Glucosamine resistance in the yeast, Saccharomyces cerivisae [sic]

By using glucosamine resistant mutants of Saccharomyces ceriv~sa~ an attempt was made to discover the mechanisms which cause glucose repression and/or the Crabtree effect. The strains used are 4B2, GR6, lOP3r, GR8l and GRI08. 4B2 is a wild type yeast while the others are its mutants. To characterize the biochemical reactions which made these mutants resistant to glucosamine poisoning the following experiments were done~ 1. growth and respiration; 2. transport of sugars; 3. effect of inorganic phosphate (Pi): 4. Hexokinase; 5. In yivo phosphorylation. From the above experiments the following conclusions may be drawn: (i) GR6 and lOP3r have normal respiratory and fermentative pathways. These mutants are resistant to glucosamine poisoning due to a slow rate of sugar transport which is due to change in the cell membrane. (ii) GR8l has a normal respiratory pathway. The slow growth on fermentable carbon sourCEE indicates that in GR8l the lesion is in or associated with the glycolytic pathway. The lower rate of sugar transport may be due to a change in energy metabolism. The invivo phosphorylation rate indicates that in GR81 facilitated diffusion is the dominant transport mechanism. (iii) GR108 msa normal glycolytic pathway but the respiratory pathway is abnormal. The slow rate of sugar transport is due to a change in energy metabolism. The lower percentage of in vivo phosphorylation is probably due to a lowered availability of ATP because of the mitochondrial lesion. In all mutants resistance to glucosamine poisoning is due to a lower rate of utilization of ATP. which is caused by various mechanisms (see above), making less ADP available for phosphorylation via ATP synthase which utilizes inorganic phosphate. Because of the lower utilization of Pi, the concentration of intra-mitochondrial Pi does not go down thus protecting mutants from glucosamine poisoning.

Modifications to the Suzuki reaction and mechanistic insights on the NBS mediated cleavage of benzylidene acetals /

One of the most challenging tasks for a synthetic organic chemist today, is the development of chemo, regio, and stereoselective methodologies toward the total synthesis of macromolecules. r . The objective of my thesis was to develop methodologies towards this end. The first part of my project was to develop highly functionalized chirons from D-glucose, a cheap, chiral starting material, to be utilized in this capacity. The second part of the project dealt with modifying the carbon-carbon bond forming Suzuki reaction, which is utilized quite often as a means of combining molecular sub units in total synthesis applications. As previously stated the first area of the project was to develop high value chirons from D-glucose, but the mechanism of their formation was also investigated. The free radical initiated oxidative fragmentation of benzylidene acetals was investigated through the use of several test-case substrates in order to unravel the possible mechanistic pathways. This was performed by reacting the different acetals with N-bromosuccinimide and benzoyl peroxide in chlorobenzene at 70^C in all cases. Of the three mechanistic pathways discussed in the literature, it was determined, from the various reaction products obtained, that the fragmentation of the initial benzylic radical does not occur spontaneously but rather, oxidation proceeds to give the benzyl bromide, which then fragments via a polar pathway. It was also discovered that the regioselectivity of the fragmentation step could be altered through incorporation of an allylic system into the benzylidene acetal. This allows for the acquisition of a new set of densely functionalized. chiral, valuable synthetic intermediates in only a few steps and in high yields from a-Dglucose. The second part of the project was the utilization of the phosphonium salt room temperature ionic liquid tetradecyltrihexylphosphonium chloride (THPC) as an efficient reusable medium for the palladium catalyzed Suzuki cross-coupling reaction of aryl halides, including aryl chlorides, under mild conditions. The cross-coupling reactions were found to proceed in THPC containing small amounts of water and toluene using potassium phosphate and 1% Pd2(dba)3. Variously substituted iodobenzenes, including electron rich derivatives, reacted efficiently in THPC with a variety of arylboronic acids and afforded complete conversion within 1 hour at 50 ^C. The corresponding aryl bromides also reacted under these conditions with the addition of a catalytic amount of triphenylphosphine that allowed for complete conversion and high isolated yields. The reactions involving aryl chlorides were considerably slower, although the addition of triphenylphosphine and heating at 70 ^C allowed high conversion of electron deficient derivatives. Addition of water and hexane to the reaction products results in a triphasic system in which the top hexane phase contained the biaryl products, the palladium catalyst remained fully dissolved in the central THPC layer, while the inorganic salts were extracted into the lower aqueous phase. The catalyst was then recycled by removing the top and bottom layers and adding the reagents to the ionic liquid which was heated again at 50 ^C; resulting in complete turnover of iodobenzene. Repetition of this procedure gave the biphenyl product in 82-97% yield (repeated five times) for both the initial and recycled reaction sequences.

Elucidation of the Retinoid Signalling Pathway Involved in Axon Guidance in Lymnaea stagnalis and Xenopus laevis

The vitamin A metabolite, retinoic acid (RA), is known to play a crucial role in several developmental processes including axial patterning and differentiation. More recently, RA has been implicated in the regenerative process acting through its classical signaling pathway, the nuclear receptors, retinoic acid receptor (RAR) and retinoid X receptor (RXR), to mediate gene transcription. Moreover, RA has been shown to act as a guidance molecule for growth cones of regenerating motorneurons of the pond snail, Lymnaea stagnalis. Our lab has recently shown that RA can induce this morphological response independent of nuclear transcription, however, the role of the retinoid receptors in RA-induced chemoattraction is still unknown. Here, I show that the retinoid receptors, RXR and RAR, may mediate the growth cones response to the metabolically active retinoic acid isomers, all-trans and 9-cis RA, in Lymnaea stagnalis. Data presented here show that both an RXR and RAR antagonist can block growth cone turning in response to application of both isomers. Because no prior investigations have shown growth cone turning of individual vertebrate neurons, I aimed to show that both retinoic acid isomers were capable of inducing growth cone turning of embryonic spinal cord neurons in the frog, Xenopus laevis. For the first time in Xenopus, I showed that both all-trans and 9-cis RA were able to induce significantly more neurite outgrowth from cultured embryonic spinal cord neurons and induce positive growth cone turning of individual growth cones. In addition, I showed that the presence of the RXR antagonist, HX531, blocked 9-cis RA-induced growth cone turning and the RARβ antagonist, LE135, blocked all-trans RA-induced growth cone turning in this species. Evidence provided here shows for the first time, conservation of retinoic acid-induced growth cone turning in a vertebrate model system. In addition, these data show that the receptors involved in this morphological response may be the same in vertebrates and invertebrates.

Icewine fermentation by Saccharomyces cervisiae : fundamental stress responses and comparative fermentation dynamics

Please consult the paper edition of this thesis to read. It is available on the 5th Floor of the Library at Call Number: Z 9999.5 B63 P54 2007

Role of Phosphorylation of the Oxysterol Binding Protein (OSBP) in (PI(4)P) and Sterol-Containing Membrane Recognition and Binding

Studies have demonstrated that the oxysterol binding protein (OSBP) acts as a phosphatidylinositol phosphate (PIP)-sterol exchanger at membrane contact sites (MCS) of the endoplasmic reticulum (ER) and Golgi. OSBP is known to pick up phosphatidylinositol-4-phosphate (PI(4)P) from the ER, transfer it to the trans-Golgi in exchange for a cholesterol molecule that is then transferred from the trans-Golgi to the ER. Upon further examination of this pathway by Ridgway et al. (1), it appeared that phosphorylation of OSBP played a role in the localization of OSBP. The dephosphorylation state of OSBP was linked to Golgi localization and the depletion of cholesterol at the ER. To mimic the phosphorylated state of OSBP, the mutant OSBP-S5E was designed by Ridgway et al. (1). The lipid and sterol recognition by wt-OSBP and its phosphomimic mutant OSBP-S5E were investigated using immobilized lipid bilayers and dual polarization interferometry (DPI). DPI is a technique in which the protein binding affinity to immobilized lipid bilayers is measured and the binding behavior is examined through real time. Lipid bilayers containing 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) and varying concentrations of PI(4)Ps or sterols (cholesterol or 25-hydroxycholesterol) were immobilized on a silicon nitride chip. It was determined that wt-OSBP binds differently to PI(4)P-containing bilayers compared to OSBP-S5E. The binding behavior suggested that wt-OSBP extracts PI(4)P and the change in the binding behavior, in the case of OSBP-S5E, suggested that the phosphorylation of OSBP may prevent the recognition and/or extraction of PI(4)P. In the presence of sterols, the overall binding behavior of OSBP, regardless of phosphorylation state, was fairly similar. The maximum specific bound mass of OSBP to sterols did not differ as the concentration of sterols increased. However, comparing the maximum specific bound mass of OSBP to cholesterol with oxysterol (25-hydroxycholesterol), OSBP displayed nearly a 2-fold increase in bound mass. With the absence of the wt-OSBP-PI(4)P binding behavior, it can be speculated that the sterols were not extracted. In addition, the binding behavior of OSBP was further tested using a fluorescence based binding assay. Using 22-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-23,24-bisnor-5-cholen-3β-ol (22-NBD cholesterol), wt-OSBP a one site binding dissociation constant Kd, of 15 ± 1.4 nM was determined. OSBP-S5E did not bind to 22-NBD cholesterol and Kd value was not obtained.

Three rounds (1R/2R/3R) of genome duplications and the evolution of the glycolytic pathway in vertebrates

Affiliation: Henner Brinkmann : Département de biochimie, Faculté de médecine, Université de Montreal

The shunt from the cyclooxygenase to lipoxygenase pathway in human osteoarthritic subchondral osteoblasts is linked with a variable expression of the 5-lipoxygenase-activating protein

Affiliation: Unité de recherche en Arthrose, Centre de recherche du Centre Hospitalier de l'Université de Montréal, Hôpital Notre-Dame

Lien entre l'hémostase et le développement néoplasique : rôle spécifique du facteur tissulaire et de l'inhibiteur du facteur tissulaire

Il est reconnu, depuis une centaine d’années, que des désordres de la coagulation, regroupés sous le terme de coagulopathies, sont souvent associés au développement néoplasique. Pendant de nombreuses années, ces coagulopathies furent souvent reconnues comme une simple conséquence du développement du cancer. D’ailleurs, pour les cliniciens, l’apparition de ces anomalies sanguines constitue souvent le premier signe clinique d’un cancer occulte. Toutefois, l’étude approfondie du lien existant entre le système hémostatique et le cancer indique que différents facteurs hémostatiques vont interagir avec soit l’environnement tumoral ou soit la tumeur elle-même et influencer le développement du cancer. Au cours de nos travaux, nous avons porté une attention particulière à deux protéines jouant un rôle primordial dans l’hémostase. Le facteur tissulaire (TF) et l’inhibiteur du facteur tissulaire (TFPI) peuvent jouer des rôles pro- ou anti-néoplasique, et ce indépendamment de leurs fonctions hémostatiques normales. Dans le premier volet de cette thèse, nous avons étudié les propriétés antiangiogéniques de TFPI. L’angiogenèse, soit la formation de nouveaux vaisseaux sanguins à partir du réseau pré-existant, est reconnue comme étant une étape clée du développement tumoral. D’après nos travaux, le TFPI peut inhiber la formation de structures de type capillaire des cellules endothéliales (CEs) de la veine ombilicale humaine (HUVEC), et ce à une IC 50 de 5 nM, soit la concentration physiologique de l’inhibiteur. De plus, le TFPI bloque la migration des cellules endothéliales lorsque ces dernières sont stimulées par la sphingosine-1-phosphate (S1P), une molécule relâchée lors de l’activation des plaquettes sanguines. Cette inhibition de la migration cellulaire s’explique par l’effet du TFPI sur l’adhésion des CEs. En effet, TFPI inhibe la phosphorylation de deux protéines clées participant à la formation des complexes d’adhésion focales soit FAK (focal adhesion kinase) et PAX (paxilin). L’inhibition de ces deux protéines suggère qu’il y ait une réorganisation des complexes focaux, pouvant expliquer la perte d’adhérence. Finalement, des études de microscopie confocale démontrent que les cellules traitées au TFPI changent de morphologie au niveau du cytosquelette d’actine provoquant une désorganisation des structures migratoires (pseudopodes). Les effets du TFPI au niveau de la migration, de l’adhésion et de la morphologie cellulaire sont strictement spécifiques aux cellules endothéliales humaines, puisque aucun n’effet n’est observé en traitant des cellules cancéreuses de glioblastomes (GB) humains, qui sont normalement des tumeurs hautement vascularisées. En résumé, cette première étude démontre que le TFPI est un inhibiteur de l’angiogenèse. Dans le second volet de cette thèse, nous nous sommes intéressés aux différents rôles de TF, le principal activateur de la coagulation. Cette protéine est également impliquée dans le développement néoplasique et notamment celui des médulloblastomes (MB) chez l’enfant via des fonctions hémostatiques et non-hémostatiques. Nos travaux démontrent que l’expression de TF est induite par la voie de signalisation de HGF (hepatocyte growth factor) et de son récepteur Met. Cet effet de HGF/Met semble spécifique aux MB puisque HGF ne peut stimuler l’expression de TF au niveau des cellules cancéreuses de glioblastomes. TF, exprimé à la surface des cellules médulloblastiques (DAOY), est responsable de l’activité pro-thrombogénique de ces cellules, ainsi qu’un acteur important de la migration de ces cellules en réponse au facteur VIIa (FVIIa). De plus, en étudiant 18 spécimens cliniques de MB, nous avons établi un lien entre l’intensité d’expression de TF et de Met. L’importance de cette corrélation est également suggérée par l’observation que les cellules exprimant les plus forts taux de TF et de Met sont également les plus agressives en termes d’index de prolifération et de dissémination métastatiques. En résumé, ces travaux représentent le point de départ pour la mise au point de TF comme un marqueur diagnostique clinique dans les cas de tumeurs du cerveau pédiatriques. De plus, l’élucidation de la voie de signalisation moléculaire responsable de l’expression de TF permet de mieux comprendre la biologie et le fonctionnement de ces tumeurs et de relier le profil d’expression de TF aux phénotypes agressifs de la maladie. Il est reconnu que HGF peut également jouer un rôle protecteur contre l’apoptose. Dans le troisième volet de cette thèse, nous avons remarqué que cette protection est corrélée à l’expression de TF. En réduisant à néant l’expression de TF à l’aide de la technologie des ARN silencieux (siRNA), nous démontrons que HGF ne protège plus les cellules contre l’apoptose. Donc, TF médie l’activité anti-apoptotique de HGF. TF assume cette protection en inactivant la phosphorylation de p53 sur la sérine 15, empêchant ainsi la translocation de p53 au noyau. Finalement, l’expression de TF et son interaction avec le FVIIa, au niveau des cellules médulloblastiques favorise la survie de ces dernières et ce même si elles sont soumises à de fortes concentrations de médicaments couramment utilisées en cliniques. Ce troisième et dernier volet démontre l’implication de TF en tant que facteur impliqué dans la survie des cellules cancéreuses, favorisant ainsi le développement de la tumeur. Dans son ensemble, cette thèse vise à démontrer que les facteurs impliqués normalement dans des fonctions hémostatiques (TFPI et TF) peuvent contribuer à réguler le développement tumoral. Tout système physiologique et pathologique est dépendant d’un équilibre entre activateur et inhibiteur et la participation de TF et de TFPI à la régulation du développement néoplasique illustre bien cette balance délicate. Par sa contribution anti- ou pro-néoplasique le système hémostatique constitue beaucoup plus qu’une simple conséquence du cancer; il fait partie par l’action de TF des stratégies élaborées par les cellules cancéreuses pour assurer leur croissance, leur déplacement et leur survie, alors que TFPI tente de limiter la croissance tumorale en diminuant la vascularisation.

Identification and characterization of the transcriptional targets of the WNT/β-catenin signaling pathway in granulosa cells

Les Wnts représentent une famille de glycoprotéines de signalisation qui sont connues pour les nombreux rôles qu'ils jouent durant le développement embryonnaire et dans la cancerogénèse. Plusieurs Wnts, leurs récepteurs (Fzd) et d'autres composants des voies de signalisation des Wnt sont exprimés dans l’ovaire postnatal, et il a été démontré que l’expression de certains de ces gènes est régulée pendant le développement et l'ovulation/luteinization folliculaires. Toutefois, leurs rôles physiologiques dans l’ovaire demeurent mal définis. Pour étudier le rôle de WNT4 dans le développement folliculaire, nous avons entrepris d’identifier ses cibles transcriptionnels dans les cellules de la granulosa. Pour ce faire, nous avons employé la souris Catnbflox(ex3)/flox(ex3), chez laquelle une activation constitutive de la voie de Wnt/β-catenin a lieu suite à l’action de la recombinare Cre. Des cellules de la granulosa de ces souris ont été mises en culture et infectées avec un adenovirus pour causer la surexpression de WNT4 ou l’expression de Cre. L’ARN a alors été extrait de ces cellules et analysé par micro-puce. Les résultats ont démontré qu’une forte proportion des gènes induits par WNT4 étaient des gènes impliqués dans la réponse cellulaire au stress. Presque tous gènes induits par WNT4 ont également été induits par Cre, indiquant que WNT4 signale via la voie Wnt/β-catenin dans ces cellules. Nos résultats suggèrent donc que WNT4 favorise la survie des follicules par l’induction de gènes de réponse au stress dans les cellules de la granulosa, augmentant ainsi la résistance cellulaire à l'apoptose.

The importance of the Hedgehog signaling pathway at the level of the blood-brain barrier

La barrière hémato-encéphalique (BHE) protège le système nerveux central (SNC) en contrôlant le passage des substances sanguines et des cellules immunitaires. La BHE est formée de cellules endothéliales liées ensemble par des jonctions serrées et ses fonctions sont maintenues par des astrocytes, celles ci sécrétant un nombre de facteurs essentiels. Une analyse protéomique de radeaux lipidiques de cellules endothéliales de la BHE humaine a identifié la présence de la voie de signalisation Hedgehog (Hh), une voie souvent liées à des processus de développement embryologique ainsi qu’au niveau des tissus adultes. Suite à nos expériences, j’ai déterminé que les astrocytes produisent et secrètent le ligand Sonic Hh (Shh) et que les cellules endothéliales humaines en cultures primaires expriment le récepteur Patched (Ptch)-1, le co-récepteur Smoothened (Smo) et le facteur de transcription Gli-1. De plus, l’activation de la voie Hh augmente l’étanchéité des cellules endothéliales de la BHE in vitro. Le blocage de l’activation de la voie Hh en utilisant l’antagoniste cyclopamine ainsi qu’en utilisant des souris Shh déficientes (-/-) diminue l’expression des protéines de jonctions serrées, claudin-5, occcludin, et ZO-1. La voie de signalisation s’est aussi montrée comme étant immunomodulatoire, puisque l’activation de la voie dans les cellules endothéliales de la BHE diminue l’expression de surface des molécules d’adhésion ICAM-1 et VCAM-1, ainsi que la sécrétion des chimiokines pro-inflammatoires IL-8/CXCL8 et MCP-1/CCL2, créant une diminution de la migration des lymphocytes CD4+ à travers une monocouche de cellules endothéliales de la BHE. Des traitements avec des cytokines pro-inflammatoires TNF-α and IFN-γ in vitro, augmente la production de Shh par les astrocytes ainsi que l’expression de surface de Ptch-1 et de Smo. Dans des lésions actives de la sclérose en plaques (SEP), où la BHE est plus perméable, les astrocytes hypertrophiques augmentent leur expression de Shh. Par contre, les cellules endothéliales de la BHE n’augmentent pas leur expression de Ptch-1 ou Smo, suggérant une dysfonction dans la voie de signalisation Hh. Ces résultats montrent que la voie de signalisation Hh promeut les propriétés de la BHE, et qu’un environnement d’inflammation pourrait potentiellement dérégler la BHE en affectant la voie de signalisation Hh des cellules endothéliales.

Impacts de la fertilisation phosphatée sur la biodiversité microbienne de sols agricoles

La fertilisation phosphatée est très répandue dans les pratiques agricoles Nord-Américaines. Bien que généralement très efficace pour augmenter la production végétale, son utilisation peut engendrer certaines contaminations environnementales. Afin de diminuer ce problème, plusieurs pratiques de gestion sont envisagées. Parmi celles-ci, on retrouve l’intéressante possibilité de manipuler la flore microbienne car cette dernière est reconnue pour son implication dans bons nombres de processus fondamentaux liés à la fertilité du sol. Cette étude a démontré que lors d’essais en champs, la forme de fertilisant ajouté au sol ainsi que la dose de phosphore (P) appliquée avaient un impact sur la distribution des microorganismes dans les différentes parcelles. Une première expérience menée sur une culture de luzerne en prairie semi-aride a montré que les échantillons provenant de parcelles ayant reçu différentes doses de P présentaient des différences significatives dans leurs communautés bactériennes et fongiques. La communauté de CMA est restée similaire entre les différents traitements. Une deuxième expérience fut menée pendant trois saisons consécutives afin de déterminer l’effet de différentes formes de fertilisation organiques et minérale ajustées selon une dose unique de P sur les populations bactériennes et fongiques d’une culture intensive de maïs en rotation avec du soja. Les résultats des analyses ont montrés que les populations varient selon le type de fertilisation reçu et que les changements sont indépendants du type de végétaux cultivé. Par contre, les populations microbiennes subissent une variation plus marquée au cours de la saison de culture. La technique de DGGE a permis d’observer les changements frappant la diversité microbienne du sol mais n’a permis d’identifier qu’une faible proportion des organismes en cause. Parallèlement à cette deuxième étude, une seconde expérience au même site fut menée sur la communauté de champignons mycorhiziens à arbuscules (CMA) puisqu’il s’agit d’organismes vivant en symbiose mutualiste avec la majorité des plantes et favorisant la nutrition de même que l’augmentation de la résistance aux stress de l’hôte. Ceci permit d’identifier et de comparer les différents CMA présents dans des échantillons de sol et de racines de maïs et soja. Contrairement aux bactéries et aux champignons en général, les CMA présentaient une diversité très stable lors des différents traitements. Par contre, au cours des trois années expérimentales, il a été noté que certains ribotypes étaient significativement plus liés au sol ou aux racines. Finalement, l’ensemble de l’étude a démontré que la fertilisation phosphatée affecte la structure des communautés microbiennes du sol dans les systèmes évalués. Cependant, lors de chaque expérience, la date d’échantillonnage jouait également un rôle prépondérant sur la distribution des organismes. Plusieurs paramètres du sol furent aussi mesurés et ils présentaient aussi une variation au cours de la saison. L’ensemble des interactions possibles entre ces différents paramètres qui, dans certains cas, variaient selon le traitement appliqué, aurait alors probablement plus d’impact sur la biodiversité microbienne que la seule fertilisation.

Étude du rôle spécifique du système à deux composantes PhoBR et du système Pst (phosphate specific transport) dans la virulence d’une souche pathogène aviaire de Escherichia coli (APEC)

Les souches d’Escherichia coli pathogènes aviaires (APEC) sont responsables d’infections respiratoires et de septicémies chez la volaille. Le régulon Pho est contrôlé conjointement par le système à deux composantes PhoBR et par le système de transport spécifique du phosphate (Pst). Afin de déterminer l’implication de PhoBR et du système Pst dans la pathogenèse de la souche APEC O78 χ7122, différentes souche mutantes phoBR et pst ont été testées pour divers traits de virulence in vivo et in vitro. Les mutations menant à l’activation constitutive du régulon Pho rendaient les souches plus sensibles au peroxyde d’hydrogène et au sérum de lapin comparativement à la souche sauvage. De plus, l’expression des fimbriae de type 1 était affectée chez ces souches. L’ensemble des mutants Pho-constitutifs étaient aussi significativement moins virulents que la souche sauvage dans un modèle de coinfection de poulet, incluant les souches avec un système Pst fonctionnel. De plus, l’inactivation du régulateur PhoB chez un mutant Pst restaure la virulence. Par ailleurs, l’inactivation de PhoB n’affecte pas la virulence de la souche χ7122 dans notre modèle. De manière intéressante, le degré d’atténuation des souches mutantes corrèle directement avec le niveau d’activation du régulon Pho. Globalement, les résultats indiquent que l’activation du régulon Pho plutôt que le transport du phosphate via le système Pst joue un rôle majeur dans l’atténuation des APEC.