Avaliação de tecnologias de redução de volume das lamas produzidas em ETAR

O adequado tratamento da água residual revela-se de extrema importância na preservação dos recursos naturais e da qualidade de vida. Esse tratamento é caracterizado pela produção de subprodutos que incluem resíduos removidos da água residual e lama produzida no tratamento da mesma. Ao longo do tempo, as directrizes europeias têm vindo a ser cada vez mais restritivas quanto aos valores limite que determinam a qualidade de emissão da água residual ou de deposição da lama, por forma a minimizar os impactes negativos no local de recepção dos mesmos e redução dos custos de transporte, no caso da lama, pelo que a ETAR deve ser planeada de forma a garantir o cumprimento da legislação em vigor, de acordo com a qualidade da água residual afluente à estação. O tratamento na estação divide-se em linha de fase líquida e sólida. No tratamento convencional da fase sólida, a lama é tratada segundo a sequência de etapas espessamento, estabilização e desidratação. Nesta dissertação será dada especial relevância à linha de fase sólida, com o intuito de apresentar, caracterizar e comparar as tecnologias (além do tratamento convencional) que se encontram em fase experimental ou já implantadas em ETAR e têm como objectivo a redução do volume da lama produzida. Será desenvolvida uma aplicação informática de apoio à decisão quanto à tecnologia indicada, de acordo com as variáveis seleccionadas pelo utilizador. As tecnologias dividem-se em: processos biológicos, hidrólise, oxidação avançada, química, térmica e mecânica. Nos biológicos a redução do volume da lama pode ser garantida pela predação dos microrganismos, pela manutenção/inibição do metabolismo e pela alteração/introdução de um reactor biológico na estação. A hidrólise é optimizada após doseamento de enzimas ou por aumento da temperatura. A oxidação avançada é caracterizada pelas tecnologias de ozonização, processo de Fenton, oxidação por ar húmido e oxidação electroquímica. A tecnologia química depende da adição de reagente ácido, alcalino ou outro. A tecnologia mecânica abrange a sonificação, o moinho de rotação, o reactor de homogeneização, a aplicação de campo eléctrico, a aplicação de radiação gama, recurso a técnicas centrífugas e aplicação de pressão na lama. A elevação da temperatura de reacção por meio convencional, por aplicação de radiação de micro-ondas ou garantindo o ciclo de congelamento/aquecimento pertencem à tecnologia térmica. Estas tecnologias podem ser aplicadas numa fase anterior ou posterior da estabilização da lama por forma a melhorar a biodegradabilidade dos compostos orgânicos e reduzir o número de microrganismos viáveis. As tecnologias actuam por meio de libertação de energia, radiação ou pressão no sentido de garantir os objectivos descritos e podem ser aplicadas individualmente ou combinadas (sistema híbrido). Assim o consumo energético, o incremento de matéria orgânica e a capacidade de redução da quantidade de lama são factores que devem ser considerados na escolha da melhor tecnologia que se adequa a cada ETAR.

Variação da composição química e atividade antioxidante de própolis em função da época de colheita

O própolis é uma resina natural produzida por abelhas, que permite proteger as colmeias de agentes externos que as possam colocar em perigo e contribui para a manutenção da temperatura dentro da colmeia. É uma resina que, dependendo de vários fatores como flora, temperatura e localização da colmeia, pode apresentar uma cor que pode ir do verde ao castanho avermelhado. Tem um cheiro característico, adocicado, e tanto pode ser rígida e compacta como macia e granulosa. O própolis tem sido estudado com diversos intuitos e dados já registados indicam esta resina como um forte antioxidante e antimicrobiano. Ao longo deste trabalho foi avaliada a variação da composição química do própolis e da sua atividade antioxidante consoante a data de colheita. Foram recolhidas amostras em três datas distintas (dezembro, março e junho) de quatro apiários (Casal Álvaro, Lagoas, São Roque e Ouca) da zona do Caramulo, e de três colmeias de cada um desses apiários. Foram feitos dois extratos etanólicos de cada amostra de própolis (extratos A e B) e submeteram-se os extratos a três testes distintos: Folin-Ciocalteu, sequestração do radical DPPH e atividade redutora FRAP. Verificou-se que, segundo os testes de Folin-Ciocalteu e FRAP, a concentração de compostos antioxidantes quase duplicou de dezembro e março para junho. Quando ao teste de DPPH, verificou-se um aumento gradual ao longo da data de colheita. Verificou-se que a composição química do própolis é variável, de acordo com a data de recolha das amostras e que o seu poder antioxidante quase duplica de dezembro e março para junho. Os extratos brutos das amostras de própolis foram fracionados com acetato de etilo e analisados por GC-MS. Verificou-se que a composição química varia ao longo das datas de colheita, especialmente para alguns componentes. Observou-se existirem correlações entre as propriedades antioxidantes e a abundância de alguns componentes fenólicos do própolis. É possível verificar que, devido às suas características antioxidantes, se torna cada vez mais interessante caracterizar quimicamente o própolis. A caracterização do própolis poderá levar ao desenvolvimento de novos aditivos e suplementos alimentares bem como responder a necessidades nas áreas de microbiologia e da genética, permitindo a criação de novas drogas comercializáveis para algumas patologias.

Enterobactérias produtoras de ESBL em Passo Fundo, estado do Rio Grande do Sul, Brasil

INTRODUÇÃO: O principal mecanismo de resistência emergente entre Enterobacteriaceae é a produção de β-lactamases de espectro estendido, enzimas capazes de hidrolisar cefalosporinas-de-amplo-espectro, que são bastante utilizadas na terapia antimicrobiana de infecções por enterobactérias. Embora a resistência a esses agentes apresente grande variabilidade geográfica, os índices de resistência são elevados em diversos países MÉTODOS: Um estudo observacional, transversal, descritivo e retrospectivo foi desenvolvido para avaliar a frequência de ESBL entre cepas de Enterobacteriaceae obtidas no Hospital São Vicente de Paulo, Brasil RESULTADOS: A produção de ESBL foi observada em 24,8% (nº=208/838) dos isolados avaliados. Isolados de Escherichia coli representaram 46,2% (nº=96/208) do percentual de produtores de ESBL, seguido de espécies de Enterobacter 30,3% (nº=63/208). A sensibilidade desses isolados ao meropenem foi de 91,4% e a piperacilina/tazobactam de 67,4% CONCLUSÕES: Os índices de ESBL encontrados confirmam a preocupação mundial com este mecanismo de resistência.

Ocorrência e perfil de sensibilidade a antimicrobianos em Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter sp. em um hospital terciário, no sul do Brasil

INTRODUÇÃO: O principal mecanismo de resistência entre isolados de Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter sp. é a produção de metalo-β-lactamases (MβLs). As MβLs são enzimas capazes de hidrolisar cefalosporinas, penicilinas e carbapenêmicos, mas não monobactâmicos (aztreonam) antibióticos que se encontram entre as principais opções terapêuticas para o tratamento de infecções causadas por bactérias não fermentadoras de glicose. MÉTODOS: Um estudo observacional, transversal, descritivo e retrospectivo foi desenvolvido para avaliar a frequência e o perfil de susceptibilidade cepas de P. aeruginosa e Acinetobacter sp. produtoras de MβLs isoladas no Hospital São Vicente de Paulo, Passo Fundo, Brasil. RESULTADOS: A produção de MβLs foi observada em 77,6% (n = 173/223) dos isolados de P. aeruginosa e em 22,4% (n = 50/223) dos isolados de Acinetobacter sp. Dentre as cepas produtoras de MβL, a maioria apresentou mais de 90% de resistência a seis antimicrobianos dos 12 testados, enfatizando a resistência a ceftazidima, gentamicina, aztreonam, piperaciclina/tazobactam, cefepime, ciprofloxacina, meropenem e tobramicina. CONCLUSÕES: Os índices de MβL encontrados confirmam a preocupação mundial com a disseminação desse mecanismo de resistência.

Sistemas bacterianos competentes em biotransformação humana para estudos mecanísticos e toxicológicos

Devido às limitações de sistemas in vitro atuais, existe uma necessidade de modelos celulares especializados em mimetizar propriamente a biotransformação humana. Além da aplicação destes novos sistemas na avaliação e estudo de toxicidade químicos, estes sistemas permitem o uso em estudos funcionais e mecanísticos de enzimas de biotransformação humanas. Nesta dissertação é abordado o desenvolvimento de modelos celulares competentes em enzimas de biotransformação humanas, aplicado na avaliação de um dos principais metabolitos do fármaco antirretroviral Nevirapina (NVP), como também num estudo mecanístico do importante fator proteico na biotransformação humana, a NADPH citocromo P450 oxido-redutase (CPR). NVP é frequentemente usado no tratamento de HIV-1 e tem sido associado a efeitos adversos como lesões hepáticas e erupções cutâneas severas. Evidências apontam ao envolvimento de citocromos P450 e subsequente sulfonação por sulfotransferases na formação de metabolitos reativos. Contudo, testes padrão in vitro não demonstraram evidências de mutagenicidade ou clastogenicidade. Neste estudo, utilizando uma estirpe de S. typhimurium, competente na expressão controlável e estável de sulfotransferase 1A1 (SULT1A1) humana, demonstrou-se mutagenicidade de 12-hidroxi-NVP dependente de SULT1A1. A enzima CPR está envolvida nas principais reações de biotransformação de xenobióticos, além de interagir com outras proteínas importantes com funções celulares importantes. O mecanismo pelo qual CPR doa eletrões aos seus parceiros redox não é completamente claro. Foi desenvolvido um sistema de E. coli para ser aplicado em estudos mecanísticos sobre a doação de eletrões de CPR. Este novo sistema co expressa CPR e hemeoxigenase I (HO-1) humanas, que depende importantemente de CPR, sendo sustentada por sete eletrões doados por cada ciclo enzimático. As condições de cultura foram otimizadas para níveis de expressão CPR/HO-1 aproximados à estequiometria verificada em humanos. Este modelo células foi aplicado no desenvolvimento de um ensaio de cinética de HO-1, focando-se em vários parâmetros para a sua otimização.

Complexos Organometálicos: caracterização preliminar de compostos de vanádio e de moléculas libertadoras de CO como potenciais fármacos

Vários complexos metálicos têm sido explorados visando uma melhoria de atuais tratamentos das mais variadas doenças. Os compostos de vanádio apresentam uma capacidade de mimetizar a ação da insulina, insurgindo-se assim como uma aposta no tratamento da doença Diabetes mellitus. O monóxido de carbono (CO), outrora visto como apenas um agente tóxico, atualmente é explorado pelas suas capacidades anti-inflamatórias, tendo-se desenvolvido moléculas libertadoras de CO, os CORMs, de modo a tirar partido dos seus efeitos biológicos. Com vista a determinar a formação de aductos entre os complexos organometálicos de vanádio e diferentes proteínas e caracterizar o tipo de interação estabelecida recorreu-se à Cristalografia de raios-X. A estrutura cristalográfica do aducto VOIV(picolinato)2–tripsina bovina foi obtida a 1,09 Å de resolução, mostrando o complexo VOIV(pic)2 no centro ativo da enzima, coordenado à cadeia lateral da serina catalítica (Ser195), numa geometria octaédrica. Ensaios cinéticos preliminares realizados com o complexo VO(pic)2 foram efetuados para determinar potenciais efeitos inibitórios na atividade das enzimas lisozima da clara do ovo (HEWL) e tripsina. O potencial terapêutico dos CORMs associado à Nanotecnologia foi explorado para o [Ru(CO)3Cl(glicinato)] (CORM-3), visando desenvolver nanopartículas de ouro (AuNPs) funcionalizadas com o composto e diferentes proteínas. A toxicidade celular direta do CORM-3, bem como alguns potenciais efeitos biológicos de CORM-3–albumina de soro humano (BSA) e CORM-3–HEWL foram também avaliados, recorrendo a ensaios de viabilidade celular , riscados celulares, e RT-qPCR em várias linhas celulares tumorais e linha primária de fibroblastos humanos. Foi possível iniciar o desenvolvimento de nanosistemas de AuNPs@PEG@BSA e AuNPs@PEG@HEWL, seguindo-se futuramente a conjugação com o CORM-3. Não foi possível determinar o efeito anti-inflamatório do CORM-3 e seus conjugados através da análise dos genes de resposta por RT-qPCR em tempo real, no entanto determinou-se que o composto CORM-3 não possui toxicidade em linhas celulares tumorais, e que aparenta fomentar a regeneração celular em fibroblastos e células tumorais NINA, sendo este efeito potenciado aquando conjugação com BSA.

A organização molecular do Celulossoma: caracterização estrutural da proteína CipA e estudo da diversidade das interações coesina-doquerina

A celulose, principal componente da parede celular vegetal e o composto orgânico mais abundante da biosfera, possui inúmeras aplicações biotecnológicas. O microrganismo anaeróbio Clostridium thermocellum (C.thermocellum) tem sido alvo de grande interesse pela sua capacidade em degradar eficientemente a celulose e outros componentes da parede celular vegetal, por meio de um complexo multi-enzimático altamente eficiente, denominado de celulossoma. A montagem deste complexo ocorre através de uma proteína multi-modular denominada CipA. Esta proteína estrutural possui módulos não catalíticos (coesinas tipo I) que se ligam a módulos complementares (doquerinas tipo I) presentes nas enzimas celulolíticas modulares. A CipA possui ainda um módulo doquerina de tipo II que permite a ancoragem deste complexo multi-enzimático à parede celular da bactéria. Na presente dissertação foram utilizadas as metodologias de Cristalografia de Raios-X, para caracterizar a interação coesina-doquerina a nível atómico e molecular, e de Microarrays, com o intuito de estudar as possíveis especifidades e afinidades dessas interações. Com base na primeira técnica foram elucidadas as estruturas do módulo coesina C4 da CipA em complexo com a doquerina da enzima modular Xyn10B e do módulo coesina C9 isolado. As estruturas foram comparadas com o complexo do módulo coesina C2-doquerina Xyn10B já publicado. Esta análise encontra-se descrita no capítulo 3. Por último, a técnica de Microarrays, associada à eletroforese em gel de poliacrilamida em condições nativas, permitiu a caracterização das diferenças de afinidade e especificidade entre os vários pares coesina-doquerina dos celulossomas de C. thermocellum e de Rumminococcus flavefaciens (R. flavefaciens). As especificidades e afinidades dos módulos doquerina, dos celulossomas mencionados anteriormente estão descritas no capítulo 4.

Estudo e intervenção no livro de Consultas e Decretos da Rainha D. Maria I – Aplicação e métodos de remoção de reforços e adesivos

O presente trabalho tem como principal propósito selecionar novas metodologias de intervenção a aplicar na obra “Livro de Consultas e Decretos da Rainha D. Maria I” pertencente à Chancelaria Régia do Arquivo Municipal de Lisboa. Para tal, desenvolveu-se a contextualização histórica do livro e do Fundo e realizou-se o levantamento das problemáticas como as tintas ferrogálicas, manchas causadas por macro e microorganismos no papel, e reforços com papéis transparentes resultantes de restauros antigos nos manuscritos do livro. Realizou-se ainda a caracterização material dos substratos presentes no livro recorrendo a diferentes métodos de exame e análise. A escolha dos métodos para a remoção dos reforços teve como principal preocupação a substituição de métodos aquosos tradicionais, que não são controláveis, por novas metodologias de intervenção mais controladas. Estes métodos consistem na aplicação de humidade controlada através de técnicas como: humidificador ultrasónico com temperatura, Gore-tex, géis rígidos, cataplasma enzimático, e um ensaio experimental com dióxido de carbono supercrítico (CO2). Os resultados mais relevantes incidem na identificação do tipo de adesivo utilizado nos restauros antigos, e na operabilidade dos géis rígidos e cataplasma que se revelaram favoráveis no tratamento deste tipo de manuscritos. Tendo-se seleccionado os métodos com melhor operabilidade, realizaram-se intervenções de restauro em apenas alguns fólios, a partir do método mais adequado para cada tipo de substrato, tendo em conta o estado de conservação. Por fim desenvolveram-se propostas de intervenção para os restantes manuscritos e encadernação, assim como a execução de um acondicionamento adequado, proposta de conservação preventiva e uma ficha de restrição de acesso à obra.

Regulação epigenética de um gene de resposta a stress de frio em arroz (OsDREB1B)

O arroz (Oryza sativa L.) constitui a principal fonte de alimento para mais de metade da população mundial. O frio tem um grande impacto no desenvolvimento da planta de arroz com efeitos negativos ao nível da produtividade e economia mundial. Os mecanismos epigenéticos associados a alterações estruturais da cromatina estão envolvidos nos mecanismos de resposta das plantas a stresses abióticos. O foco do presente trabalho consistiu na compreensão da influência de fatores epigenéticos, nomeadamente de modificações de histonas, na regulação transcricional de um gene específico (OsDREB1B) envolvido na resposta de arroz ao stress de frio. O estudo da regulação epigenética deste gene envolveu a utilização de plantas de arroz com mutações em enzimas epigenéticas e drogas remodeladoras da cromatina. Neste trabalho mostramos que o gene OsDREB1B é induzido pelo stress de frio (4 °C) em todas os genótipos de arroz analisados, no entanto, a indução do gene em resposta ao stress de frio é maior em Nipponbare que em Dongjin. Nos genótipos que apresentam epimutações, nomeadamente o knockout de osdrm2 (DMT706) e de oshac704 (HAC704), o gene OsDREB1B é mais expresso que no respetivo genótipo selvagem (Dongjin), sendo que a indução da expressão em resposta ao frio foi maior em DMT706 do que em HAC704. A análise do padrão de marcas histónicas ao longo do promotor de OsDREB1B, através da imunoprecipitação da cromatina (ChIP) com anticorpos específicos, revelou que, em resposta ao frio (4ºC), Dongjin apresenta uma menor predominância da marca H3K9ac na região de -519 a -355 pares de bases (antes do ATG), enquanto que Nipponbare possui maior presença de H4K5ac na região de -280 a -121 pares de bases, sugerindo que a regulação epigenética de OsDREB1B seja influenciada pelo genótipo. No caso dos epi-mutantes (HAC704 e DMT706) registou-se um empobrecimento das marcas histónicas testadas sugerindo que a indução da expressão do OsDREB1B em reposta ao stress provocado pelo frio não depende necessariamente da presença de OsDRM2 nem de OsHAC704. Uma visão integrada da paisagem epigenética e do transcriptoma, perspetiva uma melhor compreensão dos mecanismos envolvidos na resposta da planta a condições ambientais adversas, abrindo novas linhas de trabalho no sentido de obter plantas mais tolerantes a fatores de stress.

Doença de Chagas na bacia amazônica: ocorrência de um novo caso autóctone do Estado do Pará

Os autores registraram a ocorrência de mais um caso autóctone de doença de Chagas no Estado do Pará, desta feita na localidade de São Francisco do Pará, distante 95 km da capital. Esse caso constitui o 11° registro no Estado e o 29° da bacia amazônica. O paciente, um menino de 7 anos de idade, teve diagnóstico sorológico e paraitológico positivos para T. cruzi. O perfil enzimático da amostra isolada foi caracterizado por eletroforese de enzimas como zimodema 3.

Bolachas de maçã biofortificadas em cálcio: formulação e análise nutricional

A epiderme da maçã biofortificada, rica em compostos antioxidantes, fibra dietética e cálcio proveniente do processo de biofortificação, é um subproduto da indústria de polpas e néctares com um elevado valor tecnológico e nutricional e com potencial para ser usado de um modo sustentável no desenvolvimento de novos produtos. Este subproduto foi utilizado para a produção de uma farinha e posterior utilização como ingrediente substituinte da farinha de trigo em preparados para elaboração de bolachas de maçã biofortificadas em cálcio. As análises físico-químicas e sensoriais realizadas demostraram que um preparado de bolachas contendo 25% de farinha de maçã apresenta um teor de fibra dietética de 4 g /100 g de produto, enquanto no preparado controlo, não contendo este novo ingrediente, não foi detetada a presença de fibra dietética. O teor de compostos fenólicos é também superior em quase 80% nos preparados contendo farinha de maçã (110 mg EAG/100 g de produto) comparativamente com o teor determinado no preparado controlo (24 mg EAG/100 g de produto). Comprovou-se ainda que os preparados de bolacha contendo farinha de maçã biofortificada em cálcio têm um teor deste mineral superior, em cerca de 15% a 25%, aos preparados contendo farinha de maçã não biofortificada e ao controlo. A análise sensorial realizada indicou que, para além das mais-valias nutricionais, a presença da farinha de maçã representa também uma melhoria substancial das características organolépticas do produto. Conclui-se que a substituição parcial da farinha de trigo e milho, normalmente utilizada neste tipo de produtos alimentares, pela farinha de maçã biofortificada em cálcio representa uma adição de valor quer nutricional, com efeitos benéficos para a saúde, quer sensorial ao preparado de bolachas dando origem a um novo produto alimentar.

BIOLOGIA DE ANOFELINOS AMAZÔNICOS. XV. LEUCINA AMINOPEPTIDASE EM ANOPHELES (NYSSORHYNCHUS) NUÑEZ-TOVARI; ONTOGENIA E VARIAÇÃO GENÉTICA

Dados sobre a leucina aminopeptidase durante o desenvolvimento ontogenético em Anopheles nuñez-tovarìevidenciaram seis zonae de atividade, eendo a LAP1, LAP2, LAP4 e LAP5 presentes nos estádios larvais, pupae e adultos e a LAP3 e LAP6 características desses dois últimos estágios. Diferenças na intensidade de coloração foram detectadas conforme o estágio considerado. A LAP1 e LAP5 apresentam intensidade fraca em todos os estágios e a LAP2 e LAP4 mostram atividade intensa nos estádios larvais, diminuindo nos dois estágios subseqüentes. Considerando-se as funções das enzimas, foi admitido que a LAP3, no estágio de pupa, possa estar relacionada com a histólise dos tecidos larvais. Dos seis locidetectados, variação alélica foi constatada apenas para o locus LAP5,sendo detectados dois alelos de ação codominante. As freqüências genotípicas de progênies de fêmeas inseminadas naturalmente desviam-se significativamente do equilíbrio de Hardy-Weinberg.

The role of arl13b in cilia length regulation and in zebrafish development

RESUMO: Arl13b é uma importante proteína ciliar, presente em cílios primários e cílios móveis. Ratinhos mutantes para Arl13b têm comprimento dos cílios reduzido e defeitos nos B-túbulos dos cílios. Como consequência destes fenótipos, deficiências na Arl13b originam, em modelos animais, várias doenças congénitas, incluindo problemas no estabelecimento do eixo esquerda-direita, malformações cerebrais e deformações corporais. Nos seres humanos, deficiências na Arl13b levam a uma doença crónica congénita chamada Síndrome de Joubert. Por outro lado, a sobreexpressão de Arl13b origina cílios mais longos, no entanto existe uma ausência da caracterização dos fenótipos celulares e durante o desenvolvimento embrionário. Neste trabalho, quisemos explorar o efeito da sobre-expressão de Arl13b em embriões de peixezebra. Descobrimos que, ao nível ciliar, a sobre-expressão de Arl13b nas células aumenta o comprimento ciliar em cílios primários e móveis, no entanto, a esses cílios falta adequada acetilação da alfa-tubulina no citoesqueleto feito por microtúbulos. Os nossos resultados mostraram que esse efeito é específico de Arl13b sobre-expressão e quando se manipularam as enzimas responsáveis pela acetilação (Mec17) e pela de-acetilação (HDAC6) encontrámos uma sinergia potencial com ambas. Testámos ainda, que o aumento no comprimento ciliar não estava causalmente relacionado com a falta de acetilação, ou seja, os cílios com menos acetilação não eram necessariamente os mais longos. Também mostrámos que a sobre-expressão de Arl13b é capaz de restaurar o comprimento dos cílios em mutantes com cílios curtos e como isso pode ser explorado para um futuro potencial papel terapêutico para Arl13b. Em seguida, foi avaliado o impacto do aumento da quantidade de Arl13b no desenvolvimento embrionário do peixe-zebra. Observou-se que a sobre-expressão de Arl13b apresentava fenótipos muito fracos, quando comparados com a perda de função dos mutantes de Arl13b. Focados no inesperado fenótipo leve no estabelecimento do eixo esquerda-direita abordámos a questão através do estabelecimento de uma colaboração com matemáticos, descobrimos que os cílios mais longos que potencialmente têm a capacidade de movimentar mais fluido são atenuados por amplitudes de batimento menores, e, como resultado, estes longos cílios não prejudicam o movimento do fluido e consequentemente não afetam o estabelecimento dos padrões de esquerda-direita. Sugerimos assim que a Arl13b é um regulador chave, do comprimento ciliar. Descobrimos uma nova interação com as enzimas de acetilação/de-acetilação e levantamos novas hipóteses quanto aos mecanismos moleculares da função da Arl13b. Propomos um novo modelo para o mecanismo molecular da Arl13b na regulação do comprimento dos cílios onde podemos integrar os nossos resultados com os relatados na literatura. Este trabalho adiciona mais conhecimento para o mecanismo de ação da Arl13b e, portanto, fornece uma importante contribuição para o campo da investigação em cílios.---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ABSTRACT: Arl13b is an important ciliary protein, present in primary and motile cilia. arl13b-/- mouse mutants have reduced cilia length and cilia B-tubule defects. As a consequence of these phenotypes, Arl13b loss of function animal models suffer from several congenital disorders including left-right problems, brain malformations and body deformations. In humans Arl13b depletion leads to a congenital chronic disease called Joubert Syndrome. On the other hand, overexpressing Arl13b leads to longer cilia but the characterization of the cellular and developmental phenotypes was missing. In this work we explore the effect of Arl13b overexpression in zebrafish embryos. We found that, at the ciliary level, Arl13b overexpression from 1 cell stage produces longer primary and motile cilia, but these cilia lack proper alpha tubulin acetylation of their microtubule cytoskeleton. Our results showed that this effect is specific from Arl13b overexpression and when we manipulated the enzymes responsible for acetylation, Mec17, and de-acetylation, HDAC6, we found a potential synergy of both mec17 knockdown and HDAC6 activity with Arl13b overexpression. We tested that the ciliary increase in length was not causally related to the lack of acetylation, meaning the more de-acetylated cilia were not necessarily the longer ones. We also showed that Arl13b overexpression is able to restore cilia length in short cilia mutants and how that may be explored to a potential future therapeutic role for Arl13b. Next, we evaluated the impact of increasing the amount of Arl13b in zebrafish embryonic development. We observed that Arl13b overexpression presented very mild phenotypes when compared to the loss of function mutants. We focused on the unexpected left-right mild phenotype and by establishing a mathematical modeling collaboration, we found out that the longer cilia generated force was attenuated by smaller beating amplitudes, and as a result, these long cilia were not impairing the cilia generated flow and the establishment of left-right patterning. We suggest that Arl13b is one key cilia length regulator. We disclosed a novel interaction with the acetylation / de-acetylation enzymes and raised new hypothesis as to the mechanisms of Arl13b function. We propose a new model for the Arl13b molecular mechanism of cilia length regulation where we integrate our findings with those reported in the literature. This work adds more knowledge to the Arl13b mechanism of action and therefore provides an important contribution to the cilia research field.

Aperfeiçoamento da técnica de eletroforese para análise isoenzimática de clones de seringueira (Hevea sp.)1

Este estudo foi conduzido no sentido de otimizar as técnicas de preparo de extratos de folíolos e identificar tampões e condições de corrida que proporcionassem uma boa definição dos perfis eletroforéticos de clones de seringueira. Foram testados 25 diferentes sistemas enzimáticos utilizando-se onze sistemas tamponantes. Não foram encontradas diferenças na qualidade dos zimogramas obtidos nos diferentes estádios fenológicos analisados, em amostras submetidas a diferentes condições de centrifugação e nas diferentes plantas de um mesmo clone. Extratos de folíolos liofilizados apresentaram resolução semelhante para Adh, Pgi, 6Pgdh, Lap-1, Skdh, Acp, Mdh, ßGlu, Pgm e Idh que homogenados de folíolos não liofilizados preparados até 2 dias pós-coleta. Os padrões de Got e Est apresentaram boa nitidez somente em extratos de folíolos frescos. As demais enzimas não apresentaram resolução satisfatória. Com o uso de diferentes substratos, foi possível detectar nove regiões de atividade esterásica nas condições empregadas, embora variação genética tenha sido caracterizada para apenas três locos nos clones analisados. Os fenótipos observados para esterase-7 utilizando-se ésteres derivados de naftol foram semelhantes aos padrões encontrados utilizando L-benzoil-ßnaftilamida como substrato, indicando que esta esterase seja, provavelmente, uma en-dopeptidase. A utilização de substratos fluorogênicos permitiu ainda a detecção de uma variante eletroforética de Acp em Hevea nítida e uma variante de ßGlu em Hevea rigidifolia.

Esterases no exame da estrutura populacional de Camu-camu (Myrciaria dubia (Kunth) McVaugh-Myrtaceae)

Dois sistemas enzimáticos (esterase e esterase-D), analisados pela técnica de eletroforese em gel de amido, em folhas jovens de plantas cultivadas em terra firme, de sementes provenientes de três amostras de populações naturais de camu-camu, Myrciaria dubia (Kunth) McVaugh-Myrtaceae, procedentes de Iquitos, Boa Vista e Uatumã, revelaram a presença de 6 locos: Est-1, Est-2, Est-3, Est-4, Est-D1 e Est-D2. Dois dos seis locos gênicos examinados no presente estudo (Est-3 e Est-D2) mostraram-se polimórficos, sendo desse modo considerados valiosos no estudo de caracterização da estrutura populacional da espécie. Os padrões de polimorfismo revelados nos locos Est-3 e Est-D2 de camu-camu, são típicos de enzimas monoméricas e diméricas, respectivamente. O loco Est-3 apresentou um grande desbalanço genético dentro e entre as amostras populacionais examinadas, devido ao excessivo número observado de plantas heterozigóticas em relação ao número esperado. O loco Est-D2 apresentou um polimorfismo exclusivo para os alelos Est-D2¹,Est-D2² e Est-D2³, e um bom balanço genético na amostra populacional de Uatumã. Em função disso, dentre os demais locos gênicos aqui investigados, o loco Est-D2 parece ser o mais adequado para identificação e delimitação de prováveis estoques de camu-camu. Portanto, recomenda-se que esse loco esteja presente na lista dos marcadores isoenzimáticos a serem usados em futuras prospecções sobre genética populacional dessa espécie na região amazônica. Dados sobre a distribuição das freqüências alélicas, estimativas das distâncias genéticas, e estimativas de variação genética nos 6 locos de esterases examinados, foram eficazes na demonstração de diferenças genéticas entre as amostras populacionais examinadas da espécie. Os maiores valores de heterozigozidade média (0,1353); proporção de locos polimórficos (0,33) e número médio de alelos por loco (1,33) revelados na amostra populacional de Uatumã, devem-se ao fato dessa amostra ter apresentado um loco polimórfico a mais (Est-D2), em relação as demais amostras investigadas.