Subtraktionsundervisningen och lärares erfarenheter om utmaningar : En intervjustudie om subtraktionsundervisningen och vilka utmaningar lärare har samt ser att elever får

Syftet med den här studien har varit att utöka kunskaperna om lärarnas erfarenheter om hur subtraktionsundervisningen genomförs, vilka utmaningar lärarna i den här studien har i undervisningen samt vilka svårigheter eleverna får inom subtraktion. Studien är genomförd med hjälp av intervjuer gjorda med lågstadielärare. Resultatet av den här studien visar på att de flesta lärare genomför sin planering enskilt samt utifrån det tillgängliga läromedlet i klassrummet och samtliga lärare baserar sin undervisning utifrån läromedelsboken. Samtliga lärare har dessutom satt upp mål utifrån kurs- och läroplanen. Det framkommer att lärarna anser det vara utmanande att ge eleverna förståelsen för subtraktion, t.ex. gällande terminologin, och att det är svårt att veta när färdighetsträningen har lett till automatisering. Enligt lärarnas erfarenheter är det tidskrävande att arbeta med konkret material och algoritmerna är utmanande på grund av att de kan lösas på flera sätt. Vidare resultat som framkommer i studien är att lärarna anser att eleverna får svårigheter med förståelsen inom subtraktionen och att räkna algoritmer. Slutsatserna visar på att de medverkande lärarnas undervisning är motivstyrd – de utgår från styrdokument. Lärarna tycks sakna kunskaper om vikten att se till att motiv och resultatet för undervisningen hör ihop. De utmaningar och svårigheter som framkommer genom resultatet tycks bero på en avsaknad av kunskap hos lärarna om ämnet och hur subtraktionsundervisning bör bedrivas.

Kommunikation som verktyg till att utveckla elevers begreppsförståelse i matematik : En empirisk undersökning om hur lärare säger sig använda kommunikation i sin undervisning för att utveckla elevers begreppsförståelse i matematik

Denna studie grundar sig i en tidigare litteraturstudies resultat vilken lyfte fram kommunikation som det främsta verktyget för lärare att använda då det kommer till att utveckla elevers begreppsförståelse. I litteraturstudiens resultat presenterades olika kommunikationsmönster för lärare att använda men också hur elevers vardagliga språk och redan befintliga erfarenheter kring begrepp kan användas för att utveckla den begreppsliga förmågan i matematik. Utifrån det beskrivna resultatet ovan genomfördes en empirisk undersökning i syfte att få kunskap om hur lärare säger sig använda kommunikation i sin undervisning för att utveckla elevers begreppsförståelse i matematik. Resultatet för undersökningen, som grundar sig i lärarintervjuer, visar att kommunikation, på olika sätt, används till att utveckla elevers begreppsförståelse i matematik. Samtliga lärare som intervjuats till studien sa sig alla ta hänsyn till elevers befintliga kunskaper och erfarenheter, samtidigt som några av dem inte sa sig använda inte de informella definitioner som förespråkas i litteraturstudiens resultat. Resultatet synliggjorde också olika kommunikationskonstellationer som lärare lyfte fram i syfte att utveckla elevers begreppsförståelse, men också hur matematikboken kan användas som underlag för kommunikation i ovan nämnda syfte.

Lack of Association Between a 3 ` UTR VNTR Polymorphism of Dopamine Transporter Gene (SLC6A3) and ADHD in a Brazilian Sample of Adult Patients

Objective: To investigate a possible association between a 3`UTR VNTR polymorphism of the dopamine transporter gene (SLC6A3) and ADHD in a Brazilian sample of adult patients. Method: Study Case-control with 102 ADHD adult outpatients (DSM-IV criteria) and 479 healthy controls. The primers` sequence used were: 3`UTR-Forward: 5`TGT GGT GAT GGG AAC GGC CTG AG 3` and 3`UTR-Reverse: 5`CTT CCT GGA GGT CAC GGC TCA AGG 3`. Alleles of the 3`UTR were coded according to their number of repeats: 6- repeat 320 bp (allele 6), 8- repeat 400 bp (allele 8), 9-repeat 480 bp (allele 9), 10- repeat 480 bp (allele 10), and 11- repeat 520 bp (allele 11). Results: There were no allelic (chi(2) = 2.67, 5df, p = .75) and genotypic (chi(2) = 7.20, 1df, p = .61) association between adult ADHD and VNTR 3`UTR polymorphism of SLC6A3. Conclusion: Our findings do not support SLC6A3 as marker genetic susceptibility factor in adult ADHD. More comprehensive polymorphism coverage within the SLC6A3 region should be conducted in larger samples, including comparisons in clinical subgroups, and in samples with different ethnic backgrounds. (J. of Att. Dis. 2011; 15(4) 305-309)

Caracterização físico química, perfil sensorial e aceitação de morangos submetidos à irradiação

A irradiação de alimentos é um método de conservação não térmico utilizado em diferentes alimentos e em diferentes doses. Sabe-se que, dependendo da dose aplicada, esse método pode ocasionar alterações nas características físico-químicas e sensoriais, que afetam a qualidade do produto. Portanto, um dos objetivos deste estudo foi analisar o efeito da irradiação nas características físico-químicas e sensoriais de morangos irradiados. A irradiação das amostras de morango ocorreu um dia após a colheita e foi realizada no Laboratório de Radiação Gama do Centro de Desenvolvimento da Tecnologia Nuclear (CDTN), em Belo Horizonte-MG. As doses utilizadas foram 1 kGy, 2 kGy, 3 kGy e 4 kGy e a amostra controle (0 kGy). Foram avaliados pH, acidez total titulável, sólidos solúveis, ratio (relação entre teor de sólidos solúveis e acidez total titulável), açúcares redutores, totais e não redutores, pectina, ácido ascórbico, firmeza, cor, antocianinas, compostos fenólicos e capacidade antioxidante. Para a caracterização sensorial das amostras, foi utilizado o método Perfil Descritivo Otimizado (PDO), sendo avaliados os atributos sensoriais cor, sabor adocicado, gosto ácido, firmeza e suculência, por 15 julgadores previamente selecionados. Além da caracterização sensorial, foi realizada a análise de aceitação sensorial por 60 consumidores de morango em duas sessões. A irradiação não alterou significativamente a maioria das características físico-químicas analisadas, ao comparar todas as doses empregadas, incluindo o morango controle (não irradiado); apenas a firmeza apresentou valores diferentes estatisticamente: com o aumento da dose, houve diminuição da firmeza do fruto. No PDO, as amostras diferiram quanto à cor, sabor adocicado, firmeza e suculência, sendo que a amostra controle e a amostra irradiada com 1 kGy tiveram maiores valores de firmeza e menores de suculência e sabor adocicado. Em relação à aceitação, a amostra controle e a amostra irradiada com 1 kGy não diferiram estatisticamente pelo teste Tukey a 5%, mas diferiram das amostras irradiadas com doses de 3 kGy e de 4 kGy; no entanto, a amostra irradiada a 2 kGy não diferiu de nenhuma outra dose. Foram realizados estudos de correlações entre os dados físico-químicos de pH, acidez total titulável (ATT), sólidos solúveis (SS), açúcares totais e açúcares não redutores, antocianina (método pH diferencial), pectina, firmeza instrumental, relação entre SS/ATT (ratio) e alguns parâmetros de cor (a*, b*, c* e L), e os dados do teste sensorial descritivo, ou seja, os atributos de firmeza, suculência, sabor adocicado e gosto ácido. Os resultados obtidos foram correlações significativamente positivas entre pH e ratio, sólidos solúveis e pectina, antocianinas e parâmetros de cor (a* e c*), açúcares e parâmetros de cor (b* e c*), firmeza sensorial e firmeza instrumental, suculência e sabor xvi adocicado e firmeza sensorial e gosto ácido. Já as correlações negativas foram entre acidez e ratio, sólidos solúveis e firmeza, antocianina e L*, firmeza sensorial e sabor adocicado e suculência com: firmeza instrumental, firmeza sensorial e gosto ácido. Neste trabalho, também foi realizada a caracterização físico-química e sensorial de morangos irradiados nas doses determinadas por Lima Filho et al. (2014) como sendo correspondentes ao limiar de detecção (LD) sensorial (0,405 kGy) e ao limiar de rejeição (LR) sensorial (3,6 kGy) para morangos irradiados. Além disso, foi verificada a influência da embalagem na aceitação sensorial de morangos irradiados na dose 3,6 kGy. Todas as medidas físico-químicas apresentaram pequena variação entre as amostras controle (0 kGy) e o LD e o LR. Não houve diferença significativa em relação à aceitação da amostra irradiada na ausência e na presença da embalagem, provavelmente devido ao grau de conhecimento do painel de consumidores em relação ao processo de irradiação de alimentos. Conclui-se que a irradiação é um método de conservação que pode ser utilizado em morangos, uma vez que exerce pouca influência, no período de tempo estudado, nas suas características físico-químicas e sensoriais.

Determinação de resveratrol e características químicas em sucos de uvas produzidas em sistemas orgânico e convencional

O presente estudo avaliou os teores de trans-resveratrol e algumas características químicas: acidez total titulável (ATT), sólidos solúveis totais (SST) e relação SST/ATT, em amostras de sucos de uvas da variedade Concorde e Rúbea, sobre o porta-enxerto Campinas IAC 766, produzidas em sistemas orgânico e convencional. O suco foi obtido pelo método de cocção de uvas sadias e maduras. Os resultados encontrados para os sucos de uvas das variedades Concorde e Rúbea, sobre o porta-enxerto Campinas IAC 766, orgânico e convencional, apresentaram concentração de trans-resveratrol de 25,9; 27,2; 32,5 e 32,9 mg L-1, respectivamente. No suco das variedades Concorde e Rúbea de produção orgânica foram obtidos os valores de 0,77 e 0,91 g de ácido tartárico 100 mL-1. Para as mesmas variedades produzidas em sistema convencional 0,94 e 0,75 g de ácido tartárico 100 mL-1. Os valores observados para SST e SST/ ATT para as variedades de sistemas orgânico e convencional foram 10,95; 11,73; 14,23; e 13,23 ºBrix e 14,22; 12,64; 15,18; e 17,64, respectivamente. Das avaliações realizadas com relação ao trans-resveratrol pode-se concluir que as variedades, independentemente do sistema de cultivo, são fontes de resveratrol e que os sucos podem ser consumidos como alimento funcional.

Caracterização físico-química de frutos cítricos apirênicos produzidos em Viçosa, Minas Gerais

A ausência de sementes em frutos cítricos é uma característica altamente desejável e há demanda crescente por esses frutos, por consumidores mais exigentes. Neste trabalho, objetivou-se, avaliar algumas características físicoquímicas dos frutos de oito variedades apirênicas, recém-introduzidas na Zona da Mata Mineira. Avaliaram-se cinco frutos de cada uma das três plantas que compõem cada acesso no matrizeiro. Os frutos foram colhidos e levados ao laboratório, onde foram determinados a coloração da casca e polpa, altura e diâmetro do fruto, espessura da casca, presença de granulação, contagem do número de gomos, rendimento de suco, ATT, SST e ratio (SST/ATT). As variedades 'Okitsu' e 'Ortanique' apresentaram melhor coloração de casca e polpa. A granulação foi observada em 'Okitsu', 'Clemenules', 'Nova' e 'Marisol'. 'Salustiana', 'Navelina' e 'Ortanique' apresentaram os melhores rendimentos de suco e ausência total de granulação. Os maiores teores de SST e ATT foram observados em 'Salustiana' e 'Clemenules'. O ratio, no intervalo considerado adequado, foi observado nas variedades 'Navelina' e 'Navelate', caracterizando a melhor adaptação. 'Ortanique' teve bom desempenho em todas as características avaliadas, exceto no ratio, por sua baixa acidez. As variedades 'Navelina', 'Navelate' e 'Ortanique', no conjunto geral das características, foram as que apresentaram frutos de melhor qualidade.

Características físico-quimicas, análise sensorial e conservação de frutos de cultivares de bananeira resistentes à sigatoca-negra

O cultivar Prata Anã é o mais plantada no Norte de Minas Gerais, o que demonstra estar a bananicultura regional baseada numa variedade suscetível à sigatoca-negra. Apesar de existirem cultivares resistentes em fase de recomendação para o cultivo na região, ainda são escassos os trabalhos relacionados a metodologias de conservação pós-colheita. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar o período de armazenamento e as características físico-químicas e sensoriais dos cultivares de bananeira Fhia - 02 e Precioso, ambos resistentes à sigatoca-negra, e o efeito da atmosfera modificada associada à refrigeração. Foram realizados três experimentos, o primeiro em temperatura ambiente, o segundo a 12 ºC e o terceiro a 15 ºC. Esses experimentos foram instalados no delineamento em blocos casualizados em esquema de parcelas subdivididas no tempo, tendo nas parcelas um fatorial 2 (com e sem embalagem) x 2 (Fhia - 02 e Precioso) e nas subparcelas as avaliações em intervalo de seis e dois dias para frutos armazenados nas temperaturas de 12, 15 e 25 ºC, com quatro repetições e três frutos por unidade experimental. Após o tratamento, os frutos foram dispostos em bandejas de poliestireno expandido (sem embalagem) e embalagens de 10 e 16 µm e umidade relativa de 90%. As características avaliadas foram: tamanho, diâmetro, cor, firmeza, perda de matéria fresca, sólidos solúveis totais (SST), acidez total titulável (ATT), SST/ATT, pH e análise sensorial. O uso da embalagem associada à refrigeração permitiu armazenar os frutos por 28 dias, mantendo as características físico-químicas.

Avaliação de genótipos de morangueiro quanto à qualidade e potencial de armazenamento

O objetivo deste trabalho foi avaliar a qualidade de cultivares e clones de morangos e o seu potencial de armazenamento sob refrigeração. O delineamento experimental utilizado foi de blocos ao acaso, com quatro repetições de aproximadamente 150g. Os tratamentos consistiram na avaliação de três cultivares e quatro clones, sendo eles: LBH 15.1.Arazá, SGH 140.3. Guenoa, LBF 236.3 Yvapitá, LBG 121.4, LBK 16.1, LBK 35.1 e LBK 28.1. As avaliações foram realizadas na colheita e dez dias após o armazenamento a -0,5ºC, mais dois dias em temperatura de 20ºC. As características avaliadas foram: firmeza de polpa, acidez total titulável, sólidos solúveis totais, relação SST/ATT , ácido ascórbico, podridões e perda de peso. Quanto à qualidade, o cv. Guenoa destaca-se pelo baixo teor de acidez e altos teores de SST e ácido ascórbico, pela alta relação SST/ATT e, também, apresenta melhor conservação, com baixa ocorrência de podridões durante o armazenamento. O cultivar LBF 236.3 Yvapitá e o clone LBK 28.1 apresentam os menores teores de vitamina C e ratio, o que compromete sua qualidade, bem como menor firmeza de polpa e maior susceptibilidade a podridões, apresentando menor potencial de conservação. Os cultivares e clones que apresentaram melhor qualidade na colheita também apresentaram melhor conservação pós-colheita.

Produção de híbridos de tomateiro cultivados sob diferentes porcentagens de sombreamento

A região norte de Minas Gerais é marcada por um verão de alta intensidade luminosa, o que consequentemente inviabiliza o cultivo de algumas hortaliças nessa época. Objetivando avaliar o rendimento agronômico e a qualidade do cultivo do tomateiro sob diferentes níveis de sombreamento, conduziu-se, de novembro 2009 a fevereiro de 2010, um experimento na empresa Qualihort Sementes Ltda, localizada na cidade de Nova Porterinha, Minas Gerais. O delineamento experimental utilizado foi em blocos casualizados em esquema fatorial 2 x 4, com 4 repetições, sendo dois híbridos (Dominador e Giovanna) e quatro porcentagens de sombreamento (0%, 18%, 30% e 50%). O híbrido Dominador foi superior ao Giovanna em relação a altura da planta, número total de frutos, número de frutos por planta. O sombreamento promoveu aumento linear na altura das plantas. A produtividade total, comercial e altura das plantas foram maiores quando se utilizou 50% de sombreamento. As diferentes porcentagens de sombreamento não alteraram significativamente as características avaliadas, pH, Sólidos Solúveis Totais (SST), Acidez Total Titulável (ATT) e Relação Sólidos Solúveis/Acidez Titulável (RSA). Observou-se maior valor médio de pH nos frutos do híbrido Dominador, e maior valor médio de SST no 'Giovanna'. O híbrido Dominador e os ambientes sombreados condicionaram melhores desempenhos agronômicos para o tomateiro no Norte de Minas Gerais, com destaque para a tela de 50% de sombreamento. Porém, o sombreamento das plantas não influenciou a qualidade dos frutos do tomateiro.

Conservação pós-colheita de fisális e desempenho produtivo em condições edafoclimáticas de Minas Gerais

O Physalis sp., popularmente conhecido como fisális, é um gênero com mais de 100 espécies, pertencente à família Solanaceae, caracterizado pelo cálice concrescido, que envolve e protege o fruto contra herbívoros e intempéries. Os frutos, de sabor agridoce, são muito utilizados na culinária, podendo também ser processados em geleias, doces e licores, consumidos in natura, por seu alto teor de vitamina C e antioxidantes, além de apresentarem inúmeras propriedades medicinais. Este trabalho objetivou analisar a produtividade de fisális na região sul do Estado de Minas Gerais e observar aspectos de sua conservação pós-colheita. Os experimentos relacionados com a produtividade foram instalados na Fazenda Experimental da EPAMIG, em Maria da Fé, MG, e os demais experimentos, relacionados com a conservação pós-colheita, instalados no Laboratório de Tecnologia de Alimentos da UNIOESTE. Para avaliação da produtividade, instalou-se experimento contendo três blocos, com quatro plantas, e, para avaliação pós-colheita, foram utilizadas três repetições de cinco frutos, armazenados em câmara controlada tipo B.O.D, sem atmosfera modificada, por 28 dias, à temperatura de 5ºC, e avaliados no momento da instalação, aos 7, 14, 21 e 28 dias. Foram avaliados diâmetros longitudinal e transversal (mm), peso médio do fruto (g), com e sem cálice, peso total da colheita (g) e teor de sólidos solúveis totais. Em laboratório, avaliaram-se perda de peso, acidez (ATT), pH, sólidos solúveis totais (SST) e teor de vitamina C. Os frutos cultivados em Minas Gerais apresentaram características semelhantes às de frutos produzidos em regiões tradicionais de cultivo e podem facilmente ser armazenados por um período de 28 dias.

Dispachability improvement of wind generation by the virtual power producers

Nowadays, there is a growing environmental concern about were the energy that we use comes from, bringing the att ention on renewable energies. However, the use and trade of renewable e nergies in the market seem to be complicated because of the lack of guara ntees of generation, mainly in the wind farms. The lack of guarantees is usually addressed by using a reserve generation. The aggregation of DG p lants gives place to a new concept: the Virtual Power Producer (VPP). VPPs can reinforce the importance of wind generation technologies, making them valuable in electricity markets. This paper presents some resul ts obtained with a simulation tool (ViProd) developed to support VPPs in the analysis of their operation and management methods and of their strat egies effects.

Optimization of the Sybr Green real time PCR for the detection of Human Herpes Virus type 6 (HHV-6)

HHV-6 is the etiological agent of Exanthem subitum which is considered the sixth most frequent disease in infancy. In immuno-compromised hosts, reactivation of latent HHV-6 infection may cause severe acute disease. We developed a Sybr Green Real Time PCR for HHV-6 and compared the results with nested conventional PCR. A 214 pb PCR derived fragment was cloned using pGEM-T easy from Promega system. Subsequently, serial dilutions were made in a pool of negative leucocytes from 10-6 ng/µL (equivalent to 2465.8 molecules/µL) to 10-9 (equivalent to 2.46 molecules/µL). Dilutions of the plasmid were amplified by Sybr Green Real Time PCR, using primers HHV3 (5' TTG TGC GGG TCC GTT CCC ATC ATA 3)'and HHV4 (5' TCG GGA TAG AAA AAC CTA ATC CCT 3') and by conventional nested PCR using primers HHV1 (outer): 5'CAA TGC TTT TCT AGC CGC CTC TTC 3'; HHV2 (outer): 5' ACA TCT ATA ATT TTA GAC GAT CCC 3'; HHV3 (inner) and HHV4 (inner) 3'. The detection threshold was determined by plasmid serial dilutions. Threshold for Sybr Green real time PCR was 24.6 molecules/µL and for the nested PCR was 2.46 molecules/µL. We chose the Real Time PCR for diagnosing and quantifying HHV-6 DNA from samples using the new Sybr Green chemistry due to its sensitivity and lower risk of contamination.

Amadurecimento de frutos de cubiu (Solanum sessiliflorum Dunal) tratados com Etefon

O presente trabalho teve como objetivo avaliar a qualidade pós-colheita de frutos de cubiu (Solanum sessiliflorum) durante o amadurecimento após o tratamento com Etefon. Frutos das variedades Santa Luzia e Thais no estádio verde-maduro foram coletados, lavados e pulverizados até o completo molhamento com 1000 mg L-1 de Etefon e o controle com água. A cada três dias, durante 12 dias foram realizadas análises da firmeza do pericarpo, pH, teor de sólidos solúveis totais, acidez total titulável (ATT), umidade e cinzas. Foi avaliada a liberação de C0(2) e etileno diariamente durante 12 dias, conjuntamente com a perda de matéria fresca e evolução da cor, a cada três dias, sempre no mesmo grupo de frutos. Foi empregado o delineamento experimental inteiramente casualizado. Os dados foram submetidos à análise de variância e análise de regressão. Ocorreu perda de firmeza do pericarpo dos frutos com o tempo de armazenamento pós-colheita, com diminuição do pH, aumento da ATT e perda da matéria fresca. A aplicação de Etefon promoveu poucas mudanças na qualidade interna dos frutos, porém foi eficiente no desverdecimento da casca, o que pode ser verificado pelos menores valores do ângulo de cor e maiores da cromaticidade e luminosidade. O comportamento da respiração e produção de etileno aponta para um modelo de amadurecimento não climatérico.

Maturation protéolytique et sécrétion de la rénine: importance fonctionnelle de la pro-région

RÉSUMÉ Le système rénine-angiotensine joue un rôle prépondérant dans la régulation de la pression sanguine et de la balance des sels ainsi que dans d'autres processus physiologiques et pathologiques. Lorsque la pression sanguine est trop basse, les cellules juxtaglomérulaires sécrètent la rénine, qui clivera l'angiotensinogène circulant (sécrété majoritairement par le foie) pour libérer l'angiotensine I, qui sera alors transformée en angiotensine II par l'enzyme de conversion de l'angiotensine. Ce système est régulé au niveau de la sécrétion de la rénine par le rein. La rénine est une enzyme de type protéase aspartique. Elle est produite sous la forme d'un précurseur inactif de haut poids moléculaire appelé prorénine, qui peut être transformé en rénine active. Si le rôle de la prorégion de la rénine n'est pas encore connu, plusieurs études ont montré qu'elle pourrait être un auto-inhibiteur. Des travaux menés sur d'autres enzymes protéolytique ont mis en évidence un rôle de chaperon de leurs prorégions. Dans la circulation, la prorénine est majoritaire (90%) et la rénine active ne représente que 10% de la rénine circulante. L'enzyme qui transforme, in vivo, la prorénine en rénine active n'est pas connue. De même, l'endroit précis du clivage n'est pas élucidé. Dans ce travail, nous avons généré plusieurs mutants de la prorénine et les avons exprimés dans deux types cellulaires : les CV1 (modèle constitutif) et AtT-20 (modèle régulé). Nous avons montré que la prorégion joue un rôle important aussi bien dans l'acquisition de l'activité enzymatique que dans la sécrétion de la rénine, mais fonctionne différemment d'un type cellulaire à l'autre. Nous avons montré pour la première fois que la prorégion interagit de façon intermoléculaire à l'intérieur de la cellule. Les expériences de complémentation montre que l'interaction favorable de la rénine avec la prorégion dépend de la taille de cette dernière : prorénine (383 acides aminés) > pro62 (62 acides aminés) > pro43 (43 acides aminés). Par ailleurs nos résultats montrent qu'une faible partie de la rénine est dirigée vers la voie de sécrétion régulée classique tandis que la majorité est dirigée vers les lysosomes. Ceci suggère qu'une internalisation de la rénine circulante via le récepteur mannose-6-phosphate est possible. Cette dernière concernerait essentiellement la prorénine (dont les taux circulants sont 10 fois plus élevés que la rénine active). La suite de ce travail porterait sur la confirmation de cette hypothèse et l'identification de son possible rôle physiologique. SUMMARY The renin-angiotensin system is critical for the control of blood pressure and salt balance and other physiological and pathological processes. When blood pressure is too low, renin is secreted by the juxtaglomerular cells. It will cleave the N-terminus of circulating angiotensinogen (mostly secreted by the liver) to angiotensin-1, which is then transformed in angiotensin-II by the angiotensin-converting-enzyme (ACE). This system is regulated at the level of renin release. Renin, an aspartyl protease, is produced from a larger precursor (called prorenin) which is matured into active renin. Although the role of the renin proregion remains unknown, it has been reported that it could act as an autoinhibitor. Works on other proteolytic enzymes showed that their prorégion can act as chaperones. prorenin is the major circulating form of renin, while active renin represents only 10%. The enzyme which transforms, in vivo, the prorenin into active renin is unknown and the exact cleavage site remains to be elucidated. In this study, we generated some prorenin mutants, which were expressed in CV1 cells (constitutive pathway model) or AtT-20 cells (regulated pathway model). We showed that the proregion plays a pivotal role in the enzymatic activity and secretion of renin in a different manner in the two cell types. For the first time, it has been demonstrated that the proregion acts in an intermolecular way into the cell. Complementation assays showed that interaction between renin and proregion depends on the size of the proregion: prorenin (383 amino acids) > pro62 (62 amino acids) > pro43 (43 amino acids). Furthermore, our results showed that only a small amount of the cellular renin pool is targeted to the "canonical" regulated pathway and that the remaining is targeted to the lysosomes. Those results suggest a possible internalizátion of the circulating renin through the mannose-6-phosphate receptor pathway. This would mostly concern the prorenin (whose levels are ten times higher than active renin). Further studies would confirm or infirm this hypothesis and elucidate a potential physiological role.

Rapid Site-Directed Mutagenesis Using Two-PCR-Generated DNA Fragments Reproducing the Plasmid Template.

We describe a new rapid and efficient polymerase chain reaction (PCR)-based site-directed mutagenesis method. This procedure is effective with any plasmid and it employs four oligonucleotide primers. One primer contains the desired mutation, the second is oriented in the opposite direction (one of these two primers should be phosphorylated), and the third and fourth should be coding in complementary fashion for a unique restriction site to be introduced in a nonessential region. The method consists of two simultaneous PCR reactions; the PCR products are digested with the enzyme that recognizes the newly introduced unique restriction site and then ligased and used to transform competent bacteria. Additionally, the use of Dpn I facilitates the elimination of template DNA. The newly introduced restriction site is essential for ligation in the correct orientation of the two-PCR products and is further used for mutant screening. Resulting plasmids carry both the new restriction site and the desired mutation. Using this method, more than 20 mutants have already been generated (using two different kinds of templates); all these mutants were sequenced for the desired mutation and transfected into AtT-20 cells and the expressed mutant proteins encoded by the vector were assayed.