Bio-removal of toxic metals by metal resistant anaerobic bacteria: molecular characterization and performance studies

Tese de dout., Ciências Biotecnológicas (Biotecnologia Ambiental), Faculdade de Ciências e Tecnologia, Univ. do Algarve, 2010

Influência do comportamento vocal no sucesso reprodutor do xarroco lusitano Halobatracus didactylus (Bloch & Schneider, 1801)

Dissertação de mest., Biologia Marinha (Ecologia e Conservação Marinha), Faculdade de Ciências e Tecnologia, Univ. do Algarve, 2011

Padrões verticais e inter-anuais nas assembleias de larvas de peixe junto ao substrato rochoso do Parque Marinho da Arrábida

Dissertação de mest., Biologia Marinha, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Univ. do Algarve, 2009

Sobrevivência e crescimento de juvenis de cavalos-marinhos (Hippocampus sp.): caso de estudo: Hippocampus erectus (Perry, 1810)

Dissertação de mest., Ciências, Faculdade de Ciências do Mar e do Ambiente, Univ. do Algarve, 2009

Dissection of the early steps in the assembly of the 20S proteasome in Saccharomyces cerevisiae

Tese de dout., Bioquímica (Biologia Celular e Molecular), Faculdade de Ciências e Tecnologia, Univ. do Algarve, 2010

O que é para ti um tubarão? percepções das crianças sobre os tubarões em contexto (educação) informal de ciências

Dissertação de mest., Didáctica e Inovação no Ensino das Ciências (Biologia/Geologia), Faculdade de Ciências e Tecnologia, Univ. do Algarve, 2011

Conhecimento profissional dos professores de ciências naturais do 3º CEB no âmbito da unidade didática "Alimentação e digestão - sistema digestivo"

Dissertação de mest., Didática e Inovação no Ensino das Ciências (Biologia/Geologia), Faculdade de Ciências e Tecnologia, Univ. do Algarve, 2011

Global geriatric evaluation of the Algarve population

The ageing of population challenges communities to adapt and evolve to accommodate the needs of people that live longer (mostly out of work, either healthy, fragile or with chronic disease). Population ageing in the Algarve is higher than in overall Portugal. Studies on health conditions, frailty risk factors and elderly specific needs are undeveloped in Portugal and unknown in the Algarve. Objective To prepare a tool for Global Geriatric Evaluation, to be used in the “Survey of Health and Ageing in the Region of Algarve - SHARA”, a commitment to “European Innovation Partnership on Active and Healthy Ageing”. Methods A preliminary version of the screening tool, which includes well-known instruments to measure health condition (EASY-care), risk of fall (Tinetty), physical activity (Baecke’s modified questionnaire), nutritional condition (MNA), cognitive and depressive status (MMSE, Yesavage geriatric depression scale), together with socio-demographic characteristics, was applied to an independent sample of subjects from an elderly community centre - ARPI (“Associação de Reformados, Pensionistas e Idosos do Concelho de Faro”), with ages between 55 and 89. Results ARPI is mostly frequented by women, who either have risk of malnutrition or malnutrition incidence, a relevant risk of fall or are physically active. Those who live alone, show a higher risk of fall. Conclusions ARPI members are active, but with risk of malnutrition and fall, suggesting the relevance and importance of future interventions in these areas. The proposed screening tool showed to be adequate for the SHARA study, suitable to provide wider information on frailty.

Conhecimento e desenvolvimento profissional do professor. Analisando a prática de Maria, uma professora do 1.º Ciclo

Como qualquer profissional, cumpre-nos, no papel de formadores, o dever de procurar, a cada momento, uma melhoria da nossa atuação e da formação que facultamos. Enquanto formador de professores, esta assunção foi um dos motivos que conduziu à elaboração de uma investigação centrada no desenvolvimento profissional do professor focando, em particular, algumas das dimensões que considero centrais no seu conhecimento profissional (crenças, objetivos, conhecimentos – mathematical knowledge for teaching – e tipos de comunicação matemática promovidos), tendo para isso sido desenvolvidos dois modelos de análise complementares (Modelo Cognitivo e de Representação do Desenvolvimento Profissional – MRDP). Neste texto, a partir da análise da prática, analisam-se e discutem-se as “evoluções” das relações entre as dimensões em análise, recorrendo aos dois modelos. Inicio com algumas considerações sobre cada uma das dimensões em análise e, com recurso a um exemplo da prática, ilustro a aplicação do MRDP. A utilização destes modelos permite obter uma mais ampla compreensão da prática, dos fatores que a influenciam e como a influenciam, revelando-se o MRDP um potente instrumento que permite uma mais clara representação visual das alterações e persistências que se verificam na prática ao longo do tempo, sendo estas (in)alterações encaradas em termos da reflexividade do professor sobre a sua prática. Um outro aspeto relevante relacionase com as potencialidades do recurso a ambos os modelos para a/na formação de professores e o papel que podem assumir nela.

Le Comte de Monte Cristo: da literatura ao cinema

A presente dissertação discute o diálogo estabelecido entre literatura e cinema no tratamento da personagem principal – um homem traído que se vinga de forma cruel dos seus inimigos – na obra literária Le Comte de Monte-Cristo, de Alexandre Dumas, e nas três adaptações fílmicas escolhidas: Le Comte de Monte-Cristo de Robert Vernay (1943); The count of Monte Cristo de David Greene (1975) e The count of Monte Cristo de Kevin Reynolds (2002). O projecto centra-se na análise da personagem Edmond Dantès/Monte-Cristo na obra literária e na sua transposição para a obra fílmica, nos graus de adaptação e contaminação entre os diferentes textos em momentos temporais diferentes. Para isso, foram estudadas em pormenor cada uma das obras referidas, tendo sempre em vista o percurso do herói. A adaptação cinematográfica de uma obra literária é uma operação de criação de um novo texto com dinamismo e autonomia próprios, resultante de escolhas nem sempre fáceis de realizar. A grande extensão da obra literária dificultou essa tarefa, no entanto, os realizadores procuraram constituir um fluir de personagens e de situações enquadráveis num tempo ideal de visualização confortável. Todas as narrativas combinam romance e desilusão, acção e aventura, mas os temas da vingança e da traição são explorados numa perspectiva diferente. As conclusões apuradas constatam que, independentemente da época, a personagem descrita nos filmes manteve-se fiel à caracterização feita pelo seu criador Alexandre Dumas, apesar de algumas nuances necessárias para criar um objecto que garantisse reconhecimento da crítica mas, também, o sucesso comercial.

Comunicação matemática num contexto de resolução de problemas

Este estudo visa compreender como alunos do 9.º ano fazem uso de representações para comunicar matematicamente num contexto de resolução de problemas, considerando, simultaneamente, o papel do discurso desenvolvido entre os vários actores, na sala de aula. Assim, formularam-se as seguintes questões de investigação: i) A que representações matemáticas recorrem os alunos quando se envolvem em actividades de resolução de problemas? ii) Qual o papel desempenhado por estas representações nos processos de resolução de problemas e de comunicação dos seus raciocínios? iii) De que modo as interacções discursivas ocorridas durante as actividades de resolução de problemas influenciam o processo de resolução? O quadro teórico articulou diferentes focos, destacando-se: o processo de comunicação, em geral, e a comunicação na aula de matemática, em particular, o discurso matemático e as representações do conhecimento matemático. O trabalho de campo contemplou uma intervenção pedagógica com dez alunos de 9.º ano, nas aulas de Estudo Acompanhado, durante a qual foram propostas dez tarefas. Esta intervenção, ao fomentar e valorizar a comunicação reflexiva e instrutiva, deu aos alunos oportunidades de falarem, ouvirem, discutirem e reflectirem, colocando ênfase na capacidade de comunicar em Matemática. Adoptou-se uma metodologia qualitativa, de carácter interpretativo, centrada na análise de dados recolhidos através de observação participante, de entrevistas aos alunos e das suas produções. Os resultados evidenciam que a resolução de problemas constituiu uma boa estratégia para promover a comunicação matemática, uma vez que estimulou o aparecimento de diversas representações, que foram progressivamente melhoradas, facilitou o confronto de ideias, a delineação de estratégias e a apresentação de resultados, quer na forma escrita quer oral. O discurso que foi emergindo no contexto das aulas, e que se tornou cada vez mais proficiente, permitiu uma clara evolução na execução das tarefas

Biologia pesqueira e dinâmica populacional de Diplodus vulgaris (geoffr.) e Spondyliosoma cantharus (L.) (pisces, sparidae) na costa sudoeste de Portugal

As espécies da família Sparidae ocupam um lugar de destaque na actividade pesqueira da Costa Sudoeste de Portugal, sendo das principais subsidiárias da pesca artesanal nesta região. Com o presente trabalho pretendeu-se clarificar aspectos básicos da biologia de dois esparídeos, Diplodus vulgaris (safia) e Spondyliosoma cantharus (choupa), nas áreas da ecologia alimentar, reprodução, idade, crescimento e mortalidade; estimar os parâmetros de selectividade das artes de pesca mais importantes sobre estas espécies e avaliar preliminarmente o estado da pescaria destes dois esparídeos. Para atingir estes objectivos cumpriu-se um plano de amostragem de frequências de comprimento nas lotas de Sagres e Sines, de Julho de 1992 a Março de 1994; estudos laboratoriais com amostras recolhidas em Sagres de Dezembro de 1992 a Março de 1994 e um estudo de selectividade de aparelho de anzol e redes de emalhar realizado em 1997/98. Os hábitos alimentares foram estudados a partir da análise de conteúdos estomacais, utilizando-se 3 métodos de avaliação da composição da dieta, 5 índices combinados da bibliografia e 3 propostos. Da análise comparativa entre os vários índices concluiu-se que o índice de importância relativa (IRI) e o índice de alimentação ponderado (IPO2) serão os mais adequados para descrever as dietas destas espécies. Registaram-se elevados coeficientes de vacuidade, motivados em grande parte pela natureza da arte de pesca. A dieta de D. vulgaris é composta essencialmente por ofiurídeos, poliquetas, anfípodes e equinóides, enquanto que S. cantharus consome principalmente poliquetas, anfípodes e hidrozoários. As duas dietas são significativamente diferentes, principalmente pelo maior consumo de equinodermes no caso de D. vulgaris. A estrutura e dimensões da boca nestes esparídeos são distintas, podendo influenciar o seu comportamento trófico. À semelhança de grande parte dos esparídeos, D. vulgaris e S. cantharus são espécies bentívoras, que adoptam uma estratégia alimentar generalista, com fortes afinidades com o alimento disponível no meio. Da análise do ciclo reprodutivo verificou-se que as épocas de postura são extensas: D. vulgaris: Dezembro a Março com maior intensidade em Janeiro/Fevereiro; S. cantharus: Fevereiro a Abril, com máxima intensidade em Março. Não existiram diferenças significativas na proporção entre os sexos (M:F = 1.01) ao longo do ano e por tamanho em D. vulgaris, enquanto que em S. cantharus as fêmeas foram mais abundantes ao longo do ano (M:F=0.57) e nas classes de comprimento inferiores. Os tamanhos de 1ª maturação (L50%) para o conjunto dos sexos e indivíduos indeterminados foram de: D. vulgaris, 18.33 cm, não existindo diferenças significativas entre machos e fêmeas; S. cantharus, 20.10 cm, existindo diferenças significativas entre machos (22.41 cm, TL) e fêmeas (19.98 cm, TL). Os tamanhos de 1ª maturação estimados foram consideravelmente superiores aos tamanhos mínimo legais de desembarque (TML) em Portugal, para D. vulgaris (TML=15.0 cm) e ligeiramente inferiores no caso de S. cantharus (TML=23 cm). A fecundidade média absoluta (Fa) e a fecundidade relativa (Fr) foram de: D. vulgaris - Fa = 131127 ovos; Fr = 526 ovos/g; S. cantharus - Fa = 61396 ovos; Fr = 346 ovos/g. As relações entre a fecundidade absoluta e o comprimento total (TL) e o peso somático (SW) foram as seguintes: D. vulgaris: Fa = 0.1853TL4.1903; Fa = 57.715SW1.4067; S. cantharus: Fa = 436.27TL1.5747; Fa = 2979.7SW0.585. A estratégia reprodutiva destas espécies é caracterizada por hermafroditismo, rudimentar com eventual protândria parcial em D. vulgaris e protogínia em S. cantharus. A determinação da idade foi efectuada pela análise de estruturas duras, otólitos para D. vulgaris e otólitos e escamas para S. cantharus. As estimações do comprimento à idade ajustaram-se bem ao modelo de Von Bertalanffy. De entre os métodos de estimação dos parâmetros de crescimento, escolheu-se o ajuste não linear aplicado a todos os pares de comprimentos à idade, sendo esta corrigida pela data de captura. Para além do maior rigor desta análise, os resultados produzidos foram considerados os mais aproximados da realidade: D. vulgaris (otólitos): L=28.1 cm K=0.30 ano-1 e t0= -1.618 anos (validade: 12.5-30.5 cm; 1-10 anos); S. cantharus (escamas): L=35 cm, K=0.32 ano-1 e t0=-0.481 anos (validade: 14.3-33.5 cm; 1-9 anos). A análise de distribuição de frequências de comprimento, apresentou um L mais próximo da realidade: L=39.6 cm, K=0.32 ano-1 e t0=-0.481 anos (D. vulgaris); L=40.0 cm, K=0.24 ano-1 e t0=-0.646 anos (S. cantharus). As relações peso-comprimento de D. vulgaris e S. cantharus para a Costa Sudoeste foram do tipo potencial W=a Lb, sendo definidas pelos seguintes parâmetros: a=0.0223 e b= 2.895, r2=0.89 (D. vulgaris); a=0.0106 e b= 3.085, r2= 0.89 (S. cantharus). Os valores de mortalidade natural (M), estimados por métodos indirectos, para D. vulgaris e S. cantharus foram de 0.39 e 0.30 ano-1, respectivamente. O valor de M de esparídeos pode ser estimado preliminarmente mediante a utilização de uma regressão multilinear que integra as três variáveis (M, K e L): M = -0.162 + 1.714K + 0.00273L (r2=0.77). A análise das curvas de captura permitiu obter os seguintes valores de mortalidade total (Z): D. vulgaris: Z=0.642 (otólitos) e 0.727 ano-1 (frequências de comprimento); S. cantharus: Z=0.676 (escamas) e 0.576 ano-1 (frequências de comprimento). As artes de pesca mais importantes para D vulgaris e S. cantharus e para a região considerada são, por ordem de grandeza, o aparelho de anzol e redes de emalhar, e em menor escala a arte do cerco. Os esparídeos diversos e dentro destes a choupa, que deveria ser discriminada nas estatísticas oficiais, constituíram os únicos esparídeos que apresentaram uma evolução com tendência negativa de 1987 a 1998. A estrutura demográfica de desembarques de safia é caracterizada por cerca de 86.9 % indivíduos entre 20.5 a 27.5 cm (2 a 6 anos), enquanto que para a choupa, 85.0% dos indivíduos desembarcados estão compreendidos entre 21.5 e 27.5 cm (2 a 6 anos). No estudo de selectividade foram realizadas 40 pescas experimentais em que se testaram 4 tamanhos de anzol (nº11, 12, 13 e 15) e de malha (80, 70, 60 e 50mm). D. vulgaris e S. cantharus são das espécies mais abundantes na pescaria com aparelho de anzol, tendo uma representação inferior quer em termos relativos, quer absolutos nas capturas das redes de emalhar. Existiu um decréscimo geral das taxas de captura com o tamanho do anzol e uma maior eficiência para os tamanhos intermédios da malha nas redes de emalhar. Paralelamente, existiu para ambas as espécies uma sobreposição de comprimentos médios com o tamanho dos anzóis e uma separação clara de comprimentos médios de ambas as espécies com a malhagem. Adoptaram-se, com bom ajuste, uma curva de selectividade do tipo logística para o aparelho de anzol e normal para as redes de emalhar, para ambas as espécies. Atendendo a uma eventual revisão dos tamanhos mínimos legais de desembarque, em função dos tamanhos de primeira maturação e à estrutura das capturas, as malhas de 70 e 80mm são as mais adequadas na pescaria de D. vulgaris e S. cantharus, respectivamente. O anzol número 13 será o mais apropriado a D. vulgaris, dada a pouca praticabilidade do anzol 15. Em relação a S. cantharus o anzol nº 11 apresenta a menor proporção de indivíduos com tamanho ilegal, sendo então o mais indicado à pescaria desta espécie. Para o aparelho de anzol e de acordo com os modelos de rendimento por recruta a pescaria de safia processa-se de forma moderada, a níveis inferiores a uma taxa de exploração máxima (Emax) suportável pelo "stock". A pescaria de choupa apresenta indícios de uma exploração intensa, próxima dos valores máximos comportados pelo "stock". Uma alteração nos valores actuais da taxa de exploração e/ou de comprimento de 1ª captura terá de ter em consideração o carácter multiespecifico desta pescaria. Visando a gestão destes recursos pesqueiros, dever-se-á controlar principalmente o nível do esforço de pesca praticado e rever os tamanhos mínimos de desembarque, de modo a evitar que esta pescaria entre numa fase de sobreexploração. O estabelecimento de reservas marinhas e de recifes artificiais poderá ser um contributo para uma exploração pesqueira sustentada e para a conservação da biodiversidade.

Study of transcripts and reactive oxygen species involved in the defence responses of Quercus suber against Phytophthora cinnamomi

The present work has the merit of exploring an insight into the activation of defence genes of Quercus suber during response to infection by Phytophthora cinnamomi. Thus, cDNA-AFLP methodology was used to identify gene fragments differentially present in the mRNA profiles of host cells of micropropagated Q. suber plantlets roots infected with zoospores of P. cinnamomi at different post challenge time points. Six candidate genes were selected based on their interesting cDNA-AFLP expression patterns and homology to genes known to play a role in defence. These six genes encode a cinnamyl alcohol dehydrogenase 2 (QsCAD2), a protein disulphide isomerase (QsPDI), a CC-NBS-LRR resistance protein (QsRPc), thaumatin-like protein (QsTLP), chitinase (QsCHI) and a 1,3-beta glucanase (QsGLU). The current work has been successful in evaluation of the expression of these genes by qRT-PCR. Data analysis revealed that transcript levels of QsRPc, QsCHI, QsCAD2 and QsPDI increased during the early hours of inoculation, while transcript profiles of thaumatin-like protein showed decreasing. No expression was detected for 1,3-beta-glucanase (QsGLU). Furthermore, the choice of suitable reference genes in any new experimental system is absolutely crucial in qRT-PCR; for this reason in this study and for the first time a set of potential reference genes were analyzed and validated for qRT-PCR normalization in the patho-system Phytophthora-Q. suber. Four candidate reference genes polimerase II (QsRPII), eukaryotic translation initiation factor 5A(QsEIF-5A), b-tubulin (QsTUB) and a medium subunit family protein of Clathrin adaptor complexes (QsCACs) were evaluated to determine the most stable internal references in Q. suber. Analysis of stability of genes was carried out using Genex software. Results indicated all these four potential reference genes assumed stable expression. Data analysis revealed that QsRPII and QsCACs were the two most stable genes, while genes QsTUB and QsEIF-5A were the third and the fourth most stable gene, respectively. In this study, a plasmid-based quantitative PCR method was developed to measure P. cinnamomi colonization during infection process of Q. suber. Plasmid-based detection of P. cinnamomi showed a gradual accumulation of the pathogen DNA in cork oak root tips up to 24 h post infection. The higher increase in P. cinnamomi/plasmid DNA ratio occurred between 18 and 24 h. One of the primary objectives of this research was to study the effect of cinnamomins (elicitins secreted by P. cinnamomin) on inducing defence mechanism against the pathogen, as recent histological and ultra-structural studies showed that P. cinnamomi was restricted to the outer cortex root fragments pre-treated with capsicien and cryptogein, suggesting that elicitins can stimulate plant defence reactions against P. cinnamomi. To complement these studies and to have a clear view of the nature of the interaction, the role of cinnamomins in the production of the oxidative burst [ROS and ROS scavenging enzymes such as superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and peroxidase (POD)] and in the defence responses was evaluated. Cork oak seedlings were pretreated with alpha-cinnamomin and then inoculated with P. cinnamomi mycelia. Results showed a significant higher production of reactive oxygen species (ROS) (H2O2 and O2•-) in elicitin and non-elicitin treated roots in interaction with P. cinnamomi in comparison to the corresponding control. The plant group inoculated with the pathogen after cinnamomin treatment showed an earlier increase in H2O2 production but this was lower as compared with that group inoculated with P. cinnamomi alone. Also, in elicitin pre-treated group generally, a lower level of O2•− production during infection was observed as compared with inoculated roots with P. cinnamomi alone without elicitin treatment. Furthermore, in this study, we evaluated activities of antioxidant enzymes upon challenge with P. cinnamomi, with and without pretreatment with alpha cinnamomin. Results indicated that the activities of defense enzymes POD, SOD and CAT increased after P. cinnamomi inoculation when compared with those in the control group. Also, in the group treated with alpha-cinnamomin followed by P. cinnamomi inoculation, a higher level of enzymatic activities was detected as compared with elicitin non-treated group, which suggest the protective effect of alpha-cinnamomin against the pathogen due to higher elevated levels of defense enzymes POD, SOD and CAT during the infection period. Furthermore, a sensitive qPCR method was applied to measure the pathogen biomass in elicited and non-elicited Q. suber roots challenged with P. cinnamomi to elucidate the effect of cinnamomins on the colonization of P. cinnamomi. Plasmid-based quantification of P. cinnamomi showed a significant decrease in accumulation of the pathogen DNA in cork oak roots after treatment with alpha and beta-cinnamomins which attest the role of cinnamomins in promoting defense responses in cork oak against P. cinnamomi invasion.

Extração e estudo das proteínas da goma da alfarroba com vista à sua clarificação

O objectivo primordial deste trabalho foi efectuar a extracao e o estudo das proteinas da Goma da Alfarroba ou Locust Bean Gum (LBG) com vista a sua clarificacao e purificacao. Para atingir este objectivo em primeiro lugar estudou-se o teor de etanol que se deveria utilizar numa suspensao aquosa de LBG, uma vez que a LBG e um polissacarido que hidrata facilmente com agua e consequentemente origina solucoes altamente viscosas que impossibilitam a realizacao de tecnicas de extracao de proteinas. Para isso estudou-se o comportamento da LBG em suspensoes aquosas com 10% (p/v) de LBG e diferentes concentracoes de etanol, designadamente 10% (v/v), 20% (v/v), 30% (v/v) e 40% (v/v). Com este estudo concluiu-se que seria necessario utilizar uma concentracao de 40% (v/v) de etanol a 96% em cada suspensao de LBG a 10% (p/v) para conseguir evitar a sua hidratacao excessiva. Assim, todas as extracoes neste trabalho foram realizadas de acordo com estas condicoes. Posteriormente com vista a extracao das proteinas da LBG testaram-se diferentes tratamentos, designadamente tratamentos alcalinos, acidos e com detergentes. Segundo a bibliografia consultada para os tratamentos alcalinos, realizaram-se estas extracoes com hidroxido de sodio (NaOH) com concentracoes de 0,025 M, 0,05M, 0,1M e 0,2M. Estes tratamentos foram iniciados com uma concentracao de NaOH a 0,2M, contudo apos analise dos resultados verificou-se que esta originou uma LBG com uma coloracao mais amarela do que a LBG bruta (inicial) apresentava. Sendo a ideia final a clarificacao da goma este nao foi um resultado desejavel e como tal testaram-se concentracoes inferiores de NaOH, acima referidas. No final concluiu-se que todas estas extracoes efetuadas com NaOH originavam uma LBG mais amarela do que a LBG bruta e que assim este nao seria o tratamento mais adequado para o objectivo pretendido. Como tal prosseguiram-se os estudos com um tratamento acido, que atraves de consulta bibliografica se iniciou com acido sulfurico (H2SO4). O tratamento acido iniciou-se com uma concentracao de H2SO4 de 0,1M, testando-se posteriormente tambem uma extracao com H2SO4 com concentracao de 0,05M. No final destas extracoes verificou-se que a LBG obtida em ambas apresentava uma coloracao mais clara do que a LBG bruta, o que representava, numa primeira analise, um bom resultado. Por fim efectuaram-se extracoes solido-liquido com diferentes detergentes, designadamente com Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 65, Tween 80, Tween 85, Triton X-100, Triton X-114 e SDS todos a uma concentracao de 0,1% (v/v) a excepcao do Tween 65 em que foi utilizada uma concentracao de 0,1% (p/v), porque a temperatura ambiente este detergente e solido. No final destas extracoes concluiu-se que na maioria dos casos a LBG apresentava uma coloracao mais clara do que a LBG bruta. Para quantificar as proteinas extraidas atraves de cada um dos tratamentos acima mencionados utilizaram-se dois metodos, o metodo de Bradford para quantificar as proteinas presentes nos sobrenadantes das extracoes e o metodo de Kjeldahl para quantificar as proteinas ainda presentes na LBG apos as extracoes. Analisando os resultados obtidos por estes metodos concluiu-se que a extracao efetuada com Tween 80, em que se efectuou uma lavagem adicional a LBG durante a filtracao com uma solucao de agua destilada e etanol a 40% (v/v), foi a que apresentou melhores resultados. Assim, foi com esta amostra proteica que se prosseguiram os estudos as proteinas. Para realizar os estudos as proteinas extraidas efectuou-se uma eletroforese em SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) com o intuito de verificar o estado da amostra. Analisando os geles obtidos constatou-se que a amostra se encontrava em boas condicoes. Deste modo realizou-se uma eletroforese bidimensional (2 – D) das proteinas extraidas da LBG. Nesta tecnica, como se desconheciam que tipo de proteinas se encontravam presentes na amostra utilizou-se uma banda de pH para a Focagem Isoelectrica (1a Dimensao) entre 3 e 10 e a separacao por Peso Molecular (2a Dimensao) foi efetuada em SDS-PAGE. Analisando os geles obtidos concluiu-se que a maioria das proteinas presentes nesta amostra apresentam pontos isoelectricos na gama de pH entre 5 e 6 e tem pesos moleculares entre 40 e 60 kDa. Pode-se entao concluir que o objectivo deste trabalho foi apenas parcialmente atingido uma vez que se conseguiu extrair e estudar algumas das caracteristicas das proteinas presentes na LBG, mas nao se alcancou a sua clarificacao.

In vitro blood-brain barrier models to predict the permeation of gene therapy vectors into the brain

A terapia génica tem-se revelado uma alternativa relevante no tratamento de doenças neurodegenerativas (DN). Contudo, a entrega de vetores para transferência génica no cérebro representa ainda um enorme desafio devido à presença da barreira hemato-encefálica (BHE). A BHE é uma interface dinâmica e seletiva entre o sangue e o cérebro, constituída pelas células endoteliais cerebrais, astrócitos e pericitos, desempenhando um importante papel na regulação da homeostasia cerebral. A BHE representa um dos maiores obstáculos no tratamento de DN, uma vez que esta barreira impede o transporte para o cérebro da maioria das moléculas terapêuticas, incluindo os vetores para terapia génica. Embora tenham sido desenvolvidos diferentes modelos in vitro da BHE de forma a avaliar o transporte de fármacos através da BHE, muito poucos foram criados com o intuito de testar a permeabilidade desta barreira a vetores de terapia génica. O presente trabalho teve como objetivo principal o desenvolvimento e a avaliação de modelos in vitro de BHE que permitam a investigação da capacidade dos vetores de terapia génica de penetrarem no cérebro. No nosso estudo, foram testados diferentes modelos in vitro de BHE em monocultura, constituídos por células endoteliais de rato ou murganho (RBE4 e bEnd3, respetivamente), e modelos de co-cultura, que combinam células endoteliais com células neuronais (Neuro2a) ou astrócitos primários, cultivados num sistema transwell. Para caraterizar estes modelos foram realizados testes de permeabilidade e de resistência elétrica transendotelial, bem como estudos baseados na técnica de PCR quantitativo e na imunocitoquímica das proteínas das junções intercelulares. Verificámos que os modelos baseados na cultura de células bEnd3 e células neuronais ou astrócitos apresentavam as melhores propriedades de barreira. Posteriormente foi avaliada nos modelos selecionados a penetração de um vetor não-viral que reconhecidamente tem a capacidade de atravessar in vivo a BHE: o peptídeo da glicoproteína do vírus da raiva (RGV-9r). Os siRNAs marcados com um fluoróforo e acoplados ao peptídeo RVG-9r foram capazes de penetrar eficientemente as células bEnd3, localizadas no lado luminal do insert, via endocitose mediada por recetores, e ainda de penetrar os astrócitos ou células neuronais, previamente cultivadas no lado abluminal. Estes resultados correlacionam-se, de forma clara, com os resultados previamente descritos em estudos in vivo. Em conclusão, os modelos in vitro de BHE baseados na co-cultura de células bEnd3 com células Neuro2a ou astrócitos, têm grande potencial na seleção de candidatos a vetores de terapia génica para o cérebro, uma vez que apresentam importantes características da BHE e se baseiam num método fácil e reprodutível. Tal facto representa uma promessa significativa para a identificação de novas estratégias de terapia génica não invasiva para o tratamento de doenças neurológicas.