Conception, synthèse et caractérisation de nouvelles macromolécules branchées biocompatibles pour encapsuler des principes actifs hydrophobes

La vectorisation des médicaments est une approche très prometteuse tant sur le plan médical qu’économique pour la livraison des substances actives ayant une faible biodisponibilité. Dans ce contexte, les polymères en étoile et les dendrimères, macromolécules symétriques et branchées, semblent être les solutions de vectorisation les plus attrayantes. En effet, ces structures peuvent combiner efficacement une stabilité élevée dans les milieux biologiques à une capacité d’encapsulation des principes actifs. Grâce à leur architecture bien définie, ils permettent d’atteindre un très haut niveau de reproductibilité de résultats, tout en évitant le problème de polydispersité. Bien que des nombreuses structures dendritiques aient été proposées ces dernières années, il est cependant à noter que la conception de nouveaux nanovecteurs dendritiques efficaces est toujours d’actualité. Ceci s’explique par des nombreuses raisons telles que celles liées à la biocompatibilité, l’efficacité d’encapsulation des agents thérapeutiques, ainsi que par des raisons économiques. Dans ce projet, de nouvelles macromolécules branchées biocompatibles ont été conçues, synthétisées et évaluées. Pour augmenter leur efficacité en tant qu’agents d’encapsulations des principes actifs hydrophobes, les structures de ces macromolécules incluent un coeur central hydrophobe à base de porphyrine, décanediol ou trioléine modifié et, également, une couche externe hydrophile à base d’acide succinique et de polyéthylène glycol. Le choix des éléments structuraux de futures dendrimères a été basé sur les données de biocompatibilité, les résultats de nos travaux de synthèse préliminaires, ainsi que les résultats de simulation in silico réalisée par une méthode de mécanique moléculaire. Ces travaux ont permis de choisir des composés les plus prometteurs pour former efficacement et d’une manière bien contrôlable des macromolécules polyesters. Ils ont aussi permis d’évaluer au préalable la capacité de futurs dendrimères de capter une molécule médicamenteuse (itraconazole). Durant cette étape, plusieurs nouveaux composés intermédiaires ont été obtenus. L’optimisation des conditions menant à des rendements réactionnels élevés a été réalisée. En se basant sur les travaux préliminaires, l’assemblage de nouveaux dendrimères de première et de deuxième génération a été effectué, en utilisant les approches de synthèse divergente et convergente. La structure de nouveaux composés a été prouvée par les techniques RMN du proton et du carbone 13C, spectroscopie FTIR, UV-Vis, analyse élémentaire, spectrométrie de masse et GPC. La biocompatibilité de produits a été évaluée par les tests de cytotoxicité avec le MTT sur les macrophages murins RAW-262.7. La capacité d’encapsuler les principes actifs hydrophobes a été étudiée par les tests avec l’itraconazole, un antifongique puissant mais peu biodisponible. La taille de nanoparticules formées dans les solutions aqueuses a été mesurée par la technique DLS. Ces mesures ont montré que toutes les structures dendritiques ont tendance à former des micelles, ce qui exclue leurs applications en tant que nanocapsules unimoléculaires. L’activité antifongique des formulations d’itraconazole encapsulé avec les dendrimères a été étudiée sur une espèce d’un champignon pathogène Candida albicans. Ces tests ont permis de conclure que pour assurer l’efficacité du traitement, un meilleur contrôle sur le relargage du principe actif était nécessaire.

Développement de nouvelles formulations d’antifongiques et évaluation de l’activité sur Candida spp. et Aspergillus spp.

Les travaux effectués dans le cadre de cette thèse de doctorat avaient pour but de mettre au point des nouvelles formulations d’antifongiques sous forme de nanoparticules polymériques (NP) en vue d’améliorer l’efficacité et la spécificité des traitements antifongiques sur des souches sensibles ou résistantes de Candida spp, d’Aspergillus spp et des souches de Candida albicans formant du biofilm. Dans la première partie de ce travail, nous avons synthétisé et caractérisé un polymère à base de polyester-co-polyéther branché avec du poly(éthylène glycol) (PEG-g-PLA). En plus d’être original et innovant, ce co-polymère a l’avantage d’être non-toxique et de posséder des caractéristiques de libération prolongée. Trois antifongiques couramment utilisés en clinique et présentant une biodisponibilité non optimale ont été choisis, soient deux azolés, le voriconazole (VRZ) et l’itraconazole (ITZ) et un polyène, l’amphotéricine B (AMB). Ces principes actifs (PA), en plus des problèmes d’administration, présentent aussi d’importants problèmes de toxicité. Des NP polymériques encapsulant ces PA ont été préparées par une technique d’émulsion huile-dans-l’eau (H/E) suivie d’évaporation de solvant. Une fois fabriquées, les NP ont été caractérisées et des particules de d’environ 200 nm de diamètre ont été obtenues. Les NP ont été conçues pour avoir une structure coeur/couronne avec un coeur constitué de polymère hydrophobe (PLA) et une couronne hydrophile de PEG. Une faible efficacité de chargement (1,3% m/m) a été obtenue pour la formulation VRZ encapsulé dans des NP (NP/VRZ). Toutefois, la formulation AMB encapsulée dans des NP (NP/AMB) a montré des taux de chargement satisfaisants (25,3% m/m). En effet, le caractère hydrophobe du PLA a assuré une bonne affinité avec les PA hydrophobes, particulièrement l’AMB qui est le plus hydrophobe des agents sélectionnés. Les études de libération contrôlée ont montré un relargage des PA sur plusieurs jours. La formulation NP/AMB a été testée sur un impacteur en cascade, un modèle in vitro de poumon et a permis de démontrer le potentiel de cette formulation à être administrée efficacement par voie pulmonaire. En effet, les résultats sur l’impacteur en cascade ont montré que la majorité de la formulation s’est retrouvée à l’étage de collecte correspondant au niveau bronchique, endroit où se situent majoritairement les infections fongiques pulmonaires. Dans la deuxième partie de ces travaux, nous avons testé les nouvelles formulations d’antifongiques sur des souches planctoniques de Candida spp., d’Aspergillus spp. et des souches de Candida albicans formant du biofilm selon les procédures standardisées du National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS). Les souches choisies ont démontré des résistances aux azolés et aux polyènes. Les études d’efficacité in vitro ont permis de prouver hors de tout doute que les nouvelles formulations offrent une efficacité nettement améliorée comparée à l’agent antifongique libre. Pour mettre en lumière si l’amélioration de l’efficacité antifongique était due à une internalisation des NP, nous avons évalué le comportement des NP avec les cellules de champignons. Nous avons procédé à des études qualitatives de microscopie de fluorescence sur des NP marquées avec de la rhodamine (Rh). Tel qu’attendu, les NP ont montré une localisation intracellulaire. Pour exclure la possibilité d’une simple adhésion des NP à la surface des levures, nous avons aussi confirmé leur internalisation en microscopie confocale de fluorescence. Il est important de noter que peu d’études à ce jour ont mis l’accent sur l’élaboration de nouvelles formulations d’antifongiques à base de polymères non toxiques destinées aux traitements des mycoses, donnant ainsi une grande valeur et originalité aux travaux effectués dans cette thèse. Les résultats probants obtenus ouvrent la voie vers une nouvelle approche pour contourner les problèmes de résistances fongiques, un problème de plus en plus important dans le domaine de l’infectiologie.

Analyse des altérations de l'immunité T-dépendante à l'égard de Candida albicans chez la souris transgénique exprimant le génome du VIH-1

La candidose oro-pharyngée (COP) est l’infection fongique opportuniste la plus commune chez les individus infectés par le VIH-1. La production des cytokines Il-17 et Il-22 par les lymphocytes Th17 est importante lors de la résolution de la COP, puisque ces cytokines induisent la production de peptides antifongiques et le recrutement des neutrophiles polymorphonucléaires. Toutefois, les lymphocytes Th17 sont préférentiellement déplétés chez les individus infectés par le VIH-1. Le modèle de COP chez la souris transgénique (Tg) CD4C/HIVMutA, exprimant les gènes nef, env et rev du VIH-1, permettra de déterminer si des altérations quantitatives et/ou fonctionnelles des sous-populations de lymphocytes T CD4+ causent la sensibilité à la candidose. Les sous-populations Th1, Th2, Th1Th17, Th17 et Treg, ainsi que leurs précurseurs, les lymphocytes T CD4+ naïfs, sont sévèrement déplétées dans les ganglions cervicaux de la souris Tg. Cependant, les lymphocytes T CD4+ naïfs conservent la capacité à se différencier in vitro en présence de cytokines polarisantes et à produire les cytokines typiques des diverses sous-populations. De plus, les cytokines requises pour la polarisation des lymphocytes T CD4+ naïfs n’étaient pas réduites dans les ganglions cervicaux des souris Tg, 7 jours après le début de l’infection. Les gènes S100a8, Ccl20, Il17 et Il22 étaient surexprimés en réponse à la COP chez la souris non-Tg, mais pas chez la souris Tg. Le traitement de souris Tg infectées à l’aide de la combinaison des cytokines Il-17 et Il-22 réduit significativement la charge fongique buccale de C. albicans et le nombre d’hyphes dans l’épithélium de la langue et restaure la capacité à surexprimer des gènes S100a8, Ccl20 et Il22. Ces résultats démontrent que la perturbation de l’induction de l’immunité innée par l’Il-17 et l’Il-22 augmente la susceptibilité à la COP chez la souris Tg.

Diversity in Structural and Spectural Characteristics of Some Transition Metal Complexes Derived From Aldehyde Based Thiosemicarbazone Ligands

The study deals with the diversity in structural and spectural characteristics of some transition metal complexes derived from aldehyde based thiosemicarbazone ligands thiosemicarbazones are a family of compounds with beneficial biological activity viz., anticancer,antitumour, antifungal, antibacterial, antimalarial, antifilarial, antiviral and anti-HIV activities. Many thiosemicarbazone ligands and their complexes have been prepared and screened for their antimicrobial activity against various types of fungi and bacteria. The results prove that the compounds exhibit antimicrobial properties and it is important to note that in some cases metal chelates show more inhibitory effects than the parent ligands. The increased lipophilicity of these complexes seems to be responsible for their enhanced biological potency. Adverse biological activities of thiosemicarbazones have been widely studied in rats and in other species. The parameters measured show that copper complexes caused considerable oxidative stress and zinc zinc complexes behaved as antioxidants. It has applications on analytical field also. Some thiosemicarbazones produce highly colored complexes with metal ions. This thesis aims to synthesis some novel thiosemicarbazone ligands and their transition metal complexes together with their physico-chemical characterization.

Crystal Structures and Spectral Aspects of Mixed Ligand Transition Metal Chelates Derived from Aldehyde based ONS Donor Thiosemicarbazones

Thiosemicarbazones have emerged as an important class of ligands over a period of time, for a variety of reasons, such as variable donor properties, structural diversity and biological applications. Interesting as the coordination chemistry may be, the driving force for the study of these ligands has undoubtedly been their biological properties and the majority of the 3000 or so publications on thiosemicarbazones since 2000 have alluded to this feature. Thiosemicarbazones with potential donor atoms in their structural skeleton fascinate coordination chemists with their versatile chelating behavior. The thiosemicarbazones of aromatic aldehydes and ketones form stable chelates with transition metal cations by utilizing both their sulfur and azomethine nitrogen as donor atoms. They have been shown to possess a diverse range of biological activities including anticancer, antitumor, antibacterial, antiviral, antimalarial and antifungal properties owing to their ability to diffuse through the semipermeable membrane of the cell lines. The enhanced effect may be attributed to the increased lipophilicity of the metal complexes compared to the ligand alone.

“Effect of spice oleoresins in microbial decontamination and their potential application in quality stabilization of Tuna (Euthynnus affinis) during storage”

Unprocessed seafood harbor high number of bacteria, hence are more prone to spoilage. In this circumstance, the use of spice in fish for reduction of microorganism can play an important role in seafood processing. Many essential oils from herbs and spices are used widely in the food, health and personal care industries and are classified as GRAS (Generally regarded as safe) substances or are permitted food additives. A large number of these compounds have been the subject of extensive toxicological scrutiny. However, their principal function is to impart desirable flavours and aromas and not necessarily to act as antimicrobial agents. Given the high flavour and aroma impact to plant essential oils, the future for using these compound as food preservatives lies in the careful selection and evaluation of their efficacy at low concentrations but in combination with other chemical preservatives or preservation processes. For this reason they are worth of study alone or in combination with processing methods in order to establish if they could extend the shelf-life of foods. In this study, the effect of the spices, clove, turmeric, cardamom, oregano, rosemary and garlic in controlling the spoilage and pathogenic bacteria is investigated. Their effect on biogenic amine formation in tuna especially, histamine, as a result of bacterial control is also studied in detail. The contribution of spice oleoresin in the sensory and textural parameters is investigated using textural profile analysis and sensory panel. Finally, the potential of spices in quality stabilization and in increasing the shelf–life of tuna during frozen storage is analysed

Actinomycete Isolates from Arabian Sea and Bay of Bengal: Biochemical, Molecular and Functional Characterization

The thesis is comprised of seven chapters. Chapter 1 gives a general introduction to marine actinomycetes; Chapter 2 gives an account on the morphological, biochemical and physiological characterization of marine actinomycetes. Comprehensive description of molecular identification and phylogenetic analysis of actinomycetes is dealt with in Chapter 3. The antimicrobial property with special reference to antivibrio activity is described in Chapter 4. Chapter 5 explores the melanin production ability of marine actinomycetes, characterization of melanin and evaluation of its bioactivity. Chapter 6 illustrates the study on chitinolytic Streptomyces as antifungal and insecticidal agents. Summary and Conclusion of the study is presented in Chapter 7, followed by References and Appendices.The present study provides an insight into the various actinomycetes occurring in the sediments of Arabian Sea and Bay of Bengal. Streptomyces was found to be the dominant group followed by Nocardiopsis. Eventhough generic level identification is possible by traditional phenotypic methods, species level identification necessitate a polyphasic approach including both phenotypic and genotypic characterization. Antibiotic production coupled with biogranulation property helped in the effective utilization of the actinomycetes for the control of vibrios. Melanin from Streptomyces bikiniensis was proved to be a promising antioxidant and photoprotectant. Marine actinomycetes were found to be a good source of hydrolytic enzymes and the chitinolytic isolates could be explored as biocontrol agents in terms of antifungal and insecticidal property. The present study explored the potential of marine actinomycetes especially Streptomycetes as a promising source of bioactive molecules for application in aquaculture and pharmaceutical industry.

Caracterització de metabòlits produïts per soques de "Pseudomonas fluorescens" efectives en el control biològic de fongs fitopatògens

El principal objectiu d'aquest treball ha estat estudiar la producció de metabòlits amb activitat antibiòtica per soques de l'espècie Pseudomonas fluorescens de la col·lecció EPS, i també avaluar la seva potencialitat com a agents de biocontrol. Es va disposar també de diverses soques de P. fluorescens, cedides per altres investigadors, que van utilitzar-se com a referència perquè algunes són actives en control biològic i produeixen metabòlits secundaris d'interès en el biocontrol de malalties de plantes. La present memòria s'estructura en cinc capítols, que són, introducció al control biològic, descripció de l'etapa de selecció de soques i cerca dels metabòlits produïts, estudi de la producció d'HCN per la soca EPS288, estudi de la producció de l'antibiòtic 2,4-diacetilfloroglucinol (DAPG), i finalment, el darrer capítol, on s'ha estudiat la producció de DAPG sobre material vegetal i la capacitat de colonitzar arrels per diverses soques d'interès. En l'etapa de prospecció, va demostrar-se que un 37% del total de les soques de la col·lecció EPS produïen HCN, totes de l'espècie P. fluorescens, i un 90% d'aquestes provenien de les arrels de plantes. Es va confirmar la producció dels metabòlits secundaris 2,4-diacetilfloroglucinol, àcid fenazina-1-carboxílic, i pirrolnitrina, per diverses soques de la col·lecció EPS seleccionades mitjançant tècniques moleculars. Així, de la col·lecció EPS, les soques EPS317 i EPS808 produeixen DAPG, la EPS263 àcid fenazina-1-carboxílic i pirrolnitrina i, EPS894, EPS895, EPS945 produeixen àcid fenazina-1-carboxílic. La producció d'HCN es va estudiar més exhaustivament en la soca EPS288, seleccionada per la seva activitat antifúngica i candidata a agent de biocontrol contra Stemphylium vesicarium, causant de la estemfiliosi de la perera, i contra Penicillium expansum, causant de la podridura blava en conservació de fruita a postcollita. Per aquest estudi, es va dissenyar i validar un sistema per recollir l'HCN a partir de cultius en medi líquid. S'ha demostrat que la temperatura d'incubació, la concentració cel·lular de sembra i la composició del medi de cultiu afectaven a la producció d'HCN. Els medis complexos i la glicina n'afavorien la síntesi i la font de carboni no afectava. La soca EPS288 va produir més HCN que P. fluorescens CHA0, soca de referència productora d'HCN i descrita com a activa en processos de biocontrol de fongs fitopatògens. En l'estudi de la producció de DAPG, les soques de la col·lecció EPS i de referència, es van comparar en diversos medis de cultiu estudiant l'efecte de la complexitat i consistència del medi, i l'addició de ferro o de glucosa. Va demostrar-se que la producció de DAPG depèn principalment de la soca i de les característiques del medi de cultiu. La glucosa estimula la producció, mentre que el ferro pràcticament no afecta, i en general, el medi sòlid i complex estimula la producció de DAPG. Tanmateix, aquests efectes varien en alguna de les soques assajades donant lloc a comportaments singulars. En el seguiment del creixement amb un sistema automàtic es va comprovar que la velocitat específica de creixement i la concentració cel·lular assolida al final del cultiu, estaven condicionades per la composició del medi de cultiu. En les proves d'antagonisme vers fitopatògens que foren seleccionats com a indicadors, va observar-se que tant l'antagonisme in vitro com la inhibició d'infeccions sobre material vegetal estaven parcialment relacionades amb la producció dels metabòlits secundaris estudiats. La promoció del creixement de portaempelts per aquestes soques depenia de la soca i de l'hoste, però no es pogué establir una relació causa-efecte amb el metabòlits produïts. També es va comprovar que algunes de les soques podien sobreviure en ferides de pomes i de peres, on produïren DAPG. Mutants resistents a rifampicina de diverses soques de la col·lecció EPS i de referència es van inocular en llavors de pomera i de tomatera que es van sembrar i incubar en condicions controlades. Es va fer el seguiment de la població bacteriana total i resistent a rifampicina present a les arrels durant 72 dies. Totes les soques van colonitzar les arrels de les plantes, mantenint una elevada població durant 37 dies, cap d'elles va estimular el creixement ni mostrar efectes fitotòxics, no afectant tampoc signicativament a la població bacteriana espontània de les arrels. La soca EPS808, una de les seleccionades pel treball, va aconseguir uns nivells de producció de DAPG, una velocitat de creixement i una supervivència relativa a les arrels similar a altres soques de referència descrites com a bons agents de biocontrol. En conseqüència, se la considera una candidata a agent de biocontrol que hauria de ser objecte de futurs estudis d'eficàcia.

Vida y obra de Pere Torroella

"ADVERTIMENT. La versió definitiva d'aquesta tesi doctoral està en premsa a l'editorial Barcino, Col·lecció Els Nostres Clàssics, Barcelona. En la nova versió s'hi han introduit nombroses millores, nous capítols i correccions importants. Es prega que, per a qualsevol citació, s'utilitzi la versió definitiva" Pere de Torroella ingresó en la corte de Juan de Navarra (luego Juan II de Aragón) en 1436, a quien sirvió como escudero y copero tanto en las escaramuzas de Castilla como en la corte de Navarra, donde fue sirviente de Carlos de Aragón, Príncipe de Viana e hijo del rey Juan. A finales de 1450 se trasladó a Nápoles junto don Juan de Aragón, hijo bastardo de Juan de Navarra. Permaneció allí hasta la muerte del rey Alfonso el Magnánimo en 1458. Durante esos años entabló amistad con humanistas como Giovanni Pontano, y ejerció de mayordomo del príncipe bastardo Juan II de Aragón, a quien Pere Torroella sirvió durante toda su vida. A finales de 1450 se trasladó a Nápoles junto don Juan de Aragón, hijo bastardo de Juan de Navarra. Permaneció allí hasta la muerte del rey Alfonso el Magnánimo en 1458. Durante esos años entabló amistad con humanistas como Giovanni Pontano, y ejerció de mayordomo del príncipe bastardo. En 1458, tras la muerte del rey Alfonso y el ascenso al trono de su hermano Juan, Pere Torroella se trasladó a Zaragoza y Barcelona como emisario de Carlos de Viana, a quien sirvió hasta su muerte, en 1461. Un año después, en 1462, estalló la guerra civil catalana (que enfrentó a la Generalitat de Catalunya y a la monarquía aragonesa), y Torroella luchó en los primeros años junto a los rebeldes. En 1464 se pasó al bando real, al que permaneció fiel hasta el final de la guerra, en 1472. Desde 1472 hasta su muerte (acaecida seguramente en 1492), Pere Torroella ejerció de consejero del rey Juan II en Barcelona, pero tras la muerte del rey en 1479 se retiró a sus dominios en el Ampurdán, donde murió. Pere Torroella es autor de obra en catalán y en castellano. En la primera lengua compuso lais, canciones al estilo de Ausiàs March, un soneto (el primero documentado en lengua catalana) y un ambicioso poema colectivo que empieza con el verso Tant mon voler. En castellano, es autor de decires amorosos, canciones y esparzas. También mantuvo un intenso intercambio epistolar con influyentes personalidades de las cortes aragonesas, como Francesc Ferrer, Hugo de Urríes, Bernat Hug de Rocabertí y Pedro de Urrea. Compuso, finalmente, varias composiciones en prosa de alto interés histórico y literario, como la Complanta por la muerte de Inés de Clèves (1448), la Consolatoria por la muerte de mosén Martín de Ansa (1451) y el Razonamiento en defensión de las donas, donde el autor se excusa por haber compuesto las famosas coplas de Maldezir de mugeres. Torroella fue una figura central en las cortes aragonesas de la época, y su obra literaria alcanzó gran difusión y estima entre los hombres de su siglo, como muestran sus epistolarios y los autores que decidieron imitar sus versos. Fue, por otro lado, un poeta sensible a las novedades líricas del momento. Asimiló los aspectos más superficiales de la poesía de Ausiàs March, conoció y admiró los versos de Petrarca, leyó con fruición la lírica francesa (y especialmente Oton de Grandson y Guillaume de Machaut), e imitó con destreza las poesía musical de Jordi de Sant Jordi y Martí Garcia. No siempre su gran cultura se vio reflejada en la calidad de sus obras, que presentan, sin embargo, un indudable interés para la historia de la literatura.

Design and synthesis of short antimicrobial peptides for plant protection. Study of their mode of action

Aquesta tesi doctoral està basada en el desenvolupament de nous agents antimicrobians derivats del pèptid híbrid cecropina A-melitina WKLFKKILKVL-NH2 (Pep3) que siguin sostenibles i útils per al control de malalties de plantes. Es van dissenyar i sintetitzar més de 133 anàlegs de Pep3 mitjançant química combinatòria. Es van obtenir anàlegs de Pep3 amb una elevada activitat contra fitopatògens i que presentaven baixa toxicitat. Els millors anàlegs van presentar eficàcies comparables amb pesticides de referència en la prevenció d'infeccions causades per fitopatògens. Es va estudiar el mecanisme d'acció de KKLFKKILKYL-NH2 (BP100) investigant la seva interacció amb models de membrana mitjançant tècniques espectroscòpiques. Es va observar la capacitat de BP100 a induir la permeabilització, la neutralització, i l'agregació de vesícules lipídiques aniòniques a una determinada concentració llindar. Es va deduir una equació que relaciona la CMI d'un pèptid antimicrobià amb la constant de partició i la concentració llindar en la membrana.

Síntesi de base sòlida de pèptids biarílics contenint 5-arilhistidines

Els aminoàcids biarílics es troben en una àmplia varietat de pèptids naturals amb important activitat biològica. Concretament, les arilhistidines formen part de les aciculitines, pèptids amb activitat citotòxica i antifúngica, La reacció de Suzuki-Miyaura és el mètode més versàtil per obtenir biarils assimètrics, encara que, fins el moment, no s'havia aplicat per a l'arilació de l'imidazole de la histidina. L'objectiu general d'aquesta tesi fou demostrar que es podia arilar l'imidazole de la histidina en fase sòlida mitjançant una reacció de Suzuki-Miyaura. En primer lloc, es sintetitzaren 4(5)-metil-5(4)-fenilimidazole i 4(5)-metil-5(4)-(2-metoxifenil)imidazole a través de l'acoblament creuat entre un N-benzilbromoimidazole i el corresponent àcid arilborònic. Posteriorment, s'arilaren 5-bromohistidines utilitzant diversos àcids arilborònics mitjançant una reacció de Suzuki-Miyaura assistida per irradiació micrones, tant en dissolució com en fase sòlida. I finalment, mitjançant aquesta metodología, es sintetitzaren pèptids antimicrobians contenint 5-arilhistidines actius contra bacteris gram-negatius responsables d'importants malalties en plantes com el foc bacterià.

Micoses sistémicas

Este trabalho teve como objetivo a análise das micoses sistémicas, no que respeita à sua identificação, morfologia dos agentes patogénicos que lhes dão origem, onde são endémicas, os sintomas que apresentam, os métodos de diagnóstico e as terapêuticas disponíveis para cada patologia. As micoses sistémicas são infeções causadas por fungos patogénicos primários que têm o trato respiratório como porta de entrada, e a partir daí podem disseminar-se por todo o organismo. Os agentes antifúngicos são usados no tratamento destas infeções, em que, no caso das infeções sistémicas, predominam o uso de cetoconazol (polieno), fluconazol e itraconazol (azóis). Existem ainda estudos que demonstram que as vacinas atenuadas podem ser usadas na profilaxia destas infeções. Com este trabalho conclui-se que as infeções fúngicas estão longe de ser extintas, uma vez que se verifica cada vez mais a existência de resistências por parte dos fungos aos fármacos, sendo o diagnóstico e a terapêutica usada dois parâmetros fundamentais para um tratamento eficaz.

Involvement of phenazine-1-carboxylic acid, siderophores and hydrogen cyanide in suppression of Rhizoetonia solani and Pythium spp. damping-off by Pseudomonas oryzihabitans and Xenorhabdus nematophila

Entomopathogenic bacterial strains Pseudomonas (Flavimonas) oryzihabitans and Xenorhabdus nematophilus, both bacterial symbionts of the entomopathogenic nematodes Steinernema abbasi and S. carpocapsae have been recently used for suppression of soil-borne pathogens. Bacterial biocontrol agents (P. oryzihabitans and X nematophila) have been tested for production of secondary metabolites in vitro and their fungistatic effect,on mycelium and spore development of soil-borne pathogens. Isolates of Pythium spp. and Rhizoctonia solani, the causal agent of cotton damping-off, varied in sensitivity in vitro to the antibiotics phenazine-I-carboxylic acid (PCA), cyanide (HCN) and siderophores produced by bacterial strains shown previously to have potential for biological control of those pathogens. These findings affirm the role of the antibiotics PCA, HCN and siderophores in the biocontrol activity of these entomopathogenic strains and support earlier evidence that mechanisms of secondary metabolites are responsible for suppression of damping-off diseases. In the present studies colonies of R oryzihabitans showed production of PCA with presence of crystalline deposits after six days development and positive production where found as well in the siderophore's assay when X nematophila strain indicated HCN production in the in vitro assays. In vitro antifungal activity showed that bacteria densities of 101 to 10(6)cells/ml have antifungal activity in different media cultures. The results show further that isolates of Pythium spp. and R. solani insensitive to PCA, HCN and siderophores are present in the pathogen population and provide additional justification for the use of mixtures of entomopathogenic strains that employ different mechanisms of pathogen suppression to manage damping-off.

Microbe-associated molecular pattern (MAMP) signatures, synergy, size and charge: influences on perception or mobility and host defence responses

Triggering of defences by microbes has mainly been investigated using single elicitors or microbe-associated molecular patterns (MAMPs), but MAMPs are released in planta as complex mixtures together with endogenous oligogalacturonan (OGA) elicitor. We investigated the early responses in Arabidopsis of calcium influx and oxidative burst induced by non-saturating concentrations of bacterial MAMPs, used singly and in combination: flagellin peptide (flg22), elongation factor peptide (elf18), peptidoglycan (PGN) and component muropeptides, lipo-oligosaccharide (LOS) and core oligosaccharides. This revealed that some MAMPs have additive (e.g. flg22 with elf18) and even synergistic (flg22 and LOS) effects, whereas others mutually interfere (flg22 with OGA). OGA suppression of flg22-induced defences was not a result of the interference with the binding of flg22 to its receptor flagellin-sensitive 2 (FLS2). MAMPs induce different calcium influx signatures, but these are concentration dependent and unlikely to explain the differential induction of defence genes [pathogenesis-related gene 1 (PR1), plant defensin gene 1.2 (PDF1.2) and phenylalanine ammonia lyase gene 1 (PAL1)] by flg22, elf18 and OGA. The peptide MAMPs are potent elicitors at subnanomolar levels, whereas PGN and LOS at high concentrations induce low and late host responses. This difference might be a result of the restricted access by plant cell walls of MAMPs to their putative cellular receptors. flg22 is restricted by ionic effects, yet rapidly permeates a cell wall matrix, whereas LOS, which forms supramolecular aggregates, is severely constrained, presumably by molecular sieving. Thus, MAMPs can interact with each other, whether directly or indirectly, and with the host wall matrix. These phenomena, which have not been considered in detail previously, are likely to influence the speed, magnitude, versatility and composition of plant defences.

Purification and molecular cloning of antimicrobial peptides from Scots pine seedlings

A novel protocol for rapid and efficient purification of antimicrobial peptides from plant seedlings has been developed. Two peptides with antimicrobial activity, designated p1 and p2, were purified nearly to homogeneity from Scots pine seedlings by a combination of sulfuric acid extraction, ammonium sulfate precipitation, heat-inactivation and ion-exchange chromatography on phosphocellulose. Purified proteins had molecular masses of 11 kDa (p1) and 5.8 kDa (p2) and were identified by mass spectrometry as defensin and lipid-transfer protein, respectively. We demonstrated their growth inhibitory effects against a group of phytopathogenic fungi. Furthermore, we report for the first time molecular cloning and characterization of defensin I cDNA from Scots pine. A cDNA expression library from 7 days Scots pine seedlings was generated and used to isolate a cDNA clone corresponding to Scots pine defensin, termed PsDef1. The full-length coding sequence of PsDef1 is 252 bp in length and has an open reading frame capable to encode a protein of 83 amino residues. The deduced sequence has the typical features of plant defensins, including an endoplasmic reticulum signal sequence of 33 aa, followed by a characteristic defensin domain of 50 amino acids representing its active form. The calculated molecular weight of the mature form of PsDef1 is 5601.6 Da, which correlates well with the results of SDS-PAGE analysis. Finally, the antimicrobial properties of PsDef1 against a panel of fungi and bacteria define it as a member of the morphogenic group of plant defensins. (C) 2009 Elsevier Inc. All rights reserved.