A practical approach on boar sperm cryodamage. Morphofunctional and immunocytochemical study of cryopreserved boar sperm intended for use in artificial insemination

L'ús d'esperma criopreservada en la inseminació artificial (IA) d'espècies d'interès productiu permet un major control sanitari i la creació de bancs de germoplasma d'alt valor genètic, entre d'altres avantatges. En el mercat porcí la major part de les inseminacions són encara realitzades amb semen refrigerat degut a l'èxit de l'aplicació de diluents de llarga durada i també a causa de la sensibilitat de l'esperma porcina a la criopreservació. Malgrat que aquesta sensibilitat ve donada per característiques particulars de la fisiologia espermàtica en l'espècie, algunes ejaculacions mantenen els paràmetres de qualitat espermàtica després de la criopreservació (ejaculacions amb bona "congelabilitat", GFEs) enfront d'altres que no sobreviuen al procés (ejaculacions amb mala "congelabilitat", PFEs). El primer objectiu de l'estudi va ser comparar ambdós grups en termes de fertilitat in vivo. El segon objectiu va ser testar l'eficiència de la inseminació postcervical (post-CAI) amb l'esperma criopreservada. El tercer objectiu va ser buscar predictors de la congelabilitat de les ejaculacions, tant en les GFEs com en les PFEs i en tres passos del procés de criopreservació (a 17ºC, a 5ºC i a 240 min postdescongelació). Aquest objectiu es va dur a terme mitjançant l'avaluació de paràmetres convencionals de qualitat espermàtica i a través de l'estudi de la localització i la reactivitat sota el microscopi de tres proteïnes (GLUT3, HSP90AA1 i Cu/ZnSOD) relacionades amb la fisiologia espermàtica i amb possibles rols en la congelabilitat. El quart objectiu va ser quantificar l'expressió de les tres proteïnes per transferència western, tant en espermatozoides d'ejaculacions GFEs com en els d'ejaculacions PFEs i en els tres passos abans esmentats, per tal de determinar el seu potencial com a predictores de la congelabilitat. Pel primer i el segon objectiu, 86 truges van ser inseminades per post-CAI amb 26 ejaculacions de mascles Piétrain dividides en una porció refrigerada a 17ºC (tractament control) i una porció criopreservada, ambdues porcions classificades alhora com a GFEs o PFEs. Els resultats més rellevants van demostrar que les probabilitats d'embaràs eren dues vegades menors en inseminacions amb esperma criopreservada d'ejaculacions PFEs (P < 0.05) que en inseminacions amb esperma criopreservada d'ejaculacions GFEs, fet que indica que les ejaculacions amb percentatges elevats d'espermatozoides mòbils progressius i d'integritat de membrana (per sobre del 40% en les GFEs) són més favorables a provocar embarassos que no pas aquelles ejaculacions amb una pobra funció espermàtica in vitro (PFEs). Ni el nombre de truges que van donar a llum, ni la quantitat de garrins, ni el risc de reflux espermàtic van ser significativament diferents entre les inseminacions amb esperma criopreservada d'ejaculacions GFEs i les inseminacions control amb semen refrigerat, la qual cosa demostra la bona aplicabilitat de la inseminació post-CAI amb l'esperma criopreservada. Finalment, pel tercer i quart objectius van ser criopreservades 29 i 11 ejaculacions de mascles Piétrain, respectivament. Dos paràmetres cinètics espermàtics, la linealitat (LIN) i la rectitud (STR), van mostrar una hiperactivació de la mobilitat superior en les ejaculacions PFEs que en les GFEs després de 30 min a 5ºC durant la criopreservació. A més, la combinació d'ambdós paràmetres va donar una fiabilitat propera al 72% en la predicció de la congelabilitat de les ejaculacions porcines. Tot i que no va ser possible predir la congelabilitat mitjançant l'avaluació de les tres proteïnes al microscopi, els resultats de transferència western van revelar diferències en l'expressió de la HSP90AA1 en l'esperma a 17ºC, molt possiblement relacionades amb la millor supervivència a la criopreservació dels espermatozoides d'ejaculacions GFEs. Aquests resultats suggereixen que la promoció de la criopreservació d'esperma porcina per la seva aplicació en IA passa pel desenvolupament de tests per la predicció de la congelabilitat en semen refrigerat.

Funcions densitat i semblança molecular quàntica: nous desenvolupaments i aplicacions

La present tesi, tot i que emmarcada dins de la teoria de les Mesures Semblança Molecular Quántica (MQSM), es deriva en tres àmbits clarament definits: - La creació de Contorns Moleculars de IsoDensitat Electrònica (MIDCOs, de l'anglès Molecular IsoDensity COntours) a partir de densitats electròniques ajustades. - El desenvolupament d'un mètode de sobreposició molecular, alternatiu a la regla de la màxima semblança. - Relacions Quantitatives Estructura-Activitat (QSAR, de l'anglès Quantitative Structure-Activity Relationships). L'objectiu en el camp dels MIDCOs és l'aplicació de funcions densitat ajustades, ideades inicialment per a abaratir els càlculs de MQSM, per a l'obtenció de MIDCOs. Així, es realitza un estudi gràfic comparatiu entre diferents funcions densitat ajustades a diferents bases amb densitats obtingudes de càlculs duts a terme a nivells ab initio. D'aquesta manera, l'analogia visual entre les funcions ajustades i les ab initio obtinguda en el ventall de representacions de densitat obtingudes, i juntament amb els valors de les mesures de semblança obtinguts prèviament, totalment comparables, fonamenta l'ús d'aquestes funcions ajustades. Més enllà del propòsit inicial, es van realitzar dos estudis complementaris a la simple representació de densitats, i són l'anàlisi de curvatura i l'extensió a macromolècules. La primera observació correspon a comprovar no només la semblança dels MIDCOs, sinó la coherència del seu comportament a nivell de curvatura, podent-se així observar punts d'inflexió en la representació de densitats i veure gràficament aquelles zones on la densitat és còncava o convexa. Aquest primer estudi revela que tant les densitats ajustades com les calculades a nivell ab initio es comporten de manera totalment anàloga. En la segona part d'aquest treball es va poder estendre el mètode a molècules més grans, de fins uns 2500 àtoms. Finalment, s'aplica part de la filosofia del MEDLA. Sabent que la densitat electrònica decau ràpidament al allunyar-se dels nuclis, el càlcul d'aquesta pot ser obviat a distàncies grans d'aquests. D'aquesta manera es va proposar particionar l'espai, i calcular tan sols les funcions ajustades de cada àtom tan sols en una regió petita, envoltant l'àtom en qüestió. Duent a terme aquest procés, es disminueix el temps de càlcul i el procés esdevé lineal amb nombre d'àtoms presents en la molècula tractada. En el tema dedicat a la sobreposició molecular es tracta la creació d'un algorisme, així com la seva implementació en forma de programa, batejat Topo-Geometrical Superposition Algorithm (TGSA), d'un mètode que proporcionés aquells alineaments que coincideixen amb la intuïció química. El resultat és un programa informàtic, codificat en Fortran 90, el qual alinea les molècules per parelles considerant tan sols nombres i distàncies atòmiques. La total absència de paràmetres teòrics permet desenvolupar un mètode de sobreposició molecular general, que proporcioni una sobreposició intuïtiva, i també de forma rellevant, de manera ràpida i amb poca intervenció de l'usuari. L'ús màxim del TGSA s'ha dedicat a calcular semblances per al seu ús posterior en QSAR, les quals majoritàriament no corresponen al valor que s'obtindria d'emprar la regla de la màxima semblança, sobretot si hi ha àtoms pesats en joc. Finalment, en l'últim tema, dedicat a la Semblança Quàntica en el marc del QSAR, es tracten tres aspectes diferents: - Ús de matrius de semblança. Aquí intervé l'anomenada matriu de semblança, calculada a partir de les semblances per parelles d'entre un conjunt de molècules. Aquesta matriu és emprada posteriorment, degudament tractada, com a font de descriptors moleculars per a estudis QSAR. Dins d'aquest àmbit s'han fet diversos estudis de correlació d'interès farmacològic, toxicològic, així com de diverses propietats físiques. - Aplicació de l'energia d'interacció electró-electró, assimilat com a una forma d'autosemblança. Aquesta modesta contribució consisteix breument en prendre el valor d'aquesta magnitud, i per analogia amb la notació de l'autosemblança molecular quàntica, assimilar-la com a cas particular de d'aquesta mesura. Aquesta energia d'interacció s'obté fàcilment a partir de programari mecanoquàntic, i esdevé ideal per a fer un primer estudi preliminar de correlació, on s'utilitza aquesta magnitud com a únic descriptor. - Càlcul d'autosemblances, on la densitat ha estat modificada per a augmentar el paper d'un substituent. Treballs previs amb densitats de fragments, tot i donar molt bons resultats, manquen de cert rigor conceptual en aïllar un fragment, suposadament responsable de l'activitat molecular, de la totalitat de l'estructura molecular, tot i que les densitats associades a aquest fragment ja difereixen degut a pertànyer a esquelets amb diferents substitucions. Un procediment per a omplir aquest buit que deixa la simple separació del fragment, considerant així la totalitat de la molècula (calcular-ne l'autosemblança), però evitant al mateix temps valors d'autosemblança no desitjats provocats per àtoms pesats, és l'ús de densitats de Forats de fermi, els quals es troben definits al voltant del fragment d'interès. Aquest procediment modifica la densitat de manera que es troba majoritàriament concentrada a la regió d'interès, però alhora permet obtenir una funció densitat, la qual es comporta matemàticament igual que la densitat electrònica regular, podent-se així incorporar dins del marc de la semblança molecular. Les autosemblances calculades amb aquesta metodologia han portat a bones correlacions amb àcids aromàtics substituïts, podent així donar una explicació al seu comportament. Des d'un altre punt de vista, també s'han fet contribucions conceptuals. S'ha implementat una nova mesura de semblança, la d'energia cinètica, la qual consisteix en prendre la recentment desenvolupada funció densitat d'energia cinètica, la qual al comportar-se matemàticament igual a les densitats electròniques regulars, s'ha incorporat en el marc de la semblança. A partir d'aquesta mesura s'han obtingut models QSAR satisfactoris per diferents conjunts moleculars. Dins de l'aspecte del tractament de les matrius de semblança s'ha implementat l'anomenada transformació estocàstica com a alternativa a l'ús de l'índex Carbó. Aquesta transformació de la matriu de semblança permet obtenir una nova matriu no simètrica, la qual pot ser posteriorment tractada per a construir models QSAR.

Implementation and application of basis set superposition error-correction schemes to the theoretical modeling of weak intermolecular interactions

This thesis deals with the so-called Basis Set Superposition Error (BSSE) from both a methodological and a practical point of view. The purpose of the present thesis is twofold: (a) to contribute step ahead in the correct characterization of weakly bound complexes and, (b) to shed light the understanding of the actual implications of the basis set extension effects in the ab intio calculations and contribute to the BSSE debate. The existing BSSE-correction procedures are deeply analyzed, compared, validated and, if necessary, improved. A new interpretation of the counterpoise (CP) method is used in order to define counterpoise-corrected descriptions of the molecular complexes. This novel point of view allows for a study of the BSSE-effects not only in the interaction energy but also on the potential energy surface and, in general, in any property derived from the molecular energy and its derivatives A program has been developed for the calculation of CP-corrected geometry optimizations and vibrational frequencies, also using several counterpoise schemes for the case of molecular clusters. The method has also been implemented in Gaussian98 revA10 package. The Chemical Hamiltonian Approach (CHA) methodology has been also implemented at the RHF and UHF levels of theory for an arbitrary number interacting systems using an algorithm based on block-diagonal matrices. Along with the methodological development, the effects of the BSSE on the properties of molecular complexes have been discussed in detail. The CP and CHA methodologies are used for the determination of BSSE-corrected molecular complexes properties related to the Potential Energy Surfaces and molecular wavefunction, respectively. First, the behaviour of both BSSE-correction schemes are systematically compared at different levels of theory and basis sets for a number of hydrogen-bonded complexes. The Complete Basis Set (CBS) limit of both uncorrected and CP-corrected molecular properties like stabilization energies and intermolecular distances has also been determined, showing the capital importance of the BSSE correction. Several controversial topics of the BSSE correction are addressed as well. The application of the counterpoise method is applied to internal rotational barriers. The importance of the nuclear relaxation term is also pointed out. The viability of the CP method for dealing with charged complexes and the BSSE effects on the double-well PES blue-shifted hydrogen bonds is also studied in detail. In the case of the molecular clusters the effect of high-order BSSE effects introduced with the hierarchical counterpoise scheme is also determined. The effect of the BSSE on the electron density-related properties is also addressed. The first-order electron density obtained with the CHA/F and CHA/DFT methodologies was used to assess, both graphically and numerically, the redistribution of the charge density upon BSSE-correction. Several tools like the Atoms in Molecules topologycal analysis, density difference maps, Quantum Molecular Similarity, and Chemical Energy Component Analysis were used to deeply analyze, for the first time, the BSSE effects on the electron density of several hydrogen bonded complexes of increasing size. The indirect effect of the BSSE on intermolecular perturbation theory results is also pointed out It is shown that for a BSSE-free SAPT study of hydrogen fluoride clusters, the use of a counterpoise-corrected PES is essential in order to determine the proper molecular geometry to perform the SAPT analysis.

Validation of an automated algorithm for auditory brainstem response testing

This paper discusses the auditory brainstem response (ABR) testing for infants.

Evaluation of a feedback equalization algorithm in the CID Wearable Digital Hearing Aid

This paper describes the results of an investigation which examined the efficacy of a feedback equalization algorithm incorporated into the Central Institute for the Deaf Wearable Digital Hearing Aid. The study examined whether the feedback equalization would allow for greater usable gains when subjects listened to soft speech signals, and if so, whether or not this would improve speech intelligibility.

Development of practical methodology and indicators for on-farm animal welfare assessment

163 p.