitation ait été observée à la plus faible concentration de BSPH1, les concentrations plus élevées n’ont pas montré d’effet. De la même manière, les anticorps anti-BSPH1 n’ont pas eu d’effet significatif sur la capacitation. Ces résultats suggèrent que BSPH1 produite dans E. coli n’affecte pas la capacitation de façon marquée. Cependant, puisque BSPH1 native possède probablement des modifications post-traductionnelles, une protéine recombinante produite dans des cellules de mammifères pourrait affecter les fonctions spermatiques. De manière alternative, les BSP épididymaires remplissent peut-être un rôle différent dans les fonctions spermatiques que celles sécrétées par les vésicules séminales des ongulés. Les résultats décrits dans cette thèse pourraient contribuer à améliorer le diagnostic de l’infertilité masculine, ainsi que les techniques de reproduction assistée et éventuellement, pourraient mener au développement de contraceptifs masculins.

Stratégies de reproduction des mâles et des femelles chez le macaque rhésus (Macaca mulatta)

Contrairement à d’autres groupes animaux, chez les primates, la hiérarchie de dominance ne détermine pas systématiquement le succès reproductif des mâles. Afin de comprendre pourquoi, j’ai étudié les stratégies de reproduction des mâles et des femelles dans un groupe de macaques rhésus de la population semi-libre de Cayo Santiago (Porto Rico), collectant des données comportementales, hormonales et génétiques pendant deux saisons de reproduction. Les résultats se résument en cinq points. 1. Les nouveaux mâles qui ont immigré dans le groupe d’étude occupaient tous les rangs les plus subordonnés de la hiérarchie de dominance et ont monté en rang suite au départ de mâles plus dominants. Ainsi, l’acquisition d’un rang supérieur s’est faite passivement, en absence de conflits. Par conséquent, les mâles dominants étaient généralement d’âge mature et avaient résidé plus longtemps dans le groupe que les mâles subordonnés. 2. L’accès des mâles aux femelles est en accord avec le « modèle de la priorité d’accès » selon lequel le nombre de femelles simultanément en œstrus détermine le rang de dominance du mâle le plus subordonné qui peut avoir accès à une femelle (p. ex. le mâle de rang 4 s’il y a quatre femelles en œstrus). Bien que les mâles dominants aient eu plus de partenaires et aient monopolisé les femelles de qualité supérieure (dominance, parité, âge) pendant leur période ovulatoire (identifiée grâce au profil hormonal de la progestérone), le rang de dominance n’a pas déterminé le succès reproductif, les mâles intermédiaires ayant engendré significativement plus de rejetons que prédit. Il est possible que ces jeunes adultes aient produit un éjaculat de meilleure qualité que les mâles dominants d’âge mature, leur donnant un avantage au niveau de la compétition spermatique. 3. Les mâles dominants préféraient les femelles dominantes, mais cette préférence n’était pas réciproque, ces femelles coopérant plutôt avec les mâles intermédiaires, plus jeunes et moins familiers (c.-à-d. courte durée de résidence). Au contraire, les femelles subordonnées ont coopéré avec les mâles dominants. La préférence des femelles pour les mâles non familiers pourrait être liée à l’attrait pour un nouveau bagage génétique. 4. L’intensité de la couleur de la peau du visage des femelles pendant le cycle ovarien était corrélée au moment de la phase ovulatoire, une information susceptible d’être utilisée par les mâles pour maximiser leur probabilité de fécondation. 5. Les femelles retiraient des bénéfices directs de leurs liaisons sexuelles. En effet, les femelles en liaison sexuelle bénéficiaient d’un niveau de tolérance plus élevé de la part de leur partenaire mâle lorsqu’elles étaient à proximité d’une source de nourriture défendable, comparativement aux autres femelles. En somme, bien que les mâles dominants aient bénéficié d’une priorité d’accès aux femelles fertiles, cela s’est avéré insuffisant pour leur garantir la fécondation de ces femelles parce que celles-ci avaient plusieurs partenaires sexuels. Il semble que l’âge et la durée de résidence des mâles, corrélats de leur mode d’acquisition du rang, aient confondu l’effet du rang de dominance.

Actin cytoskeleton regulates pollen tube growth and tropism

La fertilisation chez les plantes dépend de la livraison des cellules spermatiques contenues dans le pollen à l’ovule. Au contact du stigmate, le grain de pollen s’hydrate et forme une protubérance, le tube pollinique, chargé de livrer les noyaux spermatiques à l’ovule. Le tube pollinique est une cellule à croissance rapide, anisotrope et non autotrophe; ainsi tout au long de sa croissance à travers l’apoplaste du tissu pistillaire, le tube pollinique puise ses sources de carbohydrates et de minéraux du pistil. Ces éléments servent à la synthèse des constituants de la paroi qui seront acheminés par des vésicules de sécrétion jusqu’à l’apex du tube. Ce dernier doit aussi résister à des pressions mécaniques pour maintenir sa forme cylindrique et doit répondre à différents signaux directionnels pour pouvoir atteindre l’ovule. Mon projet de doctorat était de comprendre le rôle du cytosquelette dans la croissance anisotrope du tube pollinique et d’identifier les éléments responsables de sa croissance et de son guidage. Le cytosquelette du tube pollinique est composé des microfilaments d’actine et des microtubules. Pour assurer une bonne croissance des tubes polliniques in vitro, les carbohydrates et les éléments de croissance doivent être ajoutés au milieu à des concentrations bien spécifiques. J’ai donc optimisé les conditions de croissance du pollen d’Arabidopsis thaliana et de Camellia japonica qui ont été utilisés avec le pollen de Lilium longiflorum comme modèles pour mes expériences. J’ai développé une méthode rapide et efficace de fixation et de marquage du tube pollinique basée sur la technologie des microondes. J’ai aussi utilisé des outils pharmacologiques, mécaniques et moléculaires couplés à différentes techniques de microscopie pour comprendre le rôle du cytosquelette d’actine lors de la croissance et le tropisme du tube pollinique. J’ai trouvé que le cytosquelette d’actine et plus précisément l’anneau d’actine localisé dans la partie sub-apicale du tube est fortement impliqué dans la croissance et le maintien de l’architecture du tube à travers le contrôle de la livraison des vésicules de sécrétion. J’ai construit une chambre galvanotropique qui peut être montée sur un microscope inversé et qui sert à envoyer des signaux tropistiques bien précis à des tubes polliniques en croissance. J’ai trouvé que les filaments d’actine sont impliqués dans la capacité du tube pollinique à changer de direction. Ce comportement tropistique dépend de la concentration du calcium dans le milieu de croissance et du flux de calcium à travers des canaux calciques. Le gradient de calcium établi dans le tube pollinique affecte l’activité de certaines protéines qui se lient à l’actine et dont le rôle est la réorganisation des filaments d’actine. Parmi ces protéines, il y a celles de dépolymérisation de l’actine (ADF) dont deux spécifiquement exprimées dans le gamétophyte mâle d’Arabidopsis (ADF7 et ADF10). Par marquage avec des proteins fluorescents, j’ai trouvé que l’ADF7 et l’ADF10 ont des expressions différentielles pendant la microsporogenèse et la germination et croissance du tube pollinique et qu’elles partagent entre elles des rôles importants durant ces différents stades.

Étude du mécanisme de protection des spermatozoïdes de mammifères par le lait

Le lait écrémé est utilisé depuis plus d’un demi-siècle comme diluant protecteur des spermatozoïdes de mammifères. Depuis quelques années, il existe une demande grandissante pour des diluants exempts de produits d’origine animale. Toutefois, le mécanisme par lequel le lait protège les spermatozoïdes n’est pas connu, ce qui rend difficile de lui trouver un substitut. Les protéines majeures du plasma séminal de taureau, les protéines « Binder of SPerm » (BSP), sont néfastes lors de la conservation de la semence. Les spermatozoïdes sont en contact avec une grande concentration de protéines BSP qui stimulent une extraction continuelle de cholestérol/phospholipides de leur membrane plasmique. Les lipoprotéines de faible densité (LDL) du jaune d’oeuf, un autre composé utilisé dans les diluants, empêcheraient les protéines BSP de se lier à la membrane des spermatozoïdes de taureaux et de stimuler un efflux des lipides membranaires, ce qui les protégerait durant la conservation. Notre hypothèse était que les protéines du lait protègent les spermatozoïdes durant la conservation en séquestrant les protéines BSP. Premièrement, nous avons démontré par filtration sur gel qu’il y a une interaction entre les protéines BSP bovines et les protéines du lait. Le lait écrémé a été fractionné en trois fractions : F1 (alpha-lactalbumine, bêta-lactoglobuline et caséine kappa), F2 (toutes les protéines du lait) et F3 (sels, sucres et petits peptides). Les protéines BSP1 et BSP5 ont une affinité plus grande pour F1 que BSP3, tandis que toutes les protéines BSP ont une affinité pour F2. Le titrage calorimétrique isotherme a permis de confirmer l’interaction entre les protéines BSP et les protéines du lait. L’association entre la protéine BSP1 bovine et les micelles de caséines est caractérisée par une constante d’affinité (Ka) de 3.5 × 10^5 M-1 et un paramètre stoichiométrique (n) de 4,5 BSP1 pour une caséine. L’association entre la protéine BSP1 bovine et l’alpha-lactalbumine (une protéine du sérum principale), est caractérisée par un Ka de 2.4 × 10^5 M-1 et une valeur “n” de 0,8. Ces résultats indiquent que le lait protège les spermatozoïdes bovins en séquestrant les protéines BSP grâce à une interaction protéine : protéine, tandis que le jaune d’oeuf les protège grâce à une interaction protéine : lipoprotéine. Deuxièmement, nous avons démontré par filtration sur gel que les protéines homologues aux BSP bovines retrouvées dans le plasma séminal de porc, d’étalon et de bélier ont une affinité avec les protéines du lait, ce qui suggère que le mécanisme de protection des spermatozoïdes par le lait pourrait être le même chez ces espèces. Troisièmement, nous avons caractérisé l’interaction entre BSP1 bovine et les LDL du jaune d’oeuf qui a un Ka de 3.4 ± 0.4 × 10^6 M-1 et une valeur de « n » de 104 BSP1 pour une particule de LDL, indiquant qu’il existe des différences entre le mécanisme de protection des spermatozoïdes par le lait et le jaune d’oeuf. Nous croyons que les résultats présentés dans cette thèse aideront à créer de nouveaux diluants ne contenant pas de produits d’origine animale afin de cryoconserver les spermatozoïdes des mammifères.

Comparaison de deux nouvelles méthodes d’évaluation de la fertilité masculine avec le spermogramme chez des patients ayant recours à la fécondation in vitro

Des facteurs masculins sont identifiés dans près de la moitié des cas d’infertilité. À ce jour, les tests évaluant la fertilité masculine demeurent peu prédictifs de la survenue d’une grossesse. Dans le but de pallier cette lacune, nous avons mis au point deux nouveaux tests mesurant l’intégrité de l’ADN et le temps de survie des spermatozoïdes. Nous avons effectué une étude prospective portant sur 42 couples infertiles suivis en fécondation in vitro (FIV). Le spermogramme a été effectué selon les critères de l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) et le temps de survie des spermatozoïdes exposés à un détergent cationique a été mesuré en observant la mobilité sous microscope. L’intégrité de l’ADN des spermatozoïdes a été vérifiée par la nouvelle méthode de marquage radioenzymatique et par analyse de la structure de la chromatine (SCSA). Tous les tests ont été réalisés sur la partie des échantillons de sperme non utilisée par la clinique de fertilité. Le projet a été approuvé par le comité d’éthique du Centre Hospitalier Universitaire de Montréal (CHUM) et les patients ont préalablement signé un formulaire de consentement éclairé. L’analyse des paramètres du spermogramme et de l’intégrité de l’ADN n’a montré aucune différence statistiquement significative entre les données chez les couples avec ou sans grossesse. Cependant, le taux de grossesse biochimique était statistiquement plus élevé chez les couples dont le temps de survie des spermatozoïdes était long (>250 s) comparativement à ceux dont ce temps était court (≤250 s): 66% vs 27% respectivement (p<0,05). Les taux de grossesse clinique et d’implantation étaient aussi plus élevés, mais les différences n’atteignaient pas le seuil de signification statistique. Nos résultats confirment que le spermogramme et la mesure de la fragmentation de l’ADN des spermatozoïdes ne sont pas de bons facteurs prédictifs des résultats de la FIV. Par contre, le test de survie des spermatozoïdes serait un meilleur indicateur de la possibilité d’une grossesse en FIV. L’amélioration de sa spécificité et un plus grand nombre de sujets sont nécessaires avant de proposer son application en clinique de fertilité.

Cell wall composition regulates cell shape and growth behaviour in pollen tubes

L’une des particularités fondamentales caractérisant les cellules végétales des cellules animales est la présence de la paroi cellulaire entourant le protoplaste. La paroi cellulaire joue un rôle primordial dans (1) la protection du protoplaste, (2) est impliquée dans les mécanismes de filtration et (3) est le lieu de maintes réactions biochimiques nécessaires à la régulation du métabolisme et des propriétés mécaniques de la cellule. Les propriétés locales d’élasticité, d’extensibilité, de plasticité et de dureté des composants pariétaux déterminent la géométrie et la forme des cellules lors des processus de différentiation et de morphogenèse. Le but de ma thèse est de comprendre les rôles que jouent les différents composants pariétaux dans le modelage de la géométrie et le contrôle de la croissance des cellules végétales. Pour atteindre cet objectif, le modèle cellulaire sur lequel je me suis basé est le tube pollinique ou gamétophyte mâle. Le tube pollinique est une protubérance cellulaire qui se forme à partir du grain de pollen à la suite de son contact avec le stigmate. Sa fonction est la livraison des cellules spermatiques à l’ovaire pour effectuer la double fécondation. Le tube pollinique est une cellule à croissance apicale, caractérisée par la simple composition de sa paroi et par sa vitesse de croissance qui est la plus rapide du règne végétal. Ces propriétés uniques font du tube pollinique le modèle idéal pour l’étude des effets à courts termes du stress sur la croissance et le métabolisme cellulaire ainsi que sur les propriétés mécaniques de la paroi. La paroi du tube pollinique est composée de trois composantes polysaccharidiques : pectines, cellulose et callose et d’une multitude de protéines. Pour comprendre les effets que jouent ces différents composants dans la régulation de la croissance du tube pollinique, j’ai étudié les effets de mutations, de traitements enzymatiques, de l’hyper-gravité et de la gravité omni-directionnelle sur la paroi du tube pollinique. En utilisant des méthodes de modélisation mathématiques combinées à de la biologie moléculaire et de la microscopie à fluorescence et électronique à haute résolution, j’ai montré que (1) la régulation de la chimie des pectines est primordiale pour le contrôle du taux de croissance et de la forme du tube et que (2) la cellulose détermine le diamètre du tube pollinique en partie sub-apicale. De plus, j’ai examiné le rôle d’un groupe d’enzymes digestives de pectines exprimées durant le développement du tube pollinique : les pectate lyases. J’ai montré que ces enzymes sont requises lors de l’initiation de la germination du pollen. J’ai notamment directement prouvé que les pectate lyases sont sécrétées par le tube pollinique dans le but de faciliter sa pénétration au travers du style.

Implication des peptides RALFs dans les communications cellulaires lors du développement du gamétophyte femelle chez Solanum chacoense et Arabidopsis thaliana.

Chez les angiospermes, la reproduction passe par la double fécondation. Le tube pollinique délivre deux cellules spermatiques au sein du gamétophyte femelle. Une cellule féconde la cellule œuf pour produire un zygote; l’autre féconde la cellule centrale pour produire l’endosperme. Pour assurer un succès reproductif, le développement du gamétophyte femelle au sein de l’ovule doit établir un patron cellulaire qui favorise les interactions avec le tube pollinique et les cellules spermatiques. Pour ce faire, un dialogue doit s’établir entre les différentes cellules de l’ovule lors de son développement, de même que lors de la fécondation. D’ailleurs, plusieurs types de communications intercellulaires sont supposées suite à la caractérisation de plusieurs mutants développementaux. De même, ces communications semblent persister au sein du zygote et de l’endosperme pour permettre la formation d’un embryon viable au sein de la graine. Malgré les développements récents qui ont permis de trouver des molécules de signalisation supportant les modèles d’interactions cellulaires avancés par la communauté scientifique, les voies de signalisation sont de loin très incomplètes. Dans le but de caractériser des gènes encodant des protéines de signalisation potentiellement impliqués dans la reproduction chez Solanum chacoense, l’analyse d’expression des gènes de type RALF présents dans une banque d’ESTs (Expressed Sequence Tags) spécifiques à l’ovule après fécondation a été entreprise. RALF, Rapid Alcalinization Factor, est un peptide de 5 kDa qui fait partie de la superfamille des «protéines riches en cystéines (CRPs)», dont les rôles physiologiques au sein de la plante sont multiples. Cette analyse d’expression a conduit à une analyse approfondie de ScRALF3, dont l’expression au sein de la plante se limite essentiellement à l’ovule. L’analyse de plantes transgéniques d’interférence pour le gène ScRALF3 a révélé un rôle particulier lors de la mégagamétogénèse. Les plantes transgéniques présentent des divisions mitotiques anormales qui empêchent le développement complet du sac embryonnaire. Le positionnement des noyaux, de même que la synchronisation des divisions au sein du syncytium, semblent responsables de cette perte de progression lors de la mégagamétogénèse. L’isolement du promoteur de même que l’analyse plus précise d’expression au sein de l’ovule révèle une localisation sporophytique du transcrit. La voie de signalisation de l’auxine régule également la transcription de ScRALF3. De surcroît, ScRALF3 est un peptide empruntant la voie de sécrétion médiée par le réticulum endoplasmique et l’appareil de Golgi. En somme, ScRALF3 est un important facteur facilitant la communication entre le sporophyte et le gamétophyte pour amener à maturité le sac embryonnaire. L’identification d’un orthologue potentiel chez Arabidopsis thaliana a conduit à la caractérisation de AtRALF34. L’absence de phénotype lors du développement du sac embryonnaire suggère, cependant, de la redondance génétique au sein de la grande famille des gènes de type RALF. Néanmoins, les peptides RALFs apparaissent comme d’importants régulateurs lors de la reproduction chez Solanum chacoense et Arabidopsis thaliana.

The orphan nuclear receptor NR5A2 regulates peri-ovulatory events and their consequent luteinization in mice

Le récepteur nucléaire Nr5a2, également connu sous le nom de liver receptor homolog-1 (Lrh-1), est exprimé au niveau de l’ovaire chez la souris, exclusivement dans les cellules lutéales et de la granulosa. La perturbation de Nr5a2, spécifique aux cellules de la granulosa chez la souris à partir des follicules primaires dans la trajectoire du développement folliculaire a démontré que Nr5a2 est un régulateur clé de l’ovulation et de la fertilité chez la femelle. Notre hypothèse veut que Nr5a2 régule les évènements péri- et post-ovulatoires dans une séquence temporelle lors de la folliculogénèse. Afin d'étudier l’implication de Nr5a2 lors de l’ovulation et de la lutéinisation à différents stades du développement folliculaire, nous avons généré deux modèles de souris knockout spécifiques aux cellules de la granulosa pour Nr5a2: 1) Nr5a2Amhr2-/-, avec une réduction de Nr5a2 à partir des follicules primaires et subséquents; 2) Nr5a2Cyp19-/-, avec une réduction de Nr5a2 débutant au stade antral de développement en progressant. L’absence de Nr5a2 à partir des follicules antraux a résulté en une infertilité chez les femelles Nr5a2Cyp19-/-, de même qu’en des structures non-fonctionnelles similaires aux structures lutéales au niveau des ovaires, en une réduction des niveaux de progestérone synthétisée ainsi qu’en un échec dans le support d’une pseudo-gestation. La synthèse de progestérone a été entravée suite à l’absence de Nr5a2 par l’entremise d’une régulation à la baisse des gènes reliés au transport du cholestérol, Scarb1, StAR et Ldlr, démontré par qPCR. Les complexes cumulus-oocytes des femelles Nr5a2Cyp19-/- immatures super-stimulées ont subi une expansion in vivo, mais l’ovulation a été perturbée, possiblement par une régulation à la baisse du gène du récepteur de la progestérone (Pgr). Un essai d’expansion du cumulus in vitro a démontré une expansion défectueuse du cumulus chez les Nr5a2Amhr2-/-, associée à un dérèglement de la protéine des jonctions communicantes (Gja1; Cx43). Cependant, l’expansion du cumulus chez les Nr5a2Cyp19-/- n’a pas été autant affectée. Des résultats obtenus par qPCR ont démontré une régulation à la baisse dans l’expression des gènes Areg, Ereg, Btc et Tnfaip6 chez les deux modèles de cellules ovariennes knockout à 2h et 4h post hCG. Nous avons observé que 85% des oocytes, chez les deux génotypes mutants, peuvent subir une rupture de la vésicule germinative, confirmant leur capacité de maturation in vivo. La technique d’injection intra-cytoplasmique de spermatozoïdes a prouvé que les oocytes des deux génotypes mutants sont fertilisables et que 70% des embryons résultants ont poursuivi leur développement vers le stade de blastocyste, et ce, indépendamment du génotype. En conclusion, Nr5a2 régule la fertilité chez les femelles tout au long du processus du développement folliculaire. Il a été démontré que Nr5a2 est essentiel à la lutéinisation et que sa perturbation dans les cellules somatiques ovariennes ne compromet pas la capacité des oocytes à être fertilisés. En vue d’ensemble, nous avons fourni une investigation inédite et complète, utilisant de multiples modèles et techniques afin de déterminer les mécanismes par lesquels Nr5a2 régule les importants processus que sont l’expansion du cumulus, l’ovulation ainsi que la formation du corps jaune.