Monoacylglycerol as a metabolic coupling factor in glucose-stimulated insulin secretion

Les cellules beta pancréatiques sécrètent l’insuline lors d’une augmentation post-prandiale du glucose dans le sang. Ce processus essentiel est contrôlé par des facteurs physiologiques, nutritionnels et pathologiques. D’autres sources d’énergie, comme les acides aminés (leucine et glutamine) ou les acides gras potentialisent la sécrétion d’insuline. Une sécrétion d’insuline insuffisante au besoin du corps déclanche le diabète. Le rôle que joue l’augmentation du calcium intracellulaire et les canaux K+/ATP dans la sécrétion d’insuline est bien connu. Bien que le mécanisme exact de la potentialisation de la sécrétion d’insuline par les lipides est inconnu, le cycle Glycérolipides/Acides gras (GL/FFA) et son segment lipolytique ont été reconnu comme un composant essentiel de la potentialisation lipidique de la sécrétion d’insuline. Le diacylglycérol, provenant de la lipolyse, a été proposé comme un signal lipidique important d’amplification. Cependant, l’hydrolyse des triglycérides et des diacylglycérides a été démontrée essentielle pour la sécrétion d’insuline stimulée par le glucose, en suggérant un rôle du monoacylglycérol (MAG) dans ce processus. Dans cette étude, on démontre que la réduction de la sécrétion d’insuline stimulée par le glucose, lors d’une inhibition de la lipolyse, est restaurée par l’addition de MAG. Dans les cellules beta pancréatiques, le niveau de MAG augmente en présence des concentrations élevées du glucose, et également lorsqu’on inhibe l’enzyme MAG hydrolase abhydrolase-6 (ABHD6) avec l’inhibiteur spécifique WWL70. L’analyse lipidomique a démontré qu’après la stimulation des cellules beta pancréatiques avec le glucose et aussi avec le WWL70, l’espèce la plus accumulée de MAG était le 1-stearoylglycérol (1-SG). L’addition de 1-SG, de 1-palmitoylglycérol (1-PG) ou de WWL70 augmente la sécrétion d’insuline stimulée par le glucose, et cette augmentation est indépendante de la génération de acides gras à partir de MAG. Cela suggère que le MAG est un signal lipidique pour la potentialisation de la sécrétion d’insuline stimulée par le glucose. De plus, la surexpression du gène d’ABHD6 dans les cellules INS832/13 cause une réduction de la sécrétion d’insuline, due probablement à la diminution des niveaux intracellulaire de MAG. Avec le but de comprendre le mécanisme moléculaire impliqué dans la potentialisation de la sécrétion d’insuline par le MAG, on a bloqué l’action du récepteur vanilloid-1 (TRPV1) liant le MAG par l’agent pharmacologiste, AMG9810. Le traitement des cellules beta pancréatique par AMG9810 entraîne une diminution de la potentialisation de la sécrétion de l’insuline induite par le MAG. Il est a noter que le MAG pourrait activer TRPV1 par une liaison physique dans la membrane cellulaire interne; ce qui entraînerai l’entrée du calcium dans la cellule, et ensuite la stimulation de l’exocytose des granules à insuline. En soutien de cette hypothèse, on a trouvé une diminution du calcium intracellulaire lorsqu’on traite au AMG9810 des cellules beta pancréatique de rat (provenant des îlots dispersés) stimulées au glucose et au WWL70. L’ensemble des résultats suggère que le MAG est un médiateur de la potentialisation lipidique de la sécrétion d’insuline stimulée par le glucose. Vu que l’inhibition pharmacologique d’ABHD6 augmente la sécrétion d’insuline, on pourra conclure que cette enzyme représente une cible thérapeutique potentielle dans le développement des médicaments anti-diabétiques, visant une augmentation de la sécrétion d’insuline.

Détermination des domaines du facteur de transcription GATA4 impliqués dans l'hypertrophie et la survie des cardiomyocytes

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Impact d'une alimentation riche en phytoestrogènes sur l'expression génique cardiaque

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Caractérisation fonctionnelle des variants génétiques de la région régulatrice (rSNP) des gènes du point de contrôle G1/S

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

MMP-9/CD44 : un nouveau complexe ligand/récepteur impliqué dans la régulation de la fonction des cellules musculaires lisses bronchiques humaines

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Caractérisation du facteur hématopoïétique spécifique MNDA (Myeloid Nuclear Differentiation Antigen)

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Étude de l'activité spontanée dans la moëlle épinière de l'oppossum Monodelphis domestica en développement

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Les propriétés mécaniques du réseau cellulose/xyloglucanes dans la croissance apicale du tube pollinique

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Étude de la biogenèse de l'autotransporteur AIDA-I d'Escherichia coli

Les autotransporteurs monomériques, appartenant au système de sécrétion de type V, correspondent à une famille importante de facteurs de virulence bactériens. Plusieurs fonctions, souvent essentielles pour le développement d’une infection ou pour le maintien et la survie des bactéries dans l’organisme hôte, ont été décrites pour cette famille de protéines. Malgré l’importance de ces protéines, notre connaissance de leur biogenèse et de leur mécanisme d’action demeure relativement limitée. L’autotransporteur AIDA-I, retrouvé chez diverses souches d’Escherichia coli, est un autotransporter multifonctionnel typique impliqué dans l’adhésion et l’invasion cellulaire ainsi que dans la formation de biofilm et d’agrégats bactériens. Les domaines extracellulaires d’autotransporteurs monomériques sont responsables de la fonctionnalité et possèdent pratiquement tous une structure caractéristique d’hélice β. Nous avons mené une étude de mutagenèse aléatoire avec AIDA-I afin de comprendre la base de la multifonctionnalité de cette protéine. Par cette approche, nous avons démontré que les domaines passagers de certains autotransporteurs possèdent une organisation modulaire, ce qui signifie qu’ils sont construits sous la forme de modules fonctionnels. Les domaines passagers d’autotransporteurs peuvent être clivés et relâchés dans le milieu extracellulaire. Toutefois, malgré la diversité des mécanismes de clivage existants, plusieurs protéines, telles qu’AIDA-I, sont clivées par un mécanisme qui demeure inconnu. En effectuant une renaturation in vitro d’AIDA-I, couplée avec une approche de mutagenèse dirigée, nous avons démontré que cette protéine se clive par un mécanisme autocatalytique qui implique deux acides aminés possédant un groupement carboxyle. Ces résultats ont permis la description d’un nouveau mécanisme de clivage pour la famille des autotransporteurs monomériques. Une des particularités d’AIDA-I est sa glycosylation par une heptosyltransférase spécifique nommée Aah. La glycosylation est un concept plutôt récent chez les bactéries et pour l’instant, très peu de protéines ont été décrites comme glycosylées chez E. coli. Nous avons démontré que Aah est le prototype pour une nouvelle famille de glycosyltransférases bactériennes retrouvées chez diverses espèces de protéobactéries. La glycosylation d’AIDA-I est une modification cytoplasmique et post-traductionnelle. De plus, Aah ne reconnaît pas une séquence primaire, mais plutôt un motif structural. Ces observations sont uniques chez les bactéries et permettent d’élargir nos connaissances sur la glycosylation chez les procaryotes. La glycosylation par Aah est essentielle pour la conformation d’AIDA-I et par conséquent pour sa capacité de permettre l’adhésion. Puisque plusieurs homologues d’Aah sont retrouvés à proximité d’autotransporteurs monomériques putatifs, cette famille de glycosyltranférases pourrait être importante, sinon essentielle, pour la biogenèse et/ou la fonction de nombreux autotransporteurs. En conclusion, les résultats présentés dans cette thèse apportent de nouvelles informations et permettent une meilleure compréhension de la biogenèse d’une des plus importantes familles de protéines sécrétées chez les bactéries Gram négatif.

Étude de l'impact de combinaisons d'acides gras et de l'insuline sur la fonctionnalité des cellules musculaires lisses vasculaires

L’athérosclérose est étroitement liée au diabète de type 2. De fortes concentrations plasmatiques en acides gras libres (AGL) et en insuline sont des caractéristiques retrouvées chez les patients souffrant de ces deux pathologies. Les AGL, présents dans notre alimentation, font partie de l’environnement auquel les cellules sont exposées. Leurs effets dépendent de leur nature, les acides gras saturés (AGS) étant néfastes et les acides gras monoinsaturés (AGMI) plus protecteurs. Ils ont donc des effets variés sur les cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) impliquées dans la pathogénèse de l’athérosclérose. Ainsi, l’objectif principal de ce projet de maîtrise était d’évaluer l’impact de deux combinaisons d’AGL sur la viabilité des CMLV, en condition hyperinsulinémique ou non. Les deux combinaisons renfermaient les mêmes AGL mais en proportions différentes, l’une étant plus riche en AGS et l’autre en AGMI. Nos résultats ont montré que les combinaisons d’AGL ont un effet pro-apoptotique principalement dû aux AGS. L’acide oléique présent dans les combinaisons atténue cependant cet effet. Il diminue même plus fortement l’apoptose des CMLV lorsqu’associé à un AGS que lorsqu’utilisé seul. Cet impact est significatif uniquement dans certaines proportions de ces AGL et est plus efficace en présence d’insuline. Ces résultats mettent en lumière la présence d’une compétition entre mécanismes anti- et pro-apoptotiques en fonction des proportions d’AGS versus AGMI et de l’insulinémie chez les CMLV. Ils soulignent également l’importance de la présence des AGMI dans les diètes riches en AGS et pourraient être utiles pour l’élaboration de nouvelles diètes adaptées aux patients athérosclérotiques et diabétiques.

Role of receptor and non-receptor protein tyrosine kinases in vasoactive peptide-induced signaling

L'endothéline-1 (ET-1) et l'angiotensine II (Ang II) jouent un rôle important dans le maintien de la pression artérielle et l'homéostasie vasculaire. Une activité accrue de ces peptides vasoactifs est présumée contribuer au développement de pathologies vasculaires, telles que l'hypertension, l'athérosclérose, l'hypertrophie et la resténose. Ceci est causé par une activation excessive de plusieurs voies de signalisation hypertrophiques et prolifératives, qui incluent des membres de la famille des Mitogen Activated Protein Kinases (MAPK), ainsi que la famille phosphatidylinositol 3-kinase (PI3-K) / protéine kinase B (PKB). Bien que l'activation de ces voies de signalisation soit bien élucidée, les éléments en amont responsables de l'activation des MAPK et de la PKB, induite par l'ET-1 et Ang II, demeurent mal compris. Durant les dernières années, le concept de la transactivation de récepteurs et/ou non-récepteurs protéines tyrosine kinases (PTK) dans le déclenchement des événements de signalisation induits par les peptides vasoactifs a gagné beaucoup de reconnaissance. Nous avons récemment démontré que la PTK Insulin-like Growth Factor type-1 Receptor (IGF-1R) joue un rôle dans la transduction des signaux induits par l‟H2O2, menant à la phosphorylation de la PKB. Étant donné que les peptides vasoactifs génèrent des espèces réactives d'oxygène, telles que l‟H2O2 lors de leur signalisation, nous avons examiné le rôle de d‟IGF-1R dans la phosphorylation de la PKB et les réponses hypertrophiques dans les cellules muscle lisse vasculaires (CMLV) induites par l'ET-1 et Ang II. AG-1024, un inhibiteur spécifique de l'IGF-1R, a atténué la phosphorylation de la PKB induite à la fois par l'ET-1 et Ang II. Le traitement des CMLVs avec l‟ET-1 et Ang II a également induit une phosphorylation des résidus tyrosine dans les sites d'autophosphorylation d'IGF-1R, celle-ci a été bloquée par l‟AG-1024. En outre, l‟ET-1 et l‟Ang II on tous les deux provoqué la phosphorylation de c-Src, une PTK non-récepteur, bloqué par PP-2, inhibiteur spécifique de la famille Src. La PP-2 a également inhibé la phosphorylation de PKB et d‟IGF-1R induite par l‟ET-1 et l‟Ang II. De plus, la synthèse de protéines ainsi que d‟ADN, marqueurs de la prolifération cellulaire et de l'hypertrophie, ont également été atténuée par l‟AG-1024 et le PP-2. Bien que ce travail démontre le rôle de c-Src dans la phosphorylation PKB induite par l'ET-1 et Ang II, son rôle dans l'activation des MAPK induit par l'ET-1 dans les CMLVs reste controversé. Par conséquent, nous avons examiné l'implication de c-Src dans l'activation de ERK 1/2, JNK et p38MAPK, par l'ET-1 et Ang II, ainsi que leur capacité à régulariser l'expression du facteur de transcription Early growth transcription factor-1 « Egr-1 ». ET-1 et Ang II ont induit la phosphorylation de ERK 1/2, JNK et p38 MAPK, et ont amplifié l'expression d'Egr-1 dans les CMLVs. Cette augmentation de la phosphorylation des MAPK a été diminuée par la PP-2, qui a aussi atténué l'expression d'Egr-1 induite par l'ET-1 et l'Ang II. Une preuve supplémentaire du rôle de c-Src dans ce processus a été obtenue en utilisant des fibroblastes embryonnaires de souris déficientes en c-Src (Src -/- MEF). L'expression d'Egr-1, ainsi que l'activation des trois MAPKs par l'ET-1 ont été atténuées dans les cellules Src -/- par rapport au MEF exprimant des taux normaux Src. En résumé, ces données suggèrent que l'IGF-1R et c-Src PTK jouent un rôle essentiel dans la régulation de la phosphorylation de PKB et des MAPK dans l‟expression d'Egr-1, ainsi que dans les réponses hypertrophiques et prolifératives induites par l'ET-1 et Ang II dans les CMLVs.

Identification de facteurs nucléaires modifiant l'activité des cellules souches hématopoïétiques

Les cellules souches hématopoïétiques (CSH) sont rares, mais indispensables pour soutenir la production des cellules matures du sang, un tissu en constant renouvellement. Deux caractéristiques principales les définissent; la propriété d’auto-renouvellement (AR), ou la capacité de préserver leur identité cellulaire suivant une division, et la multipotence, ce potentiel de différentiation leur permettant de générer toutes les lignée hématopoïétiques. De par leurs attributs, les CSH sont utilisée en thérapie cellulaire dans le domaine de la transplantation. Une organisation tissulaire hiérarchique est aussi préservée dans la leucémie, ou cancer du sang, une masse tumorale hétérogène devant être maintenue par une fraction de cellules au potentiel prolifératif illimité, les cellules souches leucémiques (CSL). Les travaux présentés dans ce manuscrit visent à explorer les bases moléculaires de l’AR, encore mal définies. Certains membres de la famille des facteurs de transcription à homéodomaine HOX sont impliqués dans la régulation de l’hématopoïèse normale, et leur dérégulation peut contribuer à la transformation leucémique. En particulier, la surexpression du gène Hoxb4 dans les CSH influence leur destin cellulaire, favorisant des divisions d’auto-renouvellement et leur expansion en culture et in vivo. En général, les CSH s’épuisent rapidement lorsque maintenue hors de leur niche ex vivo. Différents facteurs interagissent avec les HOX et modulent leur liaison à l’ADN, dont la famille des protéines TALE (Three Amino acid Loop Extension), comme MEIS1 et PBX1. En utilisant une stratégie de surexpression combinée de Hoxb4 et d’un anti-sens de Pbx1 dans les CSH, générant ainsi des cellules Hoxb4hiPbx1lo, il est possible de majorer encore d’avantage leur potentiel d’AR et leur expansion in vitro. Les CSH Hoxb4hiPbx1lo demeurent fonctionnellement intactes malgré une modulation extrême de leur destin cellulaire en culture. Les niveaux d’expressions de facteurs nucléaires, seules ou en combinaison, peuvent donc s’avérer des déterminants majeurs du destin des CSH. Afin d’identifier d’autres facteurs nucléaires potentiellement impliqués dans le processus d’AR des CSH, une stratégie permettant d’évaluer simultanément plusieurs gènes candidats a été élaborée. Les progrès réalisés en termes de purification des CSH et de leur culture en micro-puits ont facilité la mise au point d’un crible en RNAi (interférence de l’ARN), mesurant l’impact fonctionnel d’une diminution des niveaux de transcrits d’un gène cible sur l’activité des CSH. Les candidats sélectionnés pour cette étude font partie du grand groupe des modificateurs de la chromatine, plus précisément la famille des histones déméthylases (HDM) contenant un domaine catalytique Jumonji. Ce choix repose sur la fonction régulatrice de plusieurs membres de complexes méthyl-transférases sur l’AR des CSH, dont l’histone méthyl-transférases MLL (Mixed Lineage Leukemia). Cette stratégie a aussi été utilisée dans le laboratoire pour étudier le rôle de facteurs d’asymétrie sur le destin des CSH, en collaboration. Ces études ont permis d’identifier à la fois des régulateurs positifs et négatifs de l’activité des CSH. Entre autre, une diminution de l’expression du gène codant pour JARID1B, une HDM de la lysine 4 de l’histone H3 (H3K4), augmente l’activité des CSH et s’accompagne d’une activation des gènes Hox. En conclusion, divers déterminants nucléaires, dont les facteurs de transcription et les modificateurs de la chromatine peuvent influencer le destin des CSH. Les mécanismes sous-jacents et l’identification d’autres modulateurs de l’AR demeurent des voies à explorer, pouvant contribuer éventuellement aux stratégies d’expansion des CSH ex vivo, et l’identification de cibles thérapeutiques contre les CSL. Mots-clés : cellules souches hématopoïétiques, Hoxb4, Pbx1, auto-renouvellement, histone déméthylases, RNAi

Rôle de l'acétylation du facteur de transcription IRF3

L’immunité innée est notre premier mécanisme de défense contre l’invasion des pathogènes. Cette défense est basée sur la reconnaissance d’éléments invariables des pathogènes par des récepteurs encodés dans les lignées germinales. Dans la réponse anti-virale, le facteur de transcription Interferon Regulatory Factor 3 (IRF3) joue un rôle clé dans la réponse interféron de type I, combattant ainsi la réplication virale et conférant un état anti-viral aux cellules infectées ainsi qu’aux cellules avoisinantes. IRF3 est une protéine dont l’activation et la phosphorylation sont régulées par les kinases TBK1 et IKKi. Nous proposons ici que l’acétylation est une modification post-traductionnelle importante dans la régulation de l’activité d’IRF3. Nous avons observé par immunobuvardage qu’IRF3 est acétylé de façon basale et que cette acétylation est induite par la présence du co-facteur CBP et est inhibée par la présence de la kinase TBK1. Par spectrométrie de masse, nous avons ensuite identifié huit lysines sujettes à l’acétylation sur IRF3. Aussi, par mutagénèse dirigée, nous avons muté de façon ponctuelle chacun de ces sites et avons déterminé que la mutation de la lysine 87 inhibe la capacité d’IRF3 à s’attacher à l’ADN en EMSA et à transactiver son élément de réponse en essai luciférase. Aussi, nous proposons que l’acétylation masque la charge positive de la lysine 87 et contrôle de façon négative l’activité du facteur de transcription IRF3. Notre groupe démontre ainsi pour la première fois l’acétylation du facteur de transcription dans un modèle cellulaire et propose que ce processus joue un rôle inhibiteur dans la régulation de la protéine.

Identification et caractérisation des protéines responsables de l’entrée en phase M chez Lingulodinium polyedrum

Les dinoflagellés sont des eucaryotes unicellulaires qui composent une grande partie du phytoplancton et qui jouent un rôle important au niveau de la photosynthèse, de la production primaire et de la conservation des écosystèmes marins. Les dinoflagellés se distinguent des autres eucaryotes par leur biologie et leur organisation nucléaire unique. Lors de la mitose, leur membrane nucléaire demeure intacte et la ségrégation des chromosomes se fait à partir de fuseaux mitotiques formés dans le cytoplasme et qui traversent le noyau au travers de canaux spécialisés Aussi, leurs chromosomes sont condensés en permanence et le processus utilisé pour y arriver est encore très mal compris puisque les dinoflagellés ne possèdent aucunes histones détectables. Lingulodinium polyedrum est un dinoflagellé photosynthétique marin utilisé comme organisme modèle en ce qui concerne l’étude des rythmes circadiens (bioluminescence, migration verticale, mitose et photosynthèse). La découverte et l’étude des éléments régulateurs du cycle cellulaire peuvent nous amener à comprendre le mécanisme, l’influence et la portée du contrôle circadien sur le cycle cellulaire. De plus, l’étude du cycle cellulaire pourrait permettre de révéler des indices quant aux caractéristiques singulières des dinoflagellés qui sont pour le moment énigmatiques. Par le passé, une étude chez Lingulodinium polyedrum a permis d’identifier la cycline impliquée dans la mitose, LpCyc1, le premier régulateur du cycle cellulaire a être découvert chez les dinoflagellés. La présente étude s’attarde sur la caractérisation de la LpCyc1, soit son expression, sa localisation, sa phosphorylation. Ces trois éléments concordent de façon à synchroniser l’activité de la LpCyc1 (et ainsi la mitose) de façon circadienne. Cette étude présente aussi la création et le développement d’un outil majeur pour l’étude future de Lingulodinium polyedrum, le transcriptome des ARNm à partir d’un iv séquençage Illumina. C’est d’ailleurs avec cet outil que nous avons découvert la CDK responsable du contrôle de la phase M, LpCdk1. Cette CDK possède tous les domaines d’une CDK classique, un site de liaison des substrats, un site de liaison à l’ATP, une boucle activatrice, et une interface de liaison avec la cycline. Le transcriptome de Lingulodinium polyedrum a aussi permis de recenser toutes les protéines conservées normalement retrouvées dans le contrôle du cycle cellulaire, qui nous a permis de faire une ébauche préliminaire du cycle cellulaire de L. polyedrum. Cette analyse est une première chez Lingulodinium polyedrum et peut s’étendre pour l’étude d’une multitude d’autres processus métaboliques.

Cyanocobalamin is a Superoxide Scavenger and Neuroprotectant in Neuronal Cells

Les dommages au nerf optique (neuropathie optique) peuvent entraîner la perte permanente de la vision ou la cécité causée par la mort des cellules ganglionnaires de la rétine (CGR). Nous avons identifié qu’une surproduction de l'anion superoxyde constitue un événement moléculaire critique précédant la mort cellulaire induite par des lésions. Récemment, Suarez-Moreira et al (JACS 131:15078, 2009) ont démontré que la vitamine B12 peut capter l’anion superoxyde aussi efficacement que l’enzyme superoxyde dismutase. La carence en vitamine B12 peut conduire à une neuropathie optique causée par des mécanismes inconnus. Nous avons étudié la relation entre la captation de superoxyde par la cyanocobalamine (forme de vitamine B12 la plus abondante) et ses propriétés neuroprotectrices dans les cellules neuronales. La cyanocobalamine aux concentrations de 10 μM et 100 μM a réduit le taux de production de superoxyde respectivement par 34% et 79% dans les essais sans-cellule. Dans les cellules RGC-5 traités avec la ménadione, les concentrations de cyanocobalamine supérieures à 10 nM ont diminué l’anion superoxyde à des valeurs similaires à celles traitées par PEG-SOD. La cyanocobalamine aux concentrations de 100 μM et 1 μM a réduit la mort des cellules RGC-5 exposées à la ménadione par 20% et 32%, respectivement. Chez les rats avec section du nerf optique unilatérale, une dose intravitréenne de 667 μM de cyanocobalamine a réduit le nombre de CGRs exposées au superoxyde. Cette dose a également augmenté le taux de survie des CGRs comparativement aux rats injectés avec la solution témoin. Ces données suggèrent que la vitamine B12 peut être un neuroprotecteur important, et sa carence nutritionnelle pourrait causer la mort de CGRs. La vitamine B12 pourrait aussi potentiellement être utilisée comme une thérapie pour ralentir la progression de la mort CGR chez les patients avec les neuropathies optiques caractérisés par une surproduction de superoxyde.