The Corticiaceae (Basidiomycetes) in Taiwan

Geographically, Taiwan is an Island and situated in the northeast of Asia, on the western side of the Pacific Basin, at the southeast of main China, south of Japan, and north of the Philippines. The main topographic character is the longitudinally oriented mountainous area. More than 200 peaks rise above 3000 m. They departed Taiwan into two lowland areas, an eastern and western plain. Taiwan is departed into subtropical (north area) and tropical zone (south area), which have a warm and humid climate, due to the Tropic of Cancer passing through. The average annual temperature in the lowland amounts to 28°C (7~38°C). The temperate climate also presents in the mountainous areas. The tropical typhoons usually come in summer and bring heavy rain, while the monsoon seasons have an important effect on the regional rainfall distribution. The mean annual rainfall of Taiwan is about 2600 mm (1000~6700 mm); the mountainous areas receive more rain than the lowlands. In Taiwan, according to different temperature and vegetation, the ecological environments were given rise to vertical biotic zonations, and form five major types: highland snowfield, highland meadow, coniferous forest, deciduous forest, and tropical forest. Six National Parks in Taiwan are located in the mountainous areas, in the north, the south, and on Jinmen Island. The National Parks represent about 8.4% of the country area. In this study, the collection sites are situated in Yangmingshan, Shei-Pa, Yushan, and Kenting National Park. Due to the island isolation, the proportions of endemic species are great in Taiwan, which also presents a high biodiversity. There are 4255 species of vascular plants including 1133 endemic. 5936 species in 1276 genera of fungi are hitherto reported in Taiwan. Among them, 233 Corticiaceae species were recorded, over one third (79 species) of them are known only from Taiwan. The first fungal report in Taiwan is about Phytophthora cyperi, published by the Japanese researcher T. Kawakami in 1904. Therefore, the history of research about fungi in Taiwan is more than one hundred years old. An eminent Japanese mycologist K. Sawada made an intensive survey from 1919 to 1959, and reported 2464 fungi species in his eleven volumes of “Descriptive Catalogue of Formosan Fungi”. However, only a few species (21 species in 9 genera) of Corticiaceae were recorded. From 1973, Chen and Lin resumed the study on Corticiaceae, and also some other foreign mycologists contributed for this field after 1980. The German research group lead by Franz Oberwinkler from Tübingen University collected in Taiwan several times. They published a number of new species and new records. Since 1989, S. H. Wu, a Taiwanese mycologist, has published a great amount of reports on corticioid fungi from Taiwan. Corticioid fungi were made up by the large and heterogeneous unnatural family Corticiaceae and other resupinate fungi belonging to other natural families in the Agaricomycetes. Molecular studies have shown that corticioid genera are distributed across all major clades of Agaricomycetes indicating that the corticioid fungi represent a polyphyletic group. They have resupinate fruitbodies and similar habitats. Species are characterized by simple fruitbody, more or less effused, and present smooth, porioid, grandinioid to odontioid hymenial surface. The fruitbodies are differently colored and usually soft to tough. Most of the Corticiaceae species are wood-saprobic organisms and gain the energy from the decomposing of wood-substrate such as cellulose or lignin. Materials for this study were collected by the author and other mycologists in Taiwan during surveys in April and May 1996, and March 2007, using the spring season with its high humidity and warm climate which are optimal conditions for the development of fungi. For assembling, the convenience sampling method was used in this study. This approach was chosen because it enables to detect a high biodiversity in a short time, and also to find species with rare or patchy distribution. The collecting sites from the North to the South include four National Parks and some preserved forests. They cover many different habitats such as low lands and high mountains. Fresh specimens were dried and analysed with a light microscope. 265 specimens belonging to Corticiaceae were studied in this research. Among them, 50 species in 21 genera including 11 new records and 10 new species were described with text and drawing. Four new species are belonging to Hyphodontia (H. sp. nov. 1, H. sp. nov. 2, H. sp. nov. 3, and H. sp. nov. 4), four to Schizopora (Sch. sp. nov. 1, Sch. sp. nov. 2, Sch. sp. nov. 3, and Sch. sp. nov. 4), one in Trechispora (T. sp. nov. 1), and one in Tubulicrinis (T. sp. nov. 1). Species recorded as new are Aleurodiscus amorphus, Botryohypochnus isabellinus, Hyphodontia cineracea, Hyphodontia palmae, Hypochnicium vellereum, Merulius tremellosus, Metulodontia nivea, Paullicorticium ansatum, Phlebia radiata, Phlebiella ardosiaca, and Xylobolus frustulatus. Besides, Botryohypochnus, Merulius, Metulodontia, Paullicorticium, and Xylobolus are also newly recorded genera in Taiwan. The genus Hyphodontia presents the highest diversity with 20 out of 50 species recorded. The second important genus is Hyphoderma, however with only 5 species. This indicates that Hyphodontia and Hyphoderma have a higher ability to develop in variable environments and approximately shows the predominance of these two genera in Taiwanese Corticiaceae. There are 11 new records out of the 50 species recorded, representing 22%. Some species, e.g. Hypochnicium vellereum and Paullicorticium ansatum were in the past recorded only in Europe and North America with cold and temperate climate. The samples of them are for the first time found in the subtropical belt, and display some difference from those of temperate regions. These collections should be molecularly investigated to clarify if they represent the same species of temperate areas. Patchily distributed species, for example Phlebiella ardosiaca, previously known only in Europe, and Hyphodontia palmae collected only in Brazil, were first recorded in different continents. Two possibilities are indicated by these new records: they are worldwide species but very rare to be found, or the Taiwanese specimens are taxonomically different. More survey from other continents and molecular study for these collections should be done in the future to solve this question. The distribution of Corticiaceae in Taiwan presents the variations in the north, central, and south areas and shows the diversity in lowlands and high mountains. The results of this study provide the evidence that the temperate Corticiaceae species displays a wider distribution. Subtropical and tropical taxa probably have also high dispersal capacities, and could possibly be found in the future in neighboring areas such as China, Japan, Korea or South Asia, but this needs further researches. In the total of 50 species, 10 new taxa were described in this study, giving about 20%. Some new species (e.g. Hyphodontia sp. 1, Hyphodontia sp. 2, and Hyphodontia sp. 3) are very similar to known species (Hyphodontia sambuci and Hyphodontia formosana), and the distinctive characters of Schizopora sp. nov. 1 are intermediate between those of Schizopora paradoxa and Hyphodontia flavipora. Thus, these small differences between the new and known species, suggest that the speciation occurred when the fungi migrated into Taiwan, due to the high diversity of environment, and amounts of the endemic plants. Taiwan is an intermediate place for the south (tropical) fungal species to migrate and adapt to north (temperate) regions. The middle and high altitude environments in Taiwan offer good conditions for the fungal speciation and possibly the occurrence of physiological changes to adapt to the temperate climate. Thus Taiwan has an important position for the biogeography of Asia mycobiota. 5936 known species in Taiwan represent about only 20% of the estimated number (24000) of Taiwanese fungal taxa. In this study, the findings (22% new records and 20% new species) indicate that amounts of unknown fungi species are expected in Taiwan. The lack of knowledge indicates that many new species are awaiting description, and fungal survey in Taiwan remains in a Pioneer phase. The last three wide surveys of Corticiaceae researches took place 20 years before this study (Chen & Lin 1977, Lin & Chen 1989, Wu 1990). After previous important contributions, the present taxonomic study comprising 21 genera is the most extensive on Corticiaceae of Taiwan.

Posttranslationale Chromatin-Modifikationen in Dictyostelium discoideum

Die Erforschung posttranslationaler Veränderungen von Chromatin-Komponenten stellt einen wichtigen Pfeiler der Epigenetik dar. Epigenetische Mechanismen verändern die Aussagekraft der DNA-Sequenz und entscheiden somit beispielsweise über die Aktivierung oder Stilllegung von Genen. Ein häufiges Ziel der Stilllegung sind springende genetische Elemente, die ansonsten zur Destabilisierung des Genoms führen können. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei unterschiedliche Stilllegungsmechanismen der Transpo-sons DIRS-1 und Skipper aus Dictyostelium discoideum untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, auf welche Weise die RNA-Interferenz (RNAi) zur Zerstörung des DIRS-1 Transkripts führt und dass die Ursache dafür in der Promotor-Aktivität des Elements selbst liegt. Eine überraschende Erkenntnis konnte auch für das zweite Element gewonnen werden. Experimente legen nahe, dass die in der kodierenden Skipper-Sequenz gefundene Chromo-Domäne zu einer gezielten Integration des Elements in bereits stillgelegte heterochromatische Bereiche führt. Diese zeichnen sich vor allem durch eine spezielle posttranslationale Histon-Modifikation, der Methylierung von Lysin 9 des Histons H3 (H3K9), aus. Während zu der Methylierung von H3K9 bereits Arbeiten erschienen sind, war ein Großteil der anderen in Dictyostelium discoideum kodierten Histon-Modifikationen bislang unbekannt. Mit Hilfe der Massenspektrometrie konnte erstmalig eine umfassende Karte der veränderten Aminosäuren erstellt werden. Dabei konnten neue, bislang für keinen Organismus beschriebene Modifikationsziele identifiziert werden. Weitere lassen durch einen Vergleich mit Modellorganismen wie Hefe und Fruchtfliege Schlüsse auf die Evolution des Histon-Codes zu. Die erstellte Karte kann in Zukunft Forschern als Grundlage dienen, um weitergehende Fragestellungen in Bezug auf die Funktionen der hier vorgestellten Modifikationen zu erforschen. Ein weiteres Ergebnis dieser Arbeit stellt die Charakterisierung posttranslationaler Veränderungen des an H3K9 bindenden Heterochromatin-Proteins 1 (HP1) dar. Neben einer ersten Analyse der in Dictyostelium discoideum vorhandenen Modifikationen der beiden Homologe HcpA und HcpB, wurde auch die Funktion der in der Chromoshadow-Domäne lokalisierten Acetylierung erforscht. Hierbei konnte gezeigt werden, dass ein Fehlen des veränderten Lysins zu einem deutlichen Phänotyp in der Sporenform und im Wachstum der Zellen führt. Als Ursache dafür konnte eine Veränderung in der Fähigkeit zur Gen-Stilllegung durch das mutierte HP1-Protein nachgewiesen werden. Dies gelang mit Hilfe eines dafür etablierten Reporters auf Basis des Gal4/UAS-Systems aus der Fruchtfliege und beweist erstmalig die Funktion einer Acetylierung der HP1-Proteine.

Charakterisierung der mikrobiellen Population und Untersuchungen zum Quorum Sensing in der Rhizosphäre vom Weidelgras (Lolium perenne) auf einer Rückstandshalde der Kaliindustrie

Im Rahmen dieser Dissertation wurden die Dynamik und die Kommunikation innerhalb der mikrobiellen Population der Rhizosphäre von Deutschem Weidelgras (Lolium perenne) untersucht, welches auf einer teilweise rekultivierten Rückstandshalde der Kaliindustrie wuchs. Um die niederschlagsbedingte Auswaschung von Salzen zu reduzieren, wird die Rückstandshalde des Kaliwerks Sigmundshall (in Bokeloh bei Hannover) schrittweise mit dem technogenen Abdecksubstrat REKAL/SAV ummantelt. Dieses weist eine hohe Standfestigkeit und Wasserspeicherkapazität auf und kann zudem begrünt werden, wofür als Pionierpflanze Lolium perenne dient. Durch diese Rekultivierung wird Niederschlag besser gespeichert und über Evapotranspiration wieder in die Luft abgegeben, was letztendlich die Bildung von Salzwasser vermindert. Da das Abdecksubstrat neben alkalischem pH-Wert auch teilweise hohe Schwermetallkonzentrationen aufweist, sollte in der vorliegenden Arbeit erstmals die mikrobielle Rhizosphären-Gemeinschaft in diesem extremen Habitat mittels einer kulturunabhängigen Methode erforscht werden. Zudem wurden erste Untersuchungen angestellt, ob im Substrat die zelldichte-abhängige bakterielle Kommunikation (Quorum Sensing) nachgewiesen werden kann. Mittels extrahierter Gesamt-DNA wurde anhand der 16S rDNA die Analyse des „Terminalen Restriktonsfragmentlängenpolymorphismus“ (TRFLP) verwendet, um die komplexe bakterielle Rhizosphären-Gemeinschaft unter zeitlichen und lokalen Aspekten zu vergleichen. Auftretende Veränderungen bei den bakteriellen Populationen der jeweiligen Proben wurden durch eine Zu- oder Abnahme der auch als Ribotypen bezeichneten terminalen Restriktionsfragmente (TRF) erfasst. Hierbei zeigten sich am Südhang der Halde während der Sommermonate der Jahre 2008 und 2009 zwar Schwankungen in den bakteriellen Gemeinschaftsprofilen, es lagen jedoch keine eindeutigen Dynamiken vor. Im Vergleich zum Südhang der Halde wies der Nordhang eine höhere Ribotyp-Diversität auf, was mit der fortgeschritteneren Rekultivierung dieses Haldenabschnitts zusammenhängen könnte. Zusätzlich wurden Bakterien aus der Rhizosphäre von Lolium perenne isoliert und mithilfe der Biosensoren Agrobacterium tumefaciens A136 pCF218 pCF372 und Chromobacterium violaceum CV026 auf die Produktion von N-Acylhomoserinlactonen (AHLs) überprüft. Diese AHLs werden von Gram-negativen Mikroorganismen als Signalmoleküle verwendet, um ihre Genexpression zelldichteabhängig zu kontrollieren. Von den 47 getesteten Gram-negativen Rhizosphärenisolaten konnten nur bei einem reproduzierbar AHL-Moleküle mithilfe des Reporterstamms A. tumefaciens nachgewiesen werden. Der AHL-Produzent wurde als Pseudomonas fluorescens identifiziert. Mittels dünnschichtchromatographischer Analysen konnten die extrahierten bakteriellen AHL-Moleküle den N-Octanoyl-L-homoserinlactonen zugeordnet werden.

Characterization of DnmA, the Dnmt2 homolog in Dictyostelium discoideum

Eukaryotic DNA m5C methyltransferases (MTases) play a major role in many epigenetic regulatory processes like genomic imprinting, X-chromosome inactivation, silencing of transposons and gene expression. Members of the two DNA m5C MTase families, Dnmt1 and Dnmt3, are relatively well studied and many details of their biological functions, biochemical properties as well as interaction partners are known. In contrast, the biological functions of the highly conserved Dnmt2 family, which appear to have non-canonical dual substrate specificity, remain enigmatic despite the efforts of many researchers. The genome of the social amoeba Dictyostelium encodes Dnmt2-homolog, the DnmA, as the only DNA m5C MTase which allowed us to study Dnmt2 function in this organism without interference by the other enzymes. The dnmA gene can be easily disrupted but the knock-out clones did not show obvious phenotypes under normal lab conditions, suggesting that the function of DnmA is not vital for the organism. It appears that the dnmA gene has a low expression profile during vegetative growth and is only 5-fold upregulated during development. Fluorescence microscopy indicated that DnmA-GFP fusions were distributed between both the nucleus and cytoplasm with some enrichment in nuclei. Interestingly, the experiments showed specific dynamics of DnmA-GFP distribution during the cell cycle. The proteins colocalized with DNA in the interphase and were mainly removed from nuclei during mitosis. DnmA functions as an active DNA m5C MTase in vivo and is responsible for weak but detectable DNA methylation of several regions in the Dictyostelium genome. Nevertheless, gel retardation assays showed only slightly higher affinity of the enzyme to dsDNA compared to ssDNA and no specificity towards various sequence contexts, although weak but detectable specificity towards AT-rich sequences was observed. This could be due to intrinsic curvature of such sequences. Furthermore, DnmA did not show denaturant-resistant covalent complexes with dsDNA in vitro, although it could form covalent adducts with ssDNA. Low binding and methyltransfer activity in vitro suggest the necessity of additional factor in DnmA function. Nevertheless, no candidates could be identified in affinity purification experiments with different tagged DnmA fusions. In this respect, it should be noted that tagged DnmA fusion preparations from Dictyostelium showed somewhat higher activity in both covalent adduct formation and methylation assays than DnmA expressed in E.coli. Thus, the presence of co-purified factors cannot be excluded. The low efficiency of complex formation by the recombinant enzyme and the failure to define interacting proteins that could be required for DNA methylation in vivo, brought up the assumption that post-translational modifications could influence target recognition and enzymatic activity. Indeed, sites of phosphorylation, methylation and acetylation were identified within the target recognition domain (TRD) of DnmA by mass spectrometry. For phosphorylation, the combination of MS data and bioinformatic analysis revealed that some of the sites could well be targets for specific kinases in vivo. Preliminary 3D modeling of DnmA protein based on homology with hDNMT2 allowed us to show that several identified phosphorylation sites located on the surface of the molecule, where they would be available for kinases. The presence of modifications almost solely within the TRD domain of DnmA could potentially modulate the mode of its interaction with the target nucleic acids. DnmA was able to form denaturant-resistant covalent intermediates with several Dictyostelium tRNAs, using as a target C38 in the anticodon loop. The formation of complexes not always correlated with the data from methylation assays, and seemed to be dependent on both sequence and structure of the tRNA substrate. The pattern, previously suggested by the Helm group for optimal methyltransferase activity of hDNMT2, appeared to contribute significantly in the formation of covalent adducts but was not the only feature of the substrate required for DnmA and hDNMT2 functions. Both enzymes required Mg2+ to form covalent complexes, which indicated that the specific structure of the target tRNA was indispensable. The dynamics of covalent adduct accumulation was different for DnmA and different tRNAs. Interestingly, the profiles of covalent adduct accumulation for different tRNAs were somewhat similar for DnmA and hDNMT2 enzymes. According to the proposed catalytic mechanism for DNA m5C MTases, the observed denaturant-resistant complexes corresponded to covalent enamine intermediates. The apparent discrepancies in the data from covalent complex formation and methylation assays may be interpreted by the possibility of alternative pathways of the catalytic mechanism, leading not to methylation but to exchange or demethylation reactions. The reversibility of enamine intermediate formation should also be considered. Curiously, native gel retardation assays showed no or little difference in binding affinities of DnmA to different RNA substrates and thus the absence of specificity in the initial enzyme binding. The meaning of the tRNA methylation as well as identification of novel RNA substrates in vivo should be the aim of further experiments.

Die Natur der Naturwissenschaften verstehen

Ein angemessenes Verständnis der Natur der Naturwissenschaften stellt eine zentrale Kompetenz naturwissenschaftlicher Grundbildung („Scientific Literacy“) dar und ist im Rahmen des Kompetenzbereichs Erkenntnisgewinnung in den nationalen Bildungsstandards in den naturwissenschaftlichen Fächern verankert. Schülerinnen und Schüler sollen demnach in der Schule Lernerfahrungen über die Grundzüge und Grenzen naturwissenschaftlicher Erkenntnisgewinnung und naturwissenschaftlichen Wissens erlangen. In dieser Arbeit liegen vier Studien vor, die sich mit Aspekten des Verstehens der Natur der Naturwissenschaften von Schülerinnen und Schülern in der Sekundarstufe I beschäftigen. In der ersten Studie, die die Entwicklung eines quantitativen Messinstruments im Blick hat, wird die Kompetenzstruktur theoretisch modelliert und empirisch überprüft. Faktorenanalytisch nachweisbare Dimensionen sind die Herkunft, Sicherheit, Entwicklung, Rechtfertigung und Einfachheit naturwissenschaftlichen Wissens, der Zweck der Naturwissenschaften und die Kreativität von Naturwissenschaftlern. Die zweite Studie nimmt den Entwicklungsaspekt des Naturwissenschaftsverständnisses in den Fokus. Lernende zeigen sowohl im längsschnittlichen Vergleich eines Schuljahres als auch im querschnittlichen Vergleich verschiedener Jahrgangsstufen einen Zuwachs hin zu höheren Klassenstufen auf. Jüngere Lernende zeigen bereits angemessene Ansichten, allerdings sind die Konzepte älterer Schülerinnen und Schüler als stabiler anzusehen als die Ansichten der Lernenden in jüngeren Jahrgangsstufen. In der dritten Studie wird die Kontextabhängigkeit des Naturwissenschaftsverständnisses untersucht. Es kann ein Zusammenhang berichtet werden zwischen den selbst berichteten Kenntnissen der Jugendlichen und ihrem Naturwissenschaftsverständnis sowie zwischen den berichteten Vorstellungen zu spezifischen Kontexten und allgemeinen Vorstellungen über die Natur der Naturwissenschaften. Abschließend wird die Bedeutung des Naturwissenschaftsverständnisses für den Erwerb wissenschaftsmethodischer Kompetenzen in den Blick genommen. Zusammenhänge zwischen den Konstrukten deuten auf inhaltliche Schnittstellen sowie Unterschiede im Kompetenzerwerb hin. Aus den Befunden lassen sich Folgerungen für eine adäquate Vermittlung von Kompetenzen des Naturwissenschaftsverständnisses ableiten. Dimensionen der Natur der Naturwissenschaften sollten sich kumulativ aufbauend in das Curriculum integrieren sowie in Bezug zum forschenden Lernen und der Vermittlung von Fachkonzepten explizit reflektiert werden.

Lipid Droplets in Dictyostelium discoideum

Lipid Droplets dienen zur Speicherung von Neutrallipiden wie z. B. Triglyceriden und Sterolestern. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde die Bildung dieser zellulären Fettspeicher in D. discoideum untersucht. Es konnte herausgefunden werden, dass Lipid Droplets entstehen, wenn die Zellen entweder in einer Suspension von Bakterien oder in Gegenwart von Palmitinsäure kultiviert werden. Die Bildung der Lipidtröpfchen wird dabei von einem schnelleren Zellwachstum, einem Anstieg des Triglyceridgehalts, einer Reduktion der Phagozytoserate und einer Abnahme des Zellvolumens begleitet. Wurde die Lipid Droplet-Bildung durch Kultivierung der Zellen mit Palmitinsäure angeregt, entsteht neben Triglyceriden noch eine weitere Verbindung, bei der es sich entweder um Fettsäureethylester oder Wachsester handelt. Eine weitere Eigenschaft von Zellen, die in Gegenwart der Palmitinsäure inkubiert wurden, ist die Fähigkeit exogene Fettsäuren schneller aufzunehmen, als normal kultivierte Zellen. Aus der vorliegenden Arbeit wurde gefolgert, dass dies durch eine zusätzliche Aufnahme der Fettsäuren über die Plasmamembran hervorgerufen wird. In Zellen, die ohne Fettsäuren inkubiert wurden, findet hingegen der Fettsäureimport über die Endosomen statt. Ein Protein, das nicht direkt am Prozess der Fettsäureaufnahme beteiligt ist, aber importierte Fettsäuren mit CoA aktiviert, ist die LC-FACS1. Aus Versuchen mit der Knockout-Mutante ging hervor, dass die aktivierten Fettsäuren, in Zellen, die zuvor mit Palmitinsäure oder Bakterien inkubiert wurden, in Triglyceride eingebaut werden. Der reduzierte Triglyceridgehalt im Knockout rief eine Erhöhung der Phagozytoserate hervor. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden die Lipidtröpfchen mit einem Saccharosegradienten aufgereinigt. Mit Hilfe der Massenspektrometrie konnten 281 Proteine in der Lipid Droplet-Fraktion identifiziert werden. Ein Teil dieser Proteine könnte durch die Interaktion der Lipidtröpfchen mit anderen Organellen in die Lipid Droplet-Fraktion gelangt sein und ist ebenso wenig Teil des Lipid Droplet-Proteoms wie die zytoplasmatischen Proteine, die eine Verunreinigung darstellen. Vier der zehn Proteine aus der Lipid Droplet-Fraktion, die in der vorliegenden Arbeit untersucht wurden, konnten nach Kultivierung in palmitinsäurehaltigem Medium tatsächlich auf der Oberfläche der Lipidtröpfchen beobachtet werden. Eines dieser Proteine ist LSD1. Es stellt das einzige PAT-Protein in D. discoideum dar und gehört der Kategorie der CPATs an. Analog zu Perilipin/PLIN1 und Adipophilin/PLIN2 könnte LSD1 eine Schutzfunktion der Lipid Droplets vor zytoplasmatischen Lipasen haben. Neben DdLSD1 konnten auch die Proteine ADH und ALI auf den Lipidtröpfchen lokalisiert werden. Bei beiden handelt es sich um 17beta-Hydroxysteroid-Dehydrogenasen - Proteine, die eine Funktion im Lipid- oder Fettsäuremetabolismus besitzen können. Das Protein SMT katalysiert die C24-Methylierung des Sterolgerüsts in D. discoideum und war nach Inkubation der Zellen mit exogenen Fettsäuren ebenfalls auf den Lipid Droplets zu beobachten.

Artificial micro RNA system in Dictyostelium discoideum

Dictyostelium discoideum is a social amoeba that serves as a model system for RNA interference and related mechanisms. Its position between plants and animals enables evolutionary snapshot of mechanisms and protein machinery involved in investigated subjects. MiRNAs are small regulatory RNAs that are evolutionary conserved and present in animals, plants, viruses and some prokaryotes. They have roles in development, cell growth and differentiation, apoptosis and their miss-regulation is associated with many diseases such as cancer, neurodegenerative disorders and diabetes. Recently, through sequencing of DNA libraries miRNAs have been discovered in D. discoideum. In this work, it has been shown that heterologues miRNA let-7 can be expressed and processed in D. discoideum. Expression of let-7 miRNA in social amoeba resulted in a strong developmental phenotype suggesting an overload of the processing/silencing system or/and endogenous targets. The various effects on prel-7 strain have been observed and characterized, serving as a background for postulation of miRNA roles. An artificial miRNA system has been established and imposed to D. discoideum, showing that miRNAs in Dictyostelium could mediate gene expression on the level of mRNA stability and on the posttranscriptional level. Furthermore, presence of translational inhibition as a type of gene control was shown for the first time in this organism. Due to it new structures representing co-localities of miRNA and target mRNA have been detected. Taken together, this work shows functional artificial miRNA system and postulates roles of endogenous small RNA in social amoeba.

Regulation und Koordination der Proteinkinase A im cAMP-vermittelten Signalweg

Die cAMP-abhängige Proteinkinase ist an der Regulation grundlegender zellulärer Prozesse, wie Entwicklung und Differenzierung, sowie Stoffwechselprozessen, beteiligt. Das Holoenzym bestehend aus einem Dimer regulatorischer (R) und zwei katalytischer C (C) Untereinheiten wird durch den sekundären Botenstoff cAMP reguliert. Die molekulare Grundlage der Holoenzymdynamik, sowie die räumliche und zeitliche Koordination der Holoenzyme in der cAMP-vermittelten Signaltransduktion sind zentrale Themen der aktuellen Forschung. Die Dynamik wird in erster Linie durch die cAMP-Konzentration, die Isoenzymzusammensetzung und die Verfügbarkeit von Kinasesubstraten bestimmt. Klassischerweise wurde die Holoenzymdynamik auf Grundlage der Phosphotransferaseaktivität der C Untereinheit untersucht. Der Effekt von Substrat auf die apparenten Aktivierungskonstanten (cAMP) konnte aber so nicht bestimmt werden, sodass in dieser Arbeit eine alternative Methode entwickelt werden musste, die unabhängig von der Messung der Substratphosphorylierung ist. Eine Validierung dieser SPR-basierten Methode erfolgte mit Typ-I Holoenzym, wobei eine leichtere Aktivierung in Gegenwart von Substrat bestätigt werden konnte. Überraschenderweise wurde mit dieser Methode der umgekehrte Effekt von Substratpeptid auf die Aktivierung des Typ-II Holoenzyms gemessen, wobei mit steigender Substratkonzentration größere apparente Aktivierungskonstanten bestimmt wurden. Durch gerichtete Mutationen der P0-Stelle in der Autoinhibitionsdomäne konnte diese Position als eine Hauptdeterminante für die Dynamik der Holoenzyme identifiziert werden. Im Allgemeinen führen Pseudosubstratinhibitoren (RI, RIIS99A) in Abhängigkeit von der Substratkonzentration zu einer Verkleinerung, und Substratinhibitoren (RII, RIA99S) zu einer Vergrößerung der apparenten Aktivierungskonstanten der entsprechenden Holoenzyme. Bei Untersuchungen zum Phosphostatus der hRII im Holoenzymkomplex sowie während der Dissoziation in Gegenwart oder Abwesenheit von Substrat, konnte mit Serin 58 eine zweite Autophosphorylierungsstelle in der Linkerregion identifiziert werden, die ein deutlich langsameres Laufverhalten in der SDS PAGE hervorruft. Allerdings konnte dieser Stelle keine Funktion im Bezug auf die Interaktion mit der katalytischen Untereinheit sowie ausgewählten AKAPs zugesprochen werden. In dieser Arbeit konnte ein gegensätzlicher Mechanismus zur Feinregulation der Dynamik des Typ-I und –II Holoenzyms durch Substrat gezeigt und die molekulare Grundlage aufgeklärt werden. Diese bisher nicht beschriebene Autophosphorylierungsstelle könnte eine wichtige Rolle in der Konformationskontrolle des N-Terminus spielen, oder als Plattform zur Wechselwirkung mit bisher unbekannten Interaktionspartnern der hRII dienen.

Dynamic characterization of olfactory receptors in the fruit fly Drosophila melanogaster

Temporal changes in odor concentration are vitally important to many animals orienting and navigating in their environment. How are such temporal changes detected? Within the scope of the present work an accurate stimulation and analysis system was developed to examine the dynamics of physiological properties of Drosophila melanogaster olfactory receptor organs. Subsequently a new method for delivering odor stimuli was tested and used to present the first dynamic characterization of olfactory receptors at the level of single neurons. Initially, recordings of the whole antenna were conducted while stimulating with different odors. The odor delivery system allowed the dynamic characterization of the whole fly antenna, including its sensilla and receptor neurons. Based on the obtained electroantennogram data a new odor delivery method called digital sequence method was developed. In addition the degree of accuracy was enhanced, initially using electroantennograms, and later recordings of odorant receptor cells at the single sensilla level. This work shows for the first time that different odors evoked different responses within one neuron depending on the chemical structure of the odor. The present work offers new insights into the dynamic properties of olfactory transduction in Drosophila melanogaster and describes time dependent parameters underlying these properties.

Untersuchungen zur Bedeutung der PKA für die Spermatogenese in Drosophila melanogaster

Für die cAMP-abhängige Proteinkinase (Proteinkinase A, PKA) in Drosophila melanogaster sind zwei regulatorische Untereinheiten (R1 und R2) und drei katalytische Untereinheiten (C1, C2 und C3) beschrieben. Außerdem gibt es eine weitere mögliche katalytische Untereinheit mit einer auffälligen Ähnlichkeit zu C2, dementsprechend C2-like genannt. Für R2, C2 und C2-like konnte bereits gezeigt werden, dass sie im Hodengewebe synthetisiert werden. Die Expression der verbleibenden PKA-Untereinheiten im Hodengewebe wurde in dieser Arbeit mit Hilfe von RT-PCR, Northern-Hybridisierungen, GFP-Reporter- bzw. GFP-Fusionskonstrukten untersucht. So konnte gezeigt werden, dass alle PKA-Untereinheiten im Hoden exprimiert werden. Dabei wird von jeder Untereinheit mindestens eine Isoform in den Keimzellen synthetisiert. R2 und C1 treten außerdem in den die Keimzellen umschließenden Zystenzellen auf, wobei R2 während der gesamten Spermatogenese exprimiert wird, C1 jedoch nur am Ende des Prozesses während des Stadiums der elongierten Spermatiden. In BRET-Analysen sind die beiden Untereinheiten in der Lage, miteinander zu interagieren. Somit könnten sie zusammen eine Funktion in den Zystenzellen vermitteln, die während der Differenzierungsphase stattfindet. Die katalytischen Untereinheiten C2, C2-like und zwei Isoformen von C3 (B und B') werden keimzellspezifisch exprimiert. Die BRET-Analysen lassen darauf schließen, dass C2 und C3 B’ möglicherweise keine funktionellen PKA-Untereinheiten sind. Auch der Versuch, durch Antisense- und RNAi-Konstrukte einen mutanten Phänotyp zu erzeugen, schlug fehl. Das könnte ein Hinweis darauf sein, dass die beiden Untereinheiten C2 und C3 B’ gar keine oder zumindest keine essentielle Funktion während der Spermatogenese haben. Das C2-like as-Konstrukt führte hingegen zu einem starken Phänotyp. Schon eine geringe Reduktion der endogenen c2-like-mRNA führte zu einer starken Beeinträchtigung der männlichen Fertilität. Die elongierten Spermatiden zeigten einen Defekt in der Kernmorphologie und waren nicht in der Lage, Individualisierungskomplexe auszubilden. Dementsprechend fand keine Individualisierung statt und es konnten keine reifen Spermien in die Samenblase entlassen werden. Der mutante Phänotyp weist darauf hin, dass C2-like an mehreren Prozessen während der Keimzelldifferenzierung beteiligt ist. Gao et al. veröffentlichten 2008 Listen mit potentiellen PKA-Substraten für alle bekannten katalytischen Untereinheiten verschiedener Organismen. Zwei Substrat-Kandidaten für C2-like sind die testisspezifischen Serin/Threonin-Kinasen (TSSK) CG9222 und CG14305. Beide Proteine werden exklusiv im Hoden exprimiert. CG9222-GFP lokalisierte in die Individualisierungskomplexe (ICs) elongierter Spermatiden. Das entsprechende RNAi-Konstrukt zeigte allerdings keinen Effekt auf den Zusammenbau der ICs. Dagegen zeigte CG14305-GFP keine subzelluläre Lokalisierung, sondern war cytoplasmatisch über die gesamten Spermatiden verteilt. Das entsprechende RNAi-Konstrukt führte aber dazu, dass keine ICs ausgebildet werden. Beide Proteine spielen dementsprechend eine Rolle während der Individualisierung. Dies ist in Übereinstimmung mit dem Phänotyp der C2-like as-mutanten Männchen. So ist es vorstellbar, dass CG9222 und CG14305 von C2-like phosphoryliert werden müssen, um ihre Funktion während der Individualisierung der Spermatiden erfüllen zu können. Ein direkter Nachweis, dass C2-like die beiden Proteine tatsächlich phosphorylieren kann, steht allerdings noch aus.

Charakterisierung potentiell positiver Regulatoren der Phagozytose in Dictyostelium discoideum und deren Funktion in einem Signalweg zwischen endosomaler Verdauung und Partikelaufnahme

Dictyostelium discoideum ernährt sich in seinem natürlichen Habitat, dem Waldboden, vorwiegend von Bakterien. Diese werden aus der Umgebung über Phagozytose aufgenommen und unter anderem mit Hilfe von Lysozymen verdaut. Eines dieser Lysozyme, AlyA, wurde bereits in vorhergehenden Arbeiten detailliert untersucht. Sein Fehlen resultierte in einer zeitabhängigen Vergrößerung der Fresshöfe in Bakterienrasen. Zusätzlich waren in diesen Knockout-Mutanten auch die Phagozytoserate und die Expression eines zweiten lysosomalen Enzyms (Gp70) erhöht. Die Überexpression dieser Esterase in wildtypischen Zellen bewirkte ebenfalls, dass Partikel aus der Umgebung effektiver aufgenommen werden konnten. Da die AlyA-Mutanten und die Gp70-Überexprimierer ähnliche Phänotypen zeigten, die Proteine aber in unterschiedlichen lysosomalen Vesikeln lokalisieren, müssen weitere Proteine an der Ausbildung der Phänotypen beteiligt sein. Aus diesem Grund wurden die Genexpressionen beider Mutanten verglichen. Über Microarray-Analysen sollten auf diese Weise weitere Proteine identifiziert werden, die eine Weiterleitung des Signals von AlyA über Gp70 bis hin zur Plasmamembran vermitteln. Einigen der potentiellen Kandidaten konnte anhand der Untersuchung von Mutanten bereits eine Weiterleitung des Signals zwischen Gp70 und der erhöhten Phagozytose an der Plasmamembran zugeordnet werden. Um jedoch mehr über die Signalkette oberhalb von Gp70 zu erfahren, wurden im Rahmen dieser Arbeit drei Proteine untersucht. Die Expression von DD3-3, SSD673 und SSD485 war in den AlyA-Mutanten erhöht, in den Gp70-Überexprimierern jedoch unverändert. Durch Herstellung und Untersuchung von überexprimierenden Mutanten wurde die Wirkung jedes Proteins auf die Gp70-Expression, das Phagozytoseverhalten und den Durchmesser der Fresshöfe analysiert. Die Markierung der Kandidaten mit dem Myc-Epitop sollte deren subzelluläre Lokalisation klären. Für DD3-3-überexpimierende Klone konnte in dieser Arbeit allerdings keine Veränderung gegenüber wildtypischen Zellen festgestellt werden. Sie zeigt allerdings, dass Medium von SSD673-überexprimierenden Zellen die Phagozytoserate wildtypischer Zellen leicht erhöht. Eine starke SSD673myc-Expression führte auch zu einer verstärkten Aufnahme von Hefezellen. Die Gp70-Expression in Gesamtzelllysaten der SSD673-Mutanten blieb jedoch unverändert. Wurde in Wildtypzellen hingegen SSD485 im Übermaß exprimiert, so führte dies zu einer verstärkten Partikelaufnahme. Diese entwickelte sich ähnlich den AlyA-Knockout-Mutanten in Abhängigkeit der Zeit und ging mit einer erhöhten Gp70-Expression einher. In dieser Arbeit konnte folglich zwei von drei Proteinen eine positive Wirkung auf die Phagozytose nachgewiesen werden. SSD485-Mutanten erfüllten darüber hinaus die Bedingungen für eine Weiterleitung des AlyA-Signals von SSD485 auf Gp70 bis hin zu einer erhöhten Phagozytose.

Untersuchung zum Phosphorylierungsstatus der katalytischen Untereinheit der PKA mittels proteomischer Techniken

ZUSAMMENFASSUNG: Das Phosphorylierungsmuster eines Proteins ist kein statischer Zustand, sondern vielmehr ein dynamischer Status, den es in der modernen funktionellen (Phospho-) Proteomik und Analytik abzubilden gilt. Klassischerweise erfolgt der Nachweis der Proteinphosphorylierung auf Peptid-Ebene mittels MS/MS Sequenzierung. Diese Standardmethode der shotgun Phosphoproteomanalytik vernachlässigt jedoch wegen den in LC MS/MS Analysen oftmals schwer detektierbaren Phosphopeptiden gerade den variablen und oftmals nur geringen Phosphorylierungsgrad vieler Phosphorylierungsstellen (P-Stellen). Mittels phosphospezifischer Anreicherungsstrategien und MS/MS Sequenzierung konnten an der Modellkinase PKA-Cα nach rekombinanter Expression in E. coli insgesamt acht P-Stellen identifiziert werden. Der Phosphorylierungsgrad wurde in Kooperation mit Dr. J. Seidler über quantitative Signalintensitätsmessungen bestimmt und zeigte eine nahezu vollständige Phosphorylierung von pS10, pS139, pT197 und pS338, während der Phosphorylierungsgrad für pS34, pS53, pS65 und pS259 zwischen <5 und 45 % variierte. Neben der Quantifizierung der P-Stellen wurde auch das Auftreten und die Verteilung definierter Phosphoformen der PKA-Cα untersucht und deren Abhängigkeit von der primären Aminosäureabfolge, dem Auftreten von zusätzlichen Modifikationen sowie den gewählten Expressions- und Reinigungsbedingungen aufgezeigt. Endogene, aus Säugergewebe isolierte PKA-Cα wies nur eine einzige Phosphoform mit den P-Stellen pT197 und pS338 auf. Auch in vitro autophosphorylierte rekombinante PKA-Cα, die zuvor dephosphoryliert worden war, wies eine zweifach modifizierte Phosphoform auf. Im Vergleich zum endogenen Protein ließ sich dieses Protein an S10 und S338 exzessiv phosphorylieren, wohingegen an T197 keine Autophosphorylierung nachzuweisen war. Das Ausbleiben weiterer Phosphorylierungen stellt in Frage, ob die Hyperphosphorylierung in E. coli ausschließlich auf Autophosphorylierungsprozessen beruht, was anhand einer nicht phosphorylierten, katalytisch inaktiven Variante von PKA-Cα (PKA-Cα K72H) vermutet wurde. Im Hinblick auf die funktionellen P-Stellen pT197 und pS338 erfordert diese Entdeckung sowie der unabhängige Nachweis, dass zellfrei exprimierte PKA-Cα nur an S338 phosphoryliert ist, eine Modifizierung des sequenziellen Vorhersagemodells, wonach die Phosphorylierung an T197 eine zwingende Voraussetzung für die nachfolgende Phosphorylierung an S338 ist. Ferner konnte über phosphomimetische Mutagenese die Funktionalität der Phosphorylierung an S53 innerhalb der glycinreichen Schleife der PKA-Cα und somit ein potenzieller Weg zur Regulation der enzymatischen Aktivität gezeigt werden. Ein weiterer möglicher upstream Regulator von PKA-Cα ist die Proteinphosphatase 5, die in der Lage war, die bislang als phosphatasestabil beschriebene P Stelle pT197 in vitro zu dephosphorylieren. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass der Phosphorylierungszustand eines Proteins von zahlreichen internen und externen Faktoren abhängt – eine Tatsache, die gerade für rekombinante Proteine, insbesondere enzymatisch aktive Kinasen, oft vernachlässigt wurde. Daher müssen auch in der shotgun Phosphoproteomanalytik P-Stellen nicht mehr nur identifiziert und quantifiziert werden, sondern die resultierenden Proteinphosphoformen differenziert auch in ihrem physiologischen Kontext beschrieben werden.

Biologische Funktionsanalyse und Identifizierung neuer Substrate der Methyltransferase Dnmt2

Obwohl die DNA Methyltransferase 2 (Dnmt2) hoch konserviert ist und zu der am weitesten verbreiteten eukaryotischen MTase-Familie gehört, ist ihre biologische Funktion nach wie vor unklar. Nachdem lange Zeit keine DNA Methylierungsaktivität nachgewiesen werden konnte, wurde vor einigen Jahren über geringe Mengen an 5-Methylcytosin (5mC) in Retroelementen der “Dnmt2-only”-Organismen D. melanogaster, D. discoideum und E. histolytica berichtet (Kunert et al. 2003; Fisher et al. 2004; Kuhlmann et al. 2005; Phalke et al. 2009). Als kurze Zeit später robuste Methylierung der tRNAAsp durch humane Dnmt2 gezeigt wurde (Goll et al. 2006), wurde zunächst eine Dualspezifität des Enzyms vorgeschlagen (Jeltsch et al. 2006). Neuere Daten zum 5mC-Status verschiedener „Dnmt2-only“-Organismen bilden Anlass für kontroverse Diskussionen über Ausmaß und Bedeutung der DNA Methyltransferaseaktivität von Dnmt2 (Schaefer et al. 2010a; Krauss et al. 2011). Die vorliegende Arbeit konzentriert sich auf die Identifizierung neuer RNA Substrate des Dnmt2-Homologs DnmA aus D. discoideum sowie die biologische Bedeutung der tRNA-Methylierung durch Dnmt2. Wie in anderen Organismen beschrieben, fungiert auch DnmA als tRNAAsp(GUC) MTase in vitro und in vivo. Zusätzlich konnte in vitro tRNAGlu(UUC) als neues Substrat der Dnmt2-Homologe aus D. discoideum und dem Menschen identifiziert werden. In einem Kooperationsprojekt wurde außerdem auch tRNAAsp-Methylierungsaktivität für das Dnmt2-Homolog aus S. pombe (Pmt1) nachgewiesen. Crosslink-RNA-Immunopräzipitationen (RNA-CLIP) mit anschließender Next-Generation-Sequenzierung der mit DnmA assoziierten RNAs zeigen, dass DnmA mit tRNA Fragmenten interagiert, die sich vom Anticodonloop bis in den T-loop erstrecken. Neben der tRNAAsp(GUC) und tRNAGlu(UUC/CUC) sind Fragmente der tRNAGly(GCC) verstärkt angereichert. Inwiefern diese Fragmente eine biologische Funktion haben oder spezifische Degradationsprodukte darstellen, ist noch ungeklärt. Interessanterweise sind von einigen tRNAs wenige Sequenzen von antisense-Fragmenten in den RNA-CLIP Daten zu finden, die etwas kürzer, jedoch exakt komplementär zu den genannten sense-Fragmenten sind. Besonders stark sind diese Fragmente der tRNAGlu(UUC) vertreten. In einem weiteren RNA-CLIP Experiment wurden U-snRNAs, snoRNA und intergenische Sequenzen mit DnmA angereichert. Bei nachfolgenden in vitro Methylierungsstudien konnte ausschließlich die U2-snRNA als potentielles Nicht-tRNA-Substrat der hDnmt2 und DnmA identifiziert werden. Da tRNA Modifikationen im Anticodonloop die Codonerkennung beeinflussen können, wurde ein System etabliert um die Translationseffizienz eines GFP-Reportergens in Wildtyp- und dnmAKO-Zellen zu messen. In D. discoideum wird das Aspartat-Codon GAU ca. zehnmal häufiger genutzt als das GAC Codon, allerdings ist nur eine tRNAAsp(GUC) im Genom der Amöbe kodiert. Aus diesem Grund wurde zusätzlich die Frage adressiert, inwiefern die DnmA-abhängige Methylierung dieser tRNA das „Wobbling“ beeinflusst. Dazu wurde dem Reportergen jeweils eine (GAU)5- und (GAC)5-Leadersequenz vorgeschaltet. Entgegen der Annahme wurde der (GAC)5-Leader in beiden Stämmen etwas effizienter translatiert. Insgesamt zeigte der dnmAKO-Stamm eine leicht erhöhte Translationseffizienz der Reportergene. Vergleichende Analysen zur Aufnahme von Fremd-DNA zeigten signifikant reduzierte Transformationseffizienzen mit einem integrierenden Plasmid in dnmAKO-Zellen. Ein weiterer dnmAKO-Stamm zeigte diesen Effekt jedoch nicht, wobei bei derselben Mutante eine deutlich reduzierte Aufnahme eines extrachromosomalen Plasmids zu verzeichnen war. Untersuchungen zum Einfluss von DnmA auf die Regulation des Retroelements skipper ergaben keinen Zusammenhang zwischen der Generierung kleiner RNAs und der erhöhten Transkription des Retrotransposons in dnmAKO-Zellen (Kuhlmann et al. 2005). Durch Kompensationsversuche sowie Experimente mit einer weiteren dnmAKO-Mutante konnte die Mobilisierung des Retrotransposons nicht eindeutig als DnmA-Funktion eingeordnet werden. In einem weiteren Projekt wurden die Bindung des m5C-bindenden Proteins EhMLBP aus E. histolytica an DNA mittels Rasterkraftmikroskopie abgebildet (Lavi et al. 2006). Neben vermutlich unspezifischen Endbindungsereignissen konnte eine bevorzugte Bindungsstelle des Proteins an LINE DNA (long intersperesed nuclear element) identifiziert werden. Möglicherweise fällt diese mit einem von zwei A/T-reichen Bereichen der LINE DNA zusammen, von denen vermutet wird, dass diese für die Bindung von EhMLBP an DNA von Bedeutung sind. Insgesamt bestätigen die Ergebnisse dieser Arbeit die tRNAAsp Methylierungsaktivität als konservierte Dnmt2-Funktion. Darüber hinaus erweitern sie das Substratspektrum der Dnmt2-Methyltransferasen im Bereich der tRNA. Außerdem wird erstmals ein potentielles Nicht-tRNA Substrat vorgeschlagen. Zusätzlich geben neu entdeckte Phänotypen Hinweise auf vielfältige zelluläre Dnmt2-Funktionen.

Fütterungsbedingte mikrobielle Zusammensetzung von Rinderkot und deren Einfluss auf Gasemissionen und N-Mineralisierung im Boden

Um die Nährstoffeffizienz im Boden zu erhöhen und klimarelevante Gasemissionen zu minimieren, sind quantitative Informationen zu den C- und N-Fraktionen im Kot sowie deren Mineralisierungspotential nötig. Da über die Hälfte des fäkalen N mikrobiell gebunden ist, sind Methoden zur Bestimmung der mikrobiellen Kotqualität hilfreich. Ziele der ersten Publikation waren die Anwendung der CFE-Methode zur Bestimmung der mikrobiellen Biomasse in Rinderkot, Ergosterolbestimmung als Marker für die pilzliche Biomasse und Aminozuckernachweis zur Analyse der mikrobiellen Gemeinschaftsstruktur (pilzliches Glucosamin und bakterielle Muramin-säure). Mit Hilfe der CFE-Methode sollten lebende Mikroorganismen im Kot, inklusive Bakterien, Pilze und Archaeen, erfasst werden. Verschiedene Extraktionsmittel wurden für diese Methode getestet, um stabile Extrakte und reproduzierbare mikrobielle Biomasse-C- und -N-Gehalte zu erhalten. Der Einsatz von 0.05 M CuSO4 als Extraktionsmittel löste vorherige Probleme mit der Extraktion CHCl3-labiler N-Komponenten und sorgte für stabile Kotextrakte. Die Methoden wurden in einem Kotinkubationsexperiment bei 25 °C verglichen. Mikrobielle Parameter zeigten dynamische Charakteristika und mögliche Verschiebungen innerhalb der mikrobiellen Gemeinschaft. Im Kot von Färsen betrug das mittlere C/N-Verhältnis 5,6 und der mittlere Cmik/Corg-Quotient 2,2%, das Verhältnis von Ergosterol zum mikrobiellen Biomasse-C war 1,1‰. Ergosterol und Aminozuckeranalyse ergaben einen signifikanten Pilzanteil von über 40% des mikrobiellen Gesamt-C. Für die Analyse mikrobieller Parameter in Rinderkot erwiesen sich alle getesteten Methoden als geeignet. Diese wurden für die folgenden Fütterungsversuche weiter unabhängig voneinander angewendet und verglichen. Die zweite Publikation verglich eine N-defizitäre (ND) und eine ausgeglichene N-Bilanz (NB) bei der Fütterung von Milchkühen unter Berücksichtigung der Kot-inhaltsstoffe, der mikrobiellen Parameter und der Verdaulichkeit. Unterschiede zwischen Individuen und Probennahmetagen wurden ebenfalls miteinbezogen. Mittlerer mikrobieller Biomasse-C- und -N-Gehalt war 37 bzw. 4,9 mg g-1 TM. Der Pilzanteil lag diesmal bei 25% des mikrobiellen Gesamt-C. Die Fütterung zeigte signifikante Effekte auf die Kotzusammensetzung. Das fäkale C/N-Verhältnis der NB-Fütterung war signifikant niedriger als bei ND. Gleiches gilt für das C/N-Verhältnis der mikrobiellen Biomasse mit jeweils 9.1 und 7.0 für ND und NB. Auch die Verdaulichkeit wurde durch die Fütterung beeinflusst. Unverdauter Futterstickstoff, Faserstoffe (NDF) und Hemi-cellulose waren in der ND-Behandlung signifikant erhöht. Einige Parameter zeigten nur einen Einfluss der Probennahmetage, mit den angewendeten Methoden gelang jedoch der eindeutige Nachweis der Fütterungseffekte auf mikrobielle Parameter im Rinderkot, wobei sich die Fütterung in nur einer Variable unterschied. Weitere Fütterungseinflüsse auf die Kotqualität wurden schließlich auch für Rinder unterschiedlicher Leistungsstufen erforscht. Hier waren die Unterschiede in der Fütterung wesentlich größer als in den vorhergehenden Experimenten. Der Kot von Färsen, Niederleistungs- und Hochleistungskühen sowie dessen Einfluss auf N2O-Emissionen, N-Mineralisierung und pflanzliche N-Aufnahme wurden untersucht. Die Färsenfütterung mit geringem N- und hohem ADF-Anteil führte zu pilzdominiertem Kot. Besonders im Vergleich zum Kot der Hochleistungskühe war der Gehalt an mikrobiellem Biomasse-C niedrig, in Verbindung mit einem breiten mikrobiellen C/N-Verhältnis und hohem Ergosterolgehalt. Eingemischt in Boden zeigte Färsenkot die niedrigste CO2-Produktion und höchste N-Immobilisierung sowie niedrigste N2O-Emissionen während einer 14-tägigen Inkubation bei 22 °C. In einem 62-Tage-Gefäßversuch mit Welschem Weidelgras waren der Trocken-masseertrag und die pflanzliche Stickstoffaufnahme in den Färsenbehandlungen am niedrigsten. Die Stickstoffaufnahme durch die Pflanzen korrelierte positiv mit der Stickstoffkonzentration im Kot und negativ mit dem Rohfasergehalt, aber auch negativ mit dem C/N-Verhältnis der mikrobiellen Biomasse und dem Verhältnis von pilzlichem zu bakteriellem C. Mikrobielle Parameter im Kot zeigten einen größeren Zusammen-hang mit der pflanzlichen Stickstoffaufnahme als die mikrobiellen Bodenparameter.

MEMS-based Tunable Optical Filter Arrays for Nano-Spectrometer in the Visible Spectral Range

Optische Spektrometer sind bekannte Instrumente für viele Anwendungen in Life Sciences, Produktion und Technik aufgrund ihrer guten Selektivität und Sensitivität zusammen mit ihren berührungslosen Messverfahren. MEMS (engl. Micro-electro-mechanical system)-basierten Spektrometer werden als disruptive Technologie betrachtet, in der miniaturisierte Fabry-Pérot Filter als sehr attraktiv für die optische Kommunikation und 'Smart Personal Environments', einschließlich des medizinischen Anwendungen, zu nennen sind. Das Ziel dieser Arbeit ist, durchstimmbare Filter-Arrays mit kostengünstigen Technologien herzustellen. Materialien und technologische Prozesse, die für die Herstellung der Filter-Arrays benötigt werden, wurden untersucht. Im Rahmen dieser Arbeit, wurden durchstimmbare Fabry Pérot Filter-Arrays für den sichtbaren Spektralbereich untersucht, die als Nano-Spektrometer eingesetzt werden. Darüber hinaus wurde ein Modell der numerischen Simulation vorgestellt, die zur Ermittlung eines optimales geometrisches Designs verwendet wurde, wobei sich das Hauptaugenmerk der Untersuchung auf die Durchbiegung der Filtermembranen aufgrund der mechanischen Verspannung der Schichten richtet. Die geometrische Form und Größe der Filtermembranen zusammen mit der Verbindungsbrücken sind von entscheidender Bedeutung, da sie die Durchbiegung beeinflussen. Lange und schmale Verbindungsbrücken führen zur stärkeren Durchbiegung der Filtermembranen. Dieser Effekt wurde auch bei der Vergrößerung der Durchmesser der Membran beobachtet. Die Filter mit spiralige (engl. curl-bent) Verbindungsbrücken führten zu geringerer Deformation als die mit geraden oder gebogenen Verbindungsbrücken. Durchstimmbare Si3N4/SiO2 DBR-basierende Filter-Arrays wurden erfolgreich hergestellt. Eine Untersuchung über die UV-NIL Polymere, die als Opferschicht und Haltepfosten-Material der Filter verwendet wurden, wurde durchgeführt. Die Polymere sind kompatibel zu dem PECVD-Verfahren, das für die Spiegel-Herstellung verwendet wird. Die laterale Strukturierung der DBR-Spiegel mittels des RIE (engl. Reactive Ion Etching)-Prozesses sowie der Unterätz-Prozess im Sauerstoffplasma zur Entfernung der Opferschicht und zum Erreichen der Luftspalt-Kavität, wurden durchgeführt. Durchstimmbare Filter-Arrays zeigten einen Abstimmbereich von 70 nm bei angelegten Spannungen von weniger als 20 V. Optimierungen bei der Strukturierung von TiO2/SiO2 DBR-basierenden Filtern konnte erzielt werden. Mit der CCP (engl. Capacitively Coupling Plasma)-RIE, wurde eine Ätzrate von 20 nm/min erreicht, wobei Fotolack als Ätzmaske diente. Mit der ICP (engl. Inductively Coupling Plasma)-RIE, wurden die Ätzrate von mehr als 60 nm/min mit einem Verhältniss der Ar/SF6 Gasflüssen von 10/10 sccm und Fotolack als Ätzmasken erzielt. Eine Ätzrate von 80 bis 90 nm/min wurde erreicht, hier diente ITO als Ätzmaske. Ausgezeichnete geätzte Profile wurden durch den Ätzprozess unter Verwendung von 500 W ICP/300 W RF-Leistung und Ar/SF6 Gasflüsse von 20/10 sccm erreicht. Die Ergebnisse dieser Arbeit ermöglichen die Realisierung eines breiten Spektralbereichs der Filter-Arrays im Nano-Spektrometer.