Mode of action of a Drosophila FMRFamide in inducing muscle contraction

Drosophila melanogaster is a model system for examining the mechanisms of action of neuropeptides. DPKQDFMRFamide was previously shown to induce contractions in Drosophila body wall muscle fibres in a Ca(2+)-dependent manner. The present study examined the possible involvement of a G-protein-coupled receptor and second messengers in mediating this myotropic effect after removal of the central nervous system. DPKQDFMRFamide-induced contractions were reduced by 70% and 90%, respectively, in larvae with reduced expression of the Drosophila Fmrf receptor (FR) either ubiquitously or specifically in muscle tissue, compared with the response in control larvae in which expression was not manipulated. No such effect occurred in larvae with reduced expression of this gene only in neurons. The myogenic effects of DPKQDFMRFamide do not appear to be mediated through either of the two Drosophila myosuppressin receptors (DmsR-1 and DmsR-2). DPKQDFMRFamide-induced contractions were not reduced in Ala1 transgenic flies lacking activity of calcium/calmodulin-dependent protein kinase (CamKII), and were not affected by the CaMKII inhibitor KN-93. Peptide-induced contractions in the mutants of the phospholipase C-β (PLCβ) gene (norpA larvae) and in IP3 receptor mutants were similar to contractions elicited in control larvae. The peptide failed to increase cAMP and cGMP levels in Drosophila body wall muscles. Peptide-induced contractions were not potentiated by 3-isobutyl-1-methylxanthine, a phosphodiesterase inhibitor, and were not antagonized by inhibitors of cAMP-dependent or cGMP-dependent protein kinases. Additionally, exogenous application of arachidonic acid failed to induce myogenic contractions. Thus, DPKQDFMRFamide induces contractions via a G-protein coupled FMRFamide receptor in muscle cells but does not appear to act via cAMP, cGMP, IP3, PLC, CaMKII or arachidonic acid.

Endothelin-1 and H2O2-induced signaling in vascular smooth muscle cells : modulation by CaMKII and Nitric oxide

L’endothéline-1 (ET-1) est un peptide vasoactif extrêmement puissant qui possède une forte activité mitogénique dans les cellules du muscle lisse vasculaire (VSMCs). Il a été démontré que l’ET-1 est impliquée dans plusieurs maladies cardio-vasculaires, comme l’athérosclérose, l'hypertension, la resténose après l'angioplastie, l’insuffisance cardiaque et l'arythmie. L’ET-1 exerce ses effets via plusieurs voies de signalisation qui incluent le Ca2+, les protéines kinases activées par les mitogènes (MAPKs) y compris les kinases régulées par les signaux extracellulaires (ERK1/2) et la voie de la phosphatidylinositol 3-kinase (PI-3K)/protein kinase B (PKB). Plusieurs études ont démontré que les dérivés réactifs de l'oxygène (ROS) peuvent jouer un rôle important dans la signalisation d’ERK1/2 et de PKB induite par plusieurs facteurs de croissance et hormones. Nous avons précédemment montré que l'ET-1 produit des ROS qui agissent comme médiateur de la signalisation cellulaire induite par l’ET-1. Le peroxyde d’hydrogène (H2O2), une molécule qui appartient à la famille des ROS, peut activer les voies de la MAPK et de la PKB dans les VSMCs. Par ailleurs, nos résultats suggèrent également que le Ca2+ et la calmoduline (CaM) sont essentiels pour la phosphorylation d’ERK1/2, de p38 et de PKB induite par le H2O2 dans les VSMCs. La Ca2+/CaM-dependent protein kinases II (CaMKII) est une sérine/thréonine protéine kinase multifonctionnelle activée par le Ca2+/CaM. Il a été montré que la CaMKII est impliquée dans les voies de signalisation induite par le H2O2 dans les cellules endothéliales. Cependant, le rôle de la CaMKII dans la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de la proline-rich tyrosine kinase 2 (Pyk2) induite par l’ET-1 et le H2O2, de même que son rôle dans l’effet hypertrophique et prolifératif de l’ET-1 dans les VSMCs demeure inexploré. Le monoxyde d’azote (NO) est une molécule vasoactive impliquée dans la régulation de plusieurs réponses hormonales. Le NO peut moduler la signalisation contrôlant la croissance cellulaire induite par plusieurs agonistes d’où son rôle protecteur dans le système vasculaire. Des études ont montré que le NO peut inhiber la voie de Ras/Raf/ERK1/2 et la voie de PKB induite par le facteur de croissance endothélial (EGF) et l’angiotensine II (Ang II). Beaucoup d’autres travaux ont mis en évidence un cross-talk entre les voies de signalisation activées par l’ET-1 et le NO. La capacité du NO à inhiber la signalisation intracellulaire induite par l’ET-1 dans les VSMCs demeure inconnue. Le travail présenté dans cette thèse vise à déterminer le rôle du système Ca2+-CaM-CaMKII dans la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de Pyk2 induite par l’ET-1 et le H2O2 ainsi que son rôle dans la croissance et la prolifération cellulaire induites par l’ET-1 dans les VSMCs. Nous avons également testé le rôle du NO dans la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de Pyk2 ainsi que la synthèse protéique induite par l’ET-1. Dans la première partie de notre étude, nous avons examiné le rôle de la CaMKII dans la phosphorylation d’ERK1/2 et de PKB induite par l’ET-1 dans les VSMCs en utilisant trois approches différentes i.e. l'usage d'inhibiteurs pharmacologiques, un peptide auto-inhibiteur de la CaMKII (CaMKII AIP) et la technique de siRNA. Nous avons démontré que la CaMKII est impliquée dans la phosphorylation d’ERK1/2 et de PKB induite par l’ET-1 dans les VSMCs. Des études précédentes ont montré à l’aide d’inhibiteurs pharmacologiques comme le KN-93 que l'Ang II et les agents induisant une augmentation de la concentration en Ca2+ intracellulaire comme l’ionomycine, provoquent la phosphorylation d’ERK1/2 via la CaM dans les VSMCs. Cependant, en utilisant différentes approches, nos études ont montré pour la première fois une implication de la CaMKII dans la phosphorylation d’ERK1/2 et de PKB induite par l’ET-1 dans les VSMCs. Nous avons également rapporté pour la première fois, un rôle crucial de la CaMKII dans la pathophysiologie vasculaire associée à l’ET-1 puisque l’activation de la CaMKII joue un rôle important dans l’hypertrophie et la croissance cellulaire. Dans la deuxième partie, à la lumière des études précédentes qui montraient que les ROS agissent comme médiateurs de la signalisation induite par l’ET-1 dans les VSMCs, nous avons examiné si la CaMKII est également impliquée dans l’activation des voies d’ERK1/2 et de PKB induite par le H2O2. En utilisant des approches pharmacologiques et moléculaires, nous avons montré, comme pour l’ET-1, que la CaMKII joue un rôle critique en amont de la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de Pyk2 induite par le H2O2. Nous avons précédemment montré que la transactivation du récepteur de type I de l’insulin-like growth factor (IGF-1R) est nécessaire à l’activation de PKB induite par le H2O2. Pour cette raison, nous avons examiné l'effet de l'inhibition de la CaMKII par l’inhibiteur pharmacologique ou par le knock-down de la CaMKII sur la phosphorylation d’IGF-1R induite par le H2O2. Les résultats démontrent que la CaMKII joue un rôle critique en amont de la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et d’IGF-1R induite par le H2O2. Dans la troisième partie de notre étude, nous avons également examiné le mécanisme moléculaire par lequel le NO exerce ses effets anti-mitogéniques et anti-hypertrophiques dans la signalisation induite par l’ET-1. En testant l'effet de deux différents donneurs de NO (S-nitroso-N-acetylpenicillamine (SNAP), sodium nitroprusside (SNP)) et un inhibiteur de NO synthase, le N (G)-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) dans la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de Pyk2 induite par l’ET-1, nous avons observé que le NO a un effet inhibiteur sur la signalisation induite par l’ET-1 dans les VSMCs. Par ailleurs, le 8-Br-GMPc, un analogue du GMPc, a un effet similaire à celui des deux donneurs du NO, tandis que l’oxadiazole quinoxaline (ODQ), un inhibiteur de la guanylate cyclase soluble, inverse l'effet inhibiteur du NO. Nous concluons que le NO diminue la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de Pyk2 induite par l’ET-1 d’une manière dépendante du GMPc. Le NO inhibe aussi les effets hypertrophiques de l’ET-1 puisque le traitement avec le SNAP diminue la synthèse des protéines induite par l’ET-1. En résumé, les études présentées dans cette thèse démontrent que l’ET-1 et le H2O2 sont des activateurs de la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de Pyk2 dans les VSMCs et que la CaMKII s’avère nécessaire pour ce processus, en agissant en amont de l’activation de IGF-1R induite par le H2O2 dans les VSMCs. Elles montrent également que le NO inhibe la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de Pyk2 induite par l’ET-1. Enfin, nos travaux suggèrent aussi que l’activation de la CaMKII stimule la synthèse des protéines et de l’ADN induites par l’ET-1 alors que le NO inhibe la synthèse des protéines induite par ET-1. Mots clés: Endothéline ; Peroxyde d'hydrogène ; CaMKII ; Monoxyde d’azote ; Système vasculaire ; PKB; ERK1/2; IGF-1R; Hypertrophie.

Effets de plantes réputées antidiabétiques sur un modèle cellulaire hépatique de résistance à l’insuline induite par le palmitate

La pharmacopée Cris est riche en plantes médicinales et plusieurs d’entre elles sont étudiées par notre laboratoire pour leur potentiel antidiabétique. Certaines espèces ont démontré leur capacité à stimuler la protéine kinase activée par l’AMP (AMPK), une enzyme qui favorise la translocation de transporteurs de glucose à la membrane (effet hypoglycémiant). L’AMPK stimule également d’autres fonctions, telle l’oxydation des graisses, dans le but de rétablir l’énergie cellulaire. Ce projet a comme objectifs d’évaluer, premièrement, le stress métabolique induit par huit des extraits dans des cellules musculaires et des hépatocytes, effet qui serait responsable de l’activation de l’AMPK. Ce stress peut être déterminé en mesurant l’acidification du milieu extracellulaire ainsi que la déplétion du contenu en ATP des cellules suite aux traitements. Le deuxième objectif est de mesurer l’efficacité des extraits à réduire le contenu en gras (oxydation des graisses) et à ainsi normaliser la résistance à l’insuline dans des hépatocytes rendus insulino-résistants. Les hépatocytes sont rendus résistants à l’insuline (condition fortement lié à l’obésité) via traitement avec un acide gras saturé, le palmitate. Les résultats montrent que la majorité des extraits semble induire un stress métabolique de courte durée dans les cellules. Parmi les extraits, seul un a réussi à faire diminuer significativement le taux de triglycérides intracellulaire suite au traitement au palmitate sans toutefois améliorer la sensibilité à l’insuline. En conclusion, le potentiel hypoglycémiant des extraits serait du à leur capacité à affecter la respiration mitochondriale (stress métabolique). Toutefois, leur capacité à améliorer la sensibilité à l’insuline n’a pu être établie.

Influence de l'initiation de la traduction sur le changement programmé du cadre de lecture en -1 responsable de la synthèse des enzymes du virus de l’immunodéficience humaine de type 1

Le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) est responsable du syndrome de l’immunodéficience acquise (SIDA). Il faut identifier de nouvelles cibles pour le développement d’agents anti-VIH-1, car ce virus développe une résistance aux agents présentement utilisés. Notre but est d’approfondir la caractérisation de l’étape du changement de cadre de lecture ribosomique en -1 (déphasage -1) nécessaire à la production du précurseur des enzymes du VIH-1. Ce déphasage est programmé et effectué par une minorité de ribosomes lorsqu’ils traduisent la séquence dite glissante à un endroit spécifique de l’ARN messager (ARNm) pleine-longueur du VIH-1. L’efficacité de déphasage est contrôlée par le signal stimulateur de déphasage (SSF), une tige-boucle irrégulière située en aval de la séquence glissante. La structure du SSF est déroulée lors du passage d’un ribosome, mais elle peut se reformer ensuite. Nous avons montré que des variations de l’initiation de la traduction affectent l’efficacité de déphasage. Nous avons utilisé, dans des cellules Jurkat-T et HEK 293T, un rapporteur bicistronique où les gènes codant pour les luciférases de la Renilla (Rluc) et de la luciole (Fluc) sont séparés par la région de déphasage du VIH-1. La Rluc est produite par tous les ribosomes traduisant l’ARNm rapporteur alors que la Fluc est produite uniquement par les ribosomes effectuant un déphasage. L’initiation de ce rapporteur est coiffe-dépendante, comme pour la majorité des ARNm cellulaires. Nous avons examiné l’effet de trois inhibiteurs de l’initiation et montré que leur présence augmente l’efficacité de déphasage. Nous avons ensuite étudié l’effet de la tige-boucle TAR, qui est présente à l’extrémité 5’ de tous les ARNm du VIH-1. TAR empêche la liaison de la petite sous-unité du ribosome (40S) à l’ARNm et module aussi l’activité de la protéine kinase dépendante de l’ARN double-brin (PKR). L’activation de PKR inhibe l’initiation en phosphorylant le facteur d’initiation eucaryote 2 (eIF2) alors que l’inhibition de PKR a l’effet inverse. Nous avons étudié l’effet de TAR sur la traduction et le déphasage via son effet sur PKR en utilisant TAR en trans ou en cis, mais à une certaine distance de l’extrémité 5’ afin d’éviter l’interférence avec la liaison de la 40S. Nous avons observé qu’une faible concentration de TAR, qui active PKR, augmente l’efficacité de déphasage alors qu’une concentration élevée de TAR, qui inhibe PKR, diminue cette efficacité. Nous avons proposé un modèle où des variations de l’initiation affectent l’efficacité de déphasage en modifiant la distance entre les ribosomes parcourant l’ARNm et, donc, la probabilité qu’ils rencontrent un SSF structuré. Par la suite, nous avons déterminé l’effet de la région 5’ non traduite (UTR) de l’ARNm pleine-longueur du VIH-1 sur l’efficacité de déphasage. Cette 5’UTR contient plusieurs régions structurées, dont TAR à l’extrémité 5’, qui peut interférer avec l’initiation. Cet ARNm a une coiffe permettant une initiation coiffe-dépendante ainsi qu’un site d’entrée interne des ribosomes (IRES), permettant une initiation IRES-dépendante. Nous avons introduit cette 5’UTR, complète ou en partie, comme 5’UTR de notre ARNm rapporteur bicistronique. Nos résultats démontrent que cette 5’UTR complète inhibe l’initiation coiffe dépendante et augmente l’efficacité de déphasage et que ces effets sont dus à la présence de TAR suivie de la tige-boucle Poly(A). Nous avons aussi construit un rapporteur tricistronique où les ribosomes exprimant les luciférases utilisent obligatoirement l’IRES. Nous avons observé que cette initiation par l’IRES est faible et que l’efficacité de déphasage correspondante est également faible. Nous avons formulé une hypothèse pour expliquer cette situation. Nous avons également observé que lorsque les deux modes d’initiation sont disponibles, l’initiation coiffe dépendante est prédominante. Finalement, nous avons étudié l’effet de la protéine virale Tat sur l’initiation de la traduction et sur l’efficacité de déphasage. Nous avons montré qu’elle augmente l’initiation de la traduction et que son effet est plus prononcé lorsque TAR est située à l’extrémité 5’ des ARNm. Nous proposons un modèle expliquant les effets de Tat sur l’initiation de la traduction par l’inhibition de PKR ainsi que par des changements de l’expression de protéines cellulaires déroulant TAR. Ces résultats permettent de mieux comprendre les mécanismes régissant le déphasage du VIH-1, ce qui est essentiel pour le développement d’agents anti-déphasage.

Antidiabetic activity of Vaccinium vitis-idaea, a medicinal plant from the traditional pharmacopeia of the James Bay Cree

L’incidence du diabète chez les premières nations du Canada est plus de trois fois celle du reste du pays, dû, en partie, aux traitements culturellement inappropriés. Notre projet vise à traiter le diabète chez ces populations à partir de leur pharmacopée de médicine traditionnelle afin d’améliorer l’acceptation des traitements. En utilisant une approche ethnobotanique, notre équipe a identifié 17 plantes médicinales utilisées pour traiter des symptômes du diabète par les Cris d'Eeyou Istchee (Baie James, Québec). Parmi eux, l'extrait éthanolique de baies de Vaccinium vitis-idaea a montré un effet stimulateur sur le transport du glucose dans les cellules musculaires squelettiques et les adipocytes en culture. Le but de cette thèse était d’élucider les mécanismes par lesquels cet extrait exerce ses effets anti-hyperglycémiants, d’identifier ses principes actifs et de confirmer in vivo, son efficacité. Les résultats démontrent que V.vitis a augmenté le transport du glucose dans les cellules musculaires en cultures, C2C12 et L6 et a stimulé la translocation des transporteurs GLUT4 dans les cellules L6. L'extrait a également inhibé la respiration dans les mitochondries isolées du foie du rat. Cet effet est semblable à celui de la metformine et en lien avec la production du stress métabolique et l'activation de l'AMPK. De plus, la voie de signalisation de l’insuline ne semble pas être impliquée dans le mécanisme d’action de V. vitis. Le fractionnement guidé par la stimulation du transport du glucose a mené à l'isolation des principes actifs; la quercétine, la quercétine-3-O-galactoside, et la quercétine-3-O-glucoside. Comparable à l'extrait brut, ses composés ont stimulé la voie AMPK. Cependant, la quércetine était la seule à inhiber la respiration mitochondriale. Pour valider l'effet de V.vitis in vivo, l'extrait (1% dans l'eau de boisson) a été administré aux souris KKAy pendant 10 jours. La glycémie et le poids corporel ont été significativement réduits par V.vitis. Ces effets ont été associés à une diminution de la prise alimentaire, ce qui suggère que V.vitis diminue l'appétit. L'étude pair-fed a confirmé que les effets de V.vitis sont, majoritairement, dû à la réduction de l’appétit. De plus, V.vitis a augmenté la teneur en GLUT4 dans le muscle squelettique, a stimulé la iv phosphorylation de l'ACC et a augmenté les niveaux de PPAR-α dans le foie des souris KKAy. Ces effets se voient être additifs à l’effet anorexigène de V. vitis. Au cours du fractionnement bioguidé de l’extrait, l’ester méthylique de l'acide caféique (CAME), un produit formé lors de la procédure du fractionnement, a démontré un effet stimulateur puissant sur le transport du glucose dans les celules C2C12 et donc un potentiel anti-diabétique. Pour identifier d'autres acides caféique active (AC) et pour élucider leurs relations structure-activité et structure-toxicité, vingt dérivés AC ont été testés. Outre CAME, quatre composés ont stimulé le transport du glucose et ont activé l'AMPK suite au stress métabolique résultant d'un découplage de la phosphorylation oxydative mitochondriale. L’activité nécessite une fonction d’AC intacte dépourvu de groupements fortement ionisés et ceci était bien corrélée avec la lipophilicite et la toxicité. Les résultats de cette thèse soutiennent le potentiel thérapeutique de V. vitis, ses composés actifs ainsi que de la famille de l’AC et pour la prévention et le traitement du diabète.

Étude dans la cellule bêta pancréatique de voies inhibitrices de la sécrétion d'insuline liées au métabolisme des lipides

Le diabète de type 2 (DT2) est une maladie métabolique complexe causée par des facteurs génétiques mais aussi environnementaux, tels la sédentarité et le surpoids. La dysfonction de la cellule β pancréatique est maintenant reconnue comme l’élément déterminant dans le développement du DT2. Notre laboratoire s’intéresse à la sécrétion d’insuline par la cellule β en réponse aux nutriments calorigéniques et aux mécanismes qui la contrôle. Alors que la connaissance des mécanismes responsables de l’induction de la sécrétion d’insuline en réponse aux glucose et acides gras est assez avancée, les procédés d’inhibition de la sécrétion dans des contextes normaux ou pathologiques sont moins bien compris. L’objectif de la présente thèse était d’identifier quelques-uns de ces mécanismes de régulation négative de la sécrétion d’insuline dans la cellule β pancréatique, et ce en situation normale ou pathologique en lien avec le DT2. La première hypothèse testée était que l’enzyme mitochondriale hydroxyacyl-CoA déshydrogénase spécifique pour les molécules à chaîne courte (short-chain hydroxyacyl-CoA dehydrogenase, SCHAD) régule la sécrétion d’insuline induite par le glucose (SIIG) par la modulation des concentrations d’acides gras ou leur dérivés tels les acyl-CoA ou acyl-carnitine dans la cellule β. Pour ce faire, nous avons utilisé la technologie des ARN interférants (ARNi) afin de diminuer l’expression de SCHAD dans la lignée cellulaire β pancréatique INS832/13. Nous avons par la suite vérifié chez la souris DIO (diet-induced obesity) si une exposition prolongée à une diète riche en gras activerait certaines voies métaboliques et signalétiques assurant une régulation négative de la sécrétion d’insuline et contribuerait au développement du DT2. Pour ce faire, nous avons mesuré la SIIG, le métabolisme intracellulaire des lipides, la fonction mitochondriale et l’activation de certaines voies signalétiques dans les îlots de Langerhans isolés des souris normales (ND, normal diet) ou nourries à la dière riche en gras (DIO) Nos résultats suggèrent que l’enzyme SCHAD est importante dans l’atténuation de la sécrétion d’insuline induite par le glucose et les acides aminés. En effet, l’oxydation des acides gras par la protéine SCHAD préviendrait l’accumulation d’acyl-CoA ou de leurs dérivés carnitine à chaîne courtes potentialisatrices de la sécrétion d’insuline. De plus, SCHAD régule le métabolisme du glutamate par l’inhibition allostérique de l’enzyme glutamate déshydrogénase (GDH), prévenant ainsi une hyperinsulinémie causée par une sur-activité de GDH. L’étude de la dysfonction de la cellule β dans le modèle de souris DIO a démontré qu’il existe une grande hétérogénéité dans l’obésité et l’hyperglycémie développées suite à la diète riche en gras. L’orginialité de notre étude réside dans la stratification des souris DIO en deux groupes : les faibles et forts répondants à la diète (low diet responders (LDR) et high diet responder (HDR)) sur la base de leur gain de poids corporel. Nous avons mis en lumières divers mécanismes liés au métabolisme des acides gras impliqués dans la diminution de la SIIG. Une diminution du flux à travers le cycle TG/FFA accompagnée d’une augmentation de l’oxydation des acides gras et d’une accumulation intracellulaire de cholestérol contribuent à la diminution de la SIIG chez les souris DIO-HDR. De plus, l’altération de la signalisation par les voies AMPK (AMP-activated protein kinase) et PKC epsilon (protéine kinase C epsilon) pourrait expliquer certaines de ces modifications du métabolisme des îlots DIO et causer le défaut de sécrétion d’insuline. En résumé, nous avons mis en lumière des mécanismes importants pour la régulation négative de la sécrétion d’insuline dans la cellule β pancréatique saine ou en situation pathologique. Ces mécanismes pourraient permettre d’une part de limiter l’amplitude ou la durée de la sécrétion d’insuline suite à un repas chez la cellule saine, et d’autre part de préserver la fonction de la cellule β en retardant l’épuisement de celle-ci en situation pathologique. Certaines de ces voies peuvent expliquer l’altération de la sécrétion d’insuline dans le cadre du DT2 lié à l’obésité. À la lumière de nos recherches, le développement de thérapies ayant pour cible les mécanismes de régulation négative de la sécrétion d’insuline pourrait être bénéfique pour le traitement de patients diabétiques.

Protective signaling of oxytocin in an in vitro model of myocardial ischemia - reperfusion

Introduction : La prévention de la mort de cellules cardiaques contractiles suite à un épisode d'infarctus du myocarde représente le plus grand défi dans la récupération de la fonction cardiaque. On a démontré à maintes reprises que l'ocytocine (OT), l'hormone bien connue pour ses rôles dans le comportement social et reproductif et couramment utilisée dans l’induction de l’accouchement, diminue la taille de l'infarctus et améliore la récupération fonctionnelle du myocarde blessé. Les mécanismes de cette protection ne sont pas totalement compris. Objectif : Étudier les effets d'un traitement avec de l'ocytocine sur des cardiomyocytes isolés en utilisant un modèle in vitro qui simule les conditions d'un infarctus du myocarde. Méthodes : La lignée cellulaire myoblastique H9c2 a été utilisée comme modèle de cardiomyocyte. Pour simuler le dommage d'ischémie-reperfusion (IR), les cellules ont été placées dans un tampon ischémique et incubées dans une chambre anoxique pendant 2 heures. La reperfusion a été accomplie par la restauration du milieu de culture régulier dans des conditions normales d'oxygène. L'OT a été administrée en présence ou en absence d'inhibiteurs de kinases connues pour être impliquées dans la cardioprotection. La mortalité cellulaire a été évaluée par TUNEL et l'activité mitochondriale par la production de formazan pendant 1 à 4 heures de reperfusion. La microscopie confocale a servie pour localiser les structures cellulaires. Résultats : Le modèle expérimental de l'IR dans les cellules H9c2 a été caractérisé par une diminution dans la production de formazan (aux alentours de 50 à 70 % du groupe témoin, p < 0.001) et par l'augmentation du nombre de noyaux TUNEL-positif (11.7 ± 4.5% contre 1.3 ± 0.7% pour le contrôle). L'addition de l'OT (10-7 a 10-9 M) au commencement de la reperfusion a inversé les effets de l'IR jusqu'aux niveaux du contrôle (p < 0.001). L'effet protecteur de l'OT a été abrogé par : i) un antagoniste de l'OT ; ii) le knockdown de l'expression du récepteur à l'OT induit par le siRNA ; iii) la wortmannin, l'inhibiteur de phosphatidylinositol 3-kinases ; iv) KT5823, l'inhibiteur de la protéine kinase dépendante du cGMP (PKG); v) l'ODQ, un inhibiteur du guanylate cyclase (GC) soluble, et A71915, un antagoniste du GC membranaire. L'analyse confocale des cellules traitées avec OT a révélé la translocation du récepteur à l'OT et la forme phosphorylée de l'Akt (Thr 308, p-Akt) dans le noyau et dans les mitochondries. Conclusions : L'OT protège directement la viabilité des cardiomyocytes, lorsqu'elle est administrée au début de la reperfusion, par le déclenchement de la signalisation du PI3K, la phosphorylation de l'Akt et son trafic cellulaire. La cytoprotection médiée par l'OT implique la production de cGMP par les deux formes de GC.

Effet de la mutation du gène lrpprc sur l'activité de l'AMPK dans les fibroblastes des patients atteints du syndrome de Leigh, type canadien français

Le syndrome de Leigh, type canadien français (LSFC) est une maladie infantile orpheline causée par une mutation du gène lrpprc. Elle se caractérise par une déficience tissu spécifique de cytochrome c oxydase (COX), une dysfonction mitochondriale et la survenue de crises d’acidose lactique fatales dans plus de 80% de cas. Selon les familles des patients, ces crises apparaissent lors d’une demande excessive d’énergie. Malheureusement, les mécanismes sous-jacents à l’apparition des crises et notamment la physiopathologie du LSFC demeurent inconnus. Afin de mieux comprendre les mécanismes de régulation du métabolisme énergétique chez les patients LSFC, nous avons examiné la régulation de la protéine kinase activée par l’AMP (AMPK), une enzyme clé de l'homéostasie énergétique, de même que certaines de ses voies cibles (SIRT1/PGC1α et Akt/mTOR) dans les fibroblastes de patients LSFC et de témoins en conditions basales et conditions de stress. En conditions basales, l’activité de l’AMPK était similaire dans les cellules LSFC et les témoins. Par contre, les cellules LSFC montraient une surexpression significative des voies Akt/mTOR et SIRT1/PGC1α comparativement aux cellules témoins. Nous avons aussi examiné ces voies de signalisation suite à une incubation de 4h avec 10 mM de lactate et 1 mM de palmitate (LP), nous permettant de mimer les conditions de « crise ». Nos résultats ont démontré que le LP augmentait les niveaux de phosphorylation de l’AMPK de 90% (p<0,01) dans les cellules témoins mais pas dans les cellules LSFC. Pourtant, l’AMPK est activée dans les cellules LSFC en réponse à une hypoxie chimique induite par le 2,4 dinitrophénol. Dans les cellules témoins, le LP augmentait aussi les niveaux d’expression de SIRT1 (57%, p<0,05), de LRPPRC (23%, p=0,045) et de COXIV (19%, p<0,05). Un prétraitement de 48h au ZMP, un activateur pharmacologique de l’AMPK, a eu un effet additif avec le LP et des augmentations de SIRT1 phosphorylée (120%, p<0,05), de SIRT1 total (75%, p<0,01), de LRPPRC (63%, p<0,001) et de COXIV (38%, p<0,001) ont été observées. Tous ces effets étaient aussi abolis dans les cellules LSFC. En conclusion, nos résultats ont démontré des altérations importantes de la régulation du métabolisme énergétique dans les fibroblastes de patients LSFC.

Intestin et défauts métaboliques dans la résistance à l'insuline

En lien avec l’augmentation constante de l’obésité, de plus en plus de personnes sont atteintes de résistance à l’insuline ou de diabète de type 2. Ce projet doctoral s’est surtout intéressé à l’une des conséquences majeures des pathologies cardiométaboliques, soit la dyslipidémie diabétique. À cet égard, les gens présentant une résistance à l’insuline ou un diabète de type 2 sont plus à risque de développer des perturbations lipidiques caractérisées essentiellement par des taux élevés de triglycérides et de LDL-cholestérol ainsi que de concentrations restreintes en HDL-cholestérol dans la circulation. Les risques de maladies cardiovasculaires sont ainsi plus élevés chez ces patients. Classiquement, trois organes sont connus pour développer l’insulino-résistance : le muscle, le tissu adipeux et le foie. Néanmoins, certaines évidences scientifiques commencent également à pointer du doigt l’intestin, un organe critique dans la régulation du métabolisme des lipides postprandiaux, et qui pourrait, conséquemment, avoir un impact important dans l’apparition de la dyslipidémie diabétique. De façon très intéressante, des peptides produits par l’intestin, notamment le GLP-1 (glucagon-like peptide-1), ont déjà démontré leur potentiel thérapeutique quant à l’amélioration du statut diabétique et leur rôle dans le métabolisme intestinal lipoprotéinique. Une autre évidence est apportée par la chirurgie bariatrique qui a un effet positif, durable et radical sur la perte pondérale, le contrôle métabolique et la réduction des comorbidités du diabète de type 2, suite à la dérivation bilio-intestinale. Les objectifs centraux du présent programme scientifique consistent donc à déterminer le rôle de l’intestin dans (i) l’homéostasie lipidique/lipoprotéinique en réponse à des concentrations élevées de glucose (à l’instar du diabète) et à des peptides gastro-intestinaux tels que le PYY (peptide YY); (ii) la coordination du métabolisme en disposant de l’AMPK (AMP-activated protein kinase) comme senseur incontournable permettant l’ajustement précis des besoins et disponibilités énergétiques cellulaires; et (iii) l’ajustement de sa capacité d’absorption des graisses alimentaires en fonction du gain ou de la perte de sa sensibilité à l’insuline démontrée dans les spécimens intestinaux humains prélevés durant la chirurgie bariatrique. Dans le but de confirmer le rôle de l’intestin dans la dyslipidémie diabétique, nous avons tout d’abord utilisé le modèle cellulaire intestinal Caco-2/15. Ces cellules ont permis de démontrer qu’en présence de hautes concentrations de glucose en basolatéral, telle qu’en condition diabétique, l’intestin absorbe davantage de cholestérol provenant de la lumière intestinale par l’intermédiaire du transporteur NPC1L1 (Niemann Pick C1-like 1). L’utilisation de l’ezetimibe, un inhibiteur du NPC1L1, a permis de contrecarrer cette augmentation de l’expression de NPC1L1 tout comme l’élévation de l’absorption du cholestérol, prouvant ainsi que le NPC1L1 est bel et bien responsable de cet effet. D’autre part, des travaux antérieurs avaient identifié certains indices quant à un rôle potentiel du peptide intestinal PYY au niveau du métabolisme des lipides intestinaux. Toutefois, aucune étude n’avait encore traité cet aspect systématiquement. Pour établir définitivement l’aptitude du PYY à moduler le transport et le métabolisme lipidique dans l’intestin, nous avons utilisé les cellules Caco-2/15. Notre étude a permis de constater que le PYY incubé du côté apical est capable de réduire significativement l’absorption du cholestérol et le transporteur NPC1L1. Puisque le rôle de l'AMPK dans l'intestin demeure inexploré, il est important non seulement de définir sa structure moléculaire, sa régulation et sa fonction dans le métabolisme des lipides, mais aussi d'examiner l'impact de l’insulino-résistance et du diabète de type 2 (DT2) sur son statut et son mode d’action gastro-intestinal. En employant les cellules Caco-2/15, nous avons été capables de montrer (i) la présence de toutes les sous-unités AMPK (α1/α2/β1/β2/γ1/γ2/γ3) avec une différence marquée dans leur abondance et une prédominance de l’AMPKα1 et la prévalence de l’hétérotrimère α1/β2/γ1; (ii) l’activation de l’AMPK par la metformine et l’AICAR, résultant ainsi en une phosphorylation accrue de l’enzyme acétylCoA carboxylase (ACC) et sans influence sur l'HMG-CoA réductase; (iii) la modulation négative de l’AMPK par le composé C et des concentrations de glucose élevées avec des répercussions sur la phosphorylation de l’ACC. D’autre part, l’administration de metformine au Psammomys obesus, un modèle animal de diabète et de syndrome métabolique, a conduit à (i) une régulation positive de l’AMPK intestinale (phosphorylation de l’AMPKα-Thr172); (ii) la réduction de l'activité ACC; (iii) l’augmentation de l’expression génique et protéique de CPT1, supportant une stimulation de la β-oxydation; (iv) une tendance à la hausse de la sensibilité à l'insuline représentée par l’induction de la phosphorylation d'Akt et l’inactivation de la phosphorylation de p38; et (v) l’abaissement de la formation des chylomicrons ce qui conduit à la diminution de la dyslipidémie diabétique. Ces données suggèrent que l'AMPK remplit des fonctions clés dans les processus métaboliques de l'intestin grêle. La preuve flagrante de l’implication de l’intestin dans les événements cardiométaboliques a été obtenue par l’examen des spécimens intestinaux obtenus de sujets obèses, suite à une chirurgie bariatrique. L’exploration intestinale nous a permis de constater chez ceux avec un indice HOMA élevé (marqueur d’insulinorésistance) (i) des défauts de signalisation de l'insuline comme en témoigne la phosphorylation réduite d'Akt et la phosphorylation élevée de p38 MAPK; (ii) la présence du stress oxydatif et de marqueurs de l'inflammation; (iii) la stimulation de la lipogenèse et de la production des lipoprotéines riches en triglycérides avec l’implication des protéines clés FABP, MTP et apo B-48. En conclusion, l'intestin grêle peut être classé comme un tissu insulino-sensible et répondant à plusieurs stimuli nutritionnels et hormonaux. Son dérèglement peut être déclenché par le stress oxydatif et l'inflammation, ce qui conduit à l'amplification de la lipogenèse et la synthèse des lipoprotéines, contribuant ainsi à la dyslipidémie athérogène chez les patients atteints du syndrome métabolique et de diabète de type 2.

Untersuchungen zur Rolle von Isoformen katalytischer Untereinheiten der PKA

ZUSAMMENFASSUNG: Proteinkinasen übernehmen zentrale Aufgaben in der Signaltransduktion höherer Zellen. Dabei ist die cAMP-abhängige Proteinkinase (PKA) bezüglich ihrer Struktur und Funktion eine der am besten charakterisierten Proteinkinasen. Trotzdem ist wenig über direkte Interaktionspartner der katalytischen Untereinheiten (PKA-C) bekannt. In einem Split-Ubiquitin basiertem Yeast Two Hybrid- (Y2H-)System wurden potenzielle Interaktionspartner der PKA-C identifiziert. Als Bait wurden sowohl die humane Hauptisoform Cα (hCα) als auch die Proteinkinase X (PrKX) eingesetzt. Nach der Bestätigung der Funktionalität der PKA-C-Baitproteine, dem Nachweis der Expression und der Interaktion mit dem bekannten Interaktionspartner PKI wurde ein Y2H-Screen gegen eine Mausembryo-cDNA-Expressionsbibliothek durchgeführt. Von 2*10^6 Klonen wurden 76 Kolonien isoliert, die ein mit PrKX interagierendes Preyprotein exprimierten. Über die Sequenzierung der enthaltenen Prey-Vektoren wurden 25 unterschiedliche, potenzielle Interaktionspartner identifiziert. Für hCα wurden über 2*10^6 S. cerevisiae-Kolonien untersucht, von denen 1.959 positiv waren (1.663 unter erhöhter Stringenz). Über die Sequenzierung von ca. 10% der Klone (168) konnten Sequenzen für 67 verschiedene, potenzielle Interaktionspartner der hCα identifiziert werden. 15 der Preyproteine wurden in beiden Screens identifiziert. Die PKA-C-spezifische Wechselwirkung der insgesamt 77 Preyproteine wurde im Bait Dependency Test gegen largeT, ein Protein ohne Bezug zum PKA-System, untersucht. Aus den PKA-C-spezifischen Bindern wurden die löslichen Preyproteine AMY-1, Bax72-192, Fabp3, Gng11, MiF, Nm23-M1, Nm23-M2, Sssca1 und VASP256-375 für die weitere in vitro-Validierung ausgewählt. Die Interaktion von FLAG-Strep-Strep-hCα (FSS-hCα) mit den über Strep-Tactin aus der rekombinanten Expression in E. coli gereinigten One-STrEP-HA-Proteinen (SSHA-Proteine) wurde über Koimmunpräzipitation für SSHA-Fabp3, -Nm23-M1, -Nm23-M2, -Sssca1 und -VASP256-375 bestätigt. In SPR-Untersuchungen, für die hCα kovalent an die Oberfläche eines CM5-Sensorchips gekoppelt wurde, wurden die ATP/Mg2+-Abhängigkeit der Bindungen sowie differentielle Effekte der ATP-kompetitiven Inhibitoren H89 und HA-1077 untersucht. Freie hCα, die vor der Injektion zu den SSHA-Proteinen gegeben wurde, kompetierte im Gegensatz zu FSS-PrKX die Bindung an die hCα-Oberfläche. Erste kinetische Analysen lieferten Gleichgewichtsdissoziationskonstanten im µM- (SSHA-Fabp3, -Sssca1), nM- (SSHA-Nm23-M1, –M2) bzw. pM- (SSHA-VASP256-375) Bereich. In funktionellen Analysen konnte eine Phosphorylierung von SSHA-Sssca1 und VASP256-375 durch hCα und FSS-PrKX im Autoradiogramm nachgewiesen werden. SSHA-VASP256-375 zeigte zudem eine starke Inhibition von hCα im Mobility Shift-Assay. Dieser inhibitorische Effekt sowie die hohe Affinität konnten jedoch auf eine Kombination aus der Linkersequenz des Vektors und dem N-Terminus von VASP256-375 zurückgeführt werden. Über die Wechselwirkungen der hier identifizierten Interaktionspartner Fabp3, Nm23-M1 und Nm23-M2 mit hCα können in Folgeuntersuchungen neue PKA-Funktionen insbesondere im Herzen sowie während der Zellmigration aufgedeckt werden. Sssca1 stellt dagegen ein neues, näher zu charakterisierendes PKA-Substrat dar.

Endothelin signalling in the cardiac myocyte and its pathophysiological relevance

Endothelin A (ET(A)) transmembrane receptors predominate in rat cardiac myocytes. These are G protein-coupled receptors whose actions are mediated by the G(q) heterotrimeric G proteins. Through these, ET-1 binding to ET(A)-receptors stimulates the hydrolysis of membrane phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate to diacylglycerol and inositol 1,4,5-trisphosphate. Diacylglycerol remains in the membrane whereas inositol 1,4,5-trisphosphate is soluble (though its importance in the cardiac myocyte is still debated). Isoforms of the phospholipid-dependent protein kinase, protein kinase C (PKC), are intracellular receptors for diacylglycerol. Cytoplasmic nPKCdelta and nPKCepsilon detect increases in membrane diacylglycerols and translocate to the membrane. This brings about PKC activation, though modifications additional to binding to phospholipids and diacylglycerol are involved. The next event (probably associated with PKC activation) is the activation of the membrane-bound small G protein Ras by exchange of GTP for GDP. Ras.GTP loading translocates Raf family mitogen-activated protein kinase (MAPK) kinase kinases to the membrane, initiates the activation of Raf, and thus activates the extracellular signal-regulated kinase 1/2 (ERK1/2) cascade. Over longer times, two analogous protein kinase cascades, the c-Jun N-terminal kinase and p38-mitogen-activated protein kinase cascades, become activated. As the signals originating from the ET(A) receptor are transmitted through these protein kinase pathways, other signalling molecules become phosphorylated, thus changing their biological activities. For example, ET-1 increases the expression of the c-jun transcription factor gene, and increases abundance and phosphorylation of c-Jun protein. These changes in c-Jun expression and phosphorylation are likely to be important in the regulation of gene transcription.

Light modulates the melanophore response to alpha-MSH in Xenopus laevis: An analysis of the signal transduction crosstalk mechanisms involved

Melanin granule (melanosome) dispersion within Xenopus laevis melanophores is evoked either by light or alpha-MSH. We have previously demonstrated that the initial biochemical steps of light and alpha-MSH signaling are distinct, since the increase in cAMP observed in response to alpha-MSH was not seen after light exposure. cAMP concentrations in response to alpha-MSH were significantly lower in cells pre-exposed to light as compared to the levels in dark-adapted melanophores. Here we demonstrate the presence of an adenylyl cyclase (AC) in the Xenopus melanophore, similar to the mammalian type IX which is inhibited by Ca(2+)-calmodulin-activated phosphatase. This finding supports the hypothesis that the cyclase could be negatively modulated by a light-promoted Ca(2+) increase. In fact, the activity of calcineurin PP2B phosphatase was increased by light, which could result in AC IX inhibition, thus decreasing the response to alpha-MSH. St-Ht31, a disrupting agent of protein kinase A (PKA)-anchoring kinase A protein (AKAP) complex totally blocked the melanosome dispersing response to alpha-MSH, but did not impair the photo-response in Xenopus melanophores. Sequence comparison of a melanophore AKAP partial clone with GenBank sequences showed that the anchoring protein was a gravin-like adaptor previously sequenced from Xenopus non-pigmentary tissues. Co-immunoprecipitation of Xenopus AKAP and the catalytic subunit of PKA demonstrated that PKA is associated with AKAP and it is released in the presence of alpha-MSH. We conclude that in X laevis melanophores, AKAP12 (gravin-like) contains a site for binding the inactive PKA thus compartmentalizing PKA signaling and also possesses binding sites for PKC. Light diminishes alpha-MSH-induced increase of cAMP by increasing calcineurin (PP2B) activity, which in turn inhibits adenylyl cyclase type IX, and/or by activating PKC, which phosphorylates the gravin-like molecule, thus destabilizing its binding to the cell membrane. (C) 2009 Elsevier Inc. All rights reserved.

Hypothalamic Actions of Tumor Necrosis Factor alpha Provide the Thermogenic Core for the Wastage Syndrome in Cachexia

TNF alpha is an important mediator of catabolism in cachexia. Most of its effects have been characterized in peripheral tissues, such as skeletal muscle and fat. However, by acting directly in the hypothalamus, TNF alpha can activate thermogenesis and modulate food intake. Here we show that high concentration TNF alpha in the hypothalamus leads to increased O(2) consumption/CO(2) production, increased body temperature, and reduced caloric intake, resulting in loss of body mass. Most of the thermogenic response is produced by beta 3-adrenergic signaling to the brown adipose tissue (BAT), leading to increased BAT relative mass, reduction in BAT lipid quantity, and increased BAT mitochondria density. The expression of proteins involved in BAT thermogenesis, such as beta 3-adrenergic receptor, peroxisomal proliferator-activated receptor-gamma coactivator-1 alpha, and uncoupling protein-1, are increased. In the hypothalamus, TNF alpha produces reductions in neuropeptide Y, agouti gene-related peptide, proopiomelanocortin, and melanin-concentrating hormone, and increases CRH and TRH. The activity of the AMP-activated protein kinase signaling pathway is also decreased in the hypothalamus of TNF alpha-treated rats. Upon intracerebroventricular infliximab treatment, tumor-bearing and septic rats present a significantly increased survival. In addition, the systemic inhibition of beta 3-adrenergic signaling results in a reduced body mass loss and increased survival in septic rats. These data suggest hypothalamic TNF alpha action to be important mediator of the wastage syndrome in cachexia. (Endocrinology 151: 683-694, 2010)

Putative antinociceptive action of nitric oxide in the caudal part of the spinal trigeminal nucleus during chronic carrageenan-induced arthritis in the rat temporomandibular joint

In order to investigate a putative role for nitric oxide (NO) in the central nociceptive processing following carrageenan-induced arthritis in the rat temporomandibular joint (TMJ), we analyzed the immunoreactivity, gene expression and activity of nitric oxide synthases (NOS) in the caudal part of the spinal trigeminal nucleus (Sp5C) during the acute (24 h), chronic (15 days) and chronic-active (14 days-24 h) arthritis. In addition, evaluation of head-withdrawal threshold was carried out in all phases of arthritis under chronic inhibition of nNOS with the selective inhibitor 7-nitroindazole (7-NI). Neurons with nNOS-like immunoreactivity (nNOS-LI) were concentrated mainly in the lamina II of the Sp5C, showing no significant statistical difference during arthritis. Only a discrete percentage of nNOS-LI neurons expressed Fos immunoreactivity. The mRNA expression for both nNOS and endothelial nitric oxide synthases (eNOS) presented no noticeable differences among the groups. No expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) was detected in the Sp5C by either immunohistochemistry or reverse-transcription polymerase chain reaction (RTPCR). Ca(2+)-dependent NOS activity in the ipsilateral Sp5C was significantly higher (108.3 +/- 49.2%; P<0.01) in animals during the chronic arthritis. Interestingly, this increased activity was completely abolished 24 h later, in the chronic-active arthritis. Finally, head-withdrawal threshold decreased significantly in the chronic arthritis in animals under 7-NI chronic inhibition. In conclusion, nNOS immunoreactivity and mRNA expression are stable in the Sp5C during TMJ arthritis evolution, but its activity significantly increases in the chronic-phases supporting an antinociceptive role of the nNOS as evidenced by pain threshold experiment. (C) 2009 Elsevier B.V. All rights reserved.

Global Gene Expression Analysis during Germination in the Chytridiomycete Blastocladiella emersonii

Blastocladiella emersonii is an aquatic fungus of the Chytridiomycete class. During germination, the zoospore, a motile nongrowing cell, goes through a cascade of morphological changes that culminates with its differentiation into the germling cell, capable of coenocytic vegetative growth. Transcriptome analyses of B. emersonii cells were carried out during germination induced under various environmental conditions. Microarray data analyzing 3,563 distinct B. emersonii genes revealed that 26% of them are differentially expressed during germination in nutrient medium at at least one of the time points investigated. Over 500 genes are upregulated during the time course of germination under those conditions, most being related to cell growth, including genes involved in protein biosynthesis, DNA transcription, energetic metabolism, carbohydrate and oligopeptide transport, and cell cycle control. On the other hand, several transcripts stored in the zoospores are downregulated during germination in nutrient medium, such as genes involved in signal transduction, amino acid transport, and chromosome organization. In addition, germination induced in the presence of nutrients was compared with that triggered either by adenine or potassium ions in inorganic salt solution. Several genes involved in cell growth, induced during germination in nutrient medium, do not show increased expression when B. emersonii zoospores germinate in inorganic solution, suggesting that nutrients exert a positive effect on gene transcription. The transcriptome data also revealed that most genes involved in cell signaling show the same expression pattern irrespective of the initial germination stimulus.