A Farewell to Flat Biology. Three-dimensional Cell Culture Models in Cancer Drug Target Identification and Validation

Cells of epithelial origin, e.g. from breast and prostate cancers, effectively differentiate into complex multicellular structures when cultured in three-dimensions (3D) instead of conventional two-dimensional (2D) adherent surfaces. The spectrum of different organotypic morphologies is highly dependent on the culture environment that can be either non-adherent or scaffold-based. When embedded in physiological extracellular matrices (ECMs), such as laminin-rich basement membrane extracts, normal epithelial cells differentiate into acinar spheroids reminiscent of glandular ductal structures. Transformed cancer cells, in contrast, typically fail to undergo acinar morphogenic patterns, forming poorly differentiated or invasive multicellular structures. The 3D cancer spheroids are widely accepted to better recapitulate various tumorigenic processes and drug responses. So far, however, 3D models have been employed predominantly in the Academia, whereas the pharmaceutical industry has yet to adopt a more widely and routine use. This is mainly due to poor characterisation of cell models, lack of standardised workflows and high throughput cell culture platforms, and the availability of proper readout and quantification tools. In this thesis, a complete workflow has been established entailing well-characterised 3D cell culture models for prostate cancer, a standardised 3D cell culture routine based on high-throughput-ready platform, automated image acquisition with concomitant morphometric image analysis, and data visualisation, in order to enable large-scale high-content screens. Our integrated suite of software and statistical analysis tools were optimised and validated using a comprehensive panel of prostate cancer cell lines and 3D models. The tools quantify multiple key cancer-relevant morphological features, ranging from cancer cell invasion through multicellular differentiation to growth, and detect dynamic changes both in morphology and function, such as cell death and apoptosis, in response to experimental perturbations including RNA interference and small molecule inhibitors. Our panel of cell lines included many non-transformed and most currently available classic prostate cancer cell lines, which were characterised for their morphogenetic properties in 3D laminin-rich ECM. The phenotypes and gene expression profiles were evaluated concerning their relevance for pre-clinical drug discovery, disease modelling and basic research. In addition, a spontaneous model for invasive transformation was discovered, displaying a highdegree of epithelial plasticity. This plasticity is mediated by an abundant bioactive serum lipid, lysophosphatidic acid (LPA), and its receptor LPAR1. The invasive transformation was caused by abrupt cytoskeletal rearrangement through impaired G protein alpha 12/13 and RhoA/ROCK, and mediated by upregulated adenylyl cyclase/cyclic AMP (cAMP)/protein kinase A, and Rac/ PAK pathways. The spontaneous invasion model tangibly exemplifies the biological relevance of organotypic cell culture models. Overall, this thesis work underlines the power of novel morphometric screening tools in drug discovery.

Tricobezoar gástrico: relato de caso

Bezoars are foreign bodies impacted in the digestive tract resulting of their ingestion and accumulation, involving mainly the stomach. The most common types are phytobezoars, contaning vegetables, fiber and seed and the trichobezoar, made of hair. The present case is the description of a 25-year-old female with nonspecific dyspeptic symptoms associated to intestinal habit change. The diagnosis was suggested by Computerized Tomography in association with clinical history - initially omitted by the pacient - of trichophagia for 10 years. Treatment consisted of Anterior Gastrotomy and remotion of the bezoar.

Lipoma gástrico: relato de caso

We report a case of gastric lipoma, a rare benign stomach tumor. There are approximately 200 cases previously described in literature. A male, 62-year-old patient with no clinical complaint presented a tumor lesion in the stomach antrum found in a routine upper endoscopy. A surgical resection (subtotal gastrectomy) was done and the histological examination showed submucosal lipoma without signs of malignancy. This report points to the growth of routine examination in the current clinical practice and the dilemma brought by overdiagnosis.

Lymph node metastasis in early gastric cancer

OBJECTIVE: to evaluate the incidence of lymph node metastasis in early gastric cancer, identifying risk factors for its development. METHODS: we conducted a prospective study of patients with gastric cancer admitted to the Section of the Esophago-Gastric Surgery of the Surgery of Service HUCFF-UFRJ, from January 2006 to May 2012. RESULTS: the rate of early gastric cancer was 16.3%. The incidence of nodal metastases was 30.8% and occurred more frequently in patients with tumors with involvement of the submucosa (42.9%), in those poorly differentiated (36.4%), in tumors larger than 2 cm (33.3%) and in type III ulcerated lesions (43.8%). CONCLUSION: the incidence of lymph node metastases in patients was very high and suggests that one should keep the radicality of resection in early gastric cancer, particularly in relation to D2 lymphadenectomy, recommended for advanced gastric cancer. Conservative resections, with lymphadenectomies smaller than D2, should be performed only in selected cases, well-studied as for the risk factors of lymph node metastasis. Despite the small number of cases did not permit to relate the rate of lymph node metastasis to the risk factors considered, we noted a strong tendency for the occurrence of these metastases in the poorly differentiated, type III, larger than 2 cm tumors, and in the Lauren diffuse types.

Natural history of extensive diaphragmatic injury on the right side: experimental study in rats

OBJECTIVE: To evaluate the natural healing of the rat diaphragm that suffered an extensive right penetrating injury.METHODS: Animals were submitted to an extensive penetrating injury in right diaphragm. The sample consisted of 40 animals. The variables studied were initial weight, weight 21 days after surgery; healing of the diaphragm, non-healing of the diaphragm, and herniated abdominal contents into the chest.RESULTS: Ten animals were used as controls for weight and 30 animals were operated. Two animals died during the experiment, so 28 animals formed the operated group; healing of the diaphragm occurred in 15 animals (54%), 11 other animals showed diaphragmatic hernia (39%) and in two we observed only diaphragmatic injury without hernia (7%). Among the herniated organs, the liver was found in 100% of animals, followed by the omentum in 77%, small bowel in 62%, colon in 46%, stomach in 31% and spleen in 15%. The control group and the diaphragmatic healing subgroup showed increased weight since the beginning of the study and the 21 days after surgery (p <0.001). The unhealed group showed no change in weight (p = 0.228).CONCLUSION: there is a predominance of spontaneous healing in the right diaphragm; animals in which there was no healing of the diaphragm did not gain weight, and the liver was the organ present in 100% the diaphragmatic surface in all rats with healed diaphragm or not.

Scintigraphic study of the splenic circulation in rats

Objective: To evaluate the splenic parenchymal blood distribution through scintigraphic study.Methods: Thirty Wistar rats were randomly divided into six groups (n = 5). Group 1 (spleen - 30 minutes) and Group 2 (spleen - 90 minutes) underwent laparotomy with direction of blood flow to the spleen by ligature of the aorta near the iliac bifurcation and splanchnic vessels, keeping blood flow only in the splenic artery; Group 3 (spleen and stomach - 30 minutes) and Group 4 (spleen and stomach - 90 minutes) underwent laparotomy with direction of blood flow to the spleen and stomach by ligature of the aorta near the iliac bifurcation and splanchnic vessels, maintaining the flow through the splenic, gastric and splenogastric vessels; Group 5 (control - 30 minutes) and Group 6 (control - 90 minutes) underwent laparotomy and ligation of the aorta near the iliac bifurcation, keeping the flow to the abdominal organs. After arterial ligation, the animals received an injection of 0.2 ml of sodium pertechnetate in the aorta. Scintigraphic images were taken and the animals had their spleens removed for radioactivity counting with an automatic counter device.Results: There was no difference in the amounts of radiation from the spleen between groups, indicating retention of the radioisotope by the spleen, even after the period of 90 minutes.Conclusion: The blood flow through the spleen is not continuous. The blood diffuses through the splenic parenchyma and its venous drainage is slow, not following a predictable sequence.

Esophagectomy with gastroplasty in advanced megaesophagus: late results of omeprazole use

Objective: To analyze the late results of advanced Chagasic megaesophagus treatment by esophagectomy associated with the use of proton pump inhibitor (omeprazole) as for the incidence of esophagitis and Barrett's esophagus in the remaining stump. Methods : We studied patients with advanced megaesophagus undergoing esophagectomy and transmediastinal esophagogastroplasty. Patients were divided into three groups: A (20) with esophageal replacement by full stomach, without the use of omeprazole; B (20) with esophageal replacement by full stomach, with omeprazole 40 mg/day introduced after the first postoperative endoscopy and maintained for six years; and C (30) with esophageal replacement by gastric tube with use of omeprazole. Dysphagia, weight loss and BMI were clinical parameters we analyzed. Upper gastrointestinal endoscopy was performed in all patients, and determined the height of the anastomosis, the aspect of the mucosa, with special attention to possible injuries arising from gastroesophageal reflux, and the patency of the esophagogastric anastomosis. Results : We studied 50 patients, 28 males (56%) and 22 (44%) females. All underwent endoscopy every year. In the first endoscopy, erosive esophagitis was present in nine patients (18%) and Barrett's esophagus, in four (8%); in the last endoscopy, erosive esophagitis was present in five patients (8%) and Barrett's esophagus in one (2%). When comparing groups B and C, there was no evidence that the manufacturing of a gastric tube reduced esophagitis and Barrett's esophagus. However, when comparing groups A and C, omeprazole use was correlated with reduction of reflux complications such as esophagitis and Barrett's esophagus (p <0.005). Conclusion : The use of omeprazole (40 mg/day) reduced the onset of erosive esophagitis and Barrett's esophagus during the late postoperative period.

Endometriose: modelo experimental em ratas

Objetivo: divulgar a metodologia da indução de endometriose experimental em animais de laboratório. Método: utilizamos ratas albinas, virgens, adultas de aproximadamente três meses de idade, que foram inicialmente anestesiadas pelo éter etílico. Aberta a cavidade abdominal, identificamos os cornos uterinos e retiramos um fragmento de aproximadamente 4 cm do corno uterino direito. Esse fragmento foi mergulhado em solução fisiológica e sob lupa estereoscópica foi separado o endométrio do miométrio e feitos retângulos de aproximadamente 4 por 5 mm. Esses foram fixados por meio de fio de sutura, sobre vasos sangüíneos visíveis a olho nu, na parede lateral do abdômen, tomando-se sempre o cuidado de manter a porção do endométrio livre voltada para a luz da cavidade abdominal. Após 21 dias os animais foram novamente operados para verificarmos o tamanho dos implantes e para retirada do endométrio ectópico para análise histológica. Resultados: macroscopicamente observamos crescimento significativo dos implantes endometriais. Ao exame microscópico pudemos observar a presença de epitélio glandular e estroma semelhantes ao do endométrio tópico. Conclusões: o modelo utilizado reproduz a doença, em ratas, sendo método auxiliar de valia para estudar esta afecção, principalmente a ação de medicamentos sobre esses implantes.

Mastite Puerperal: Estudo de Fatores Predisponentes

Objetivos: conhecer as características clínicas e bacteriológicas da mastite, classificação e tratamento. Métodos: as pacientes foram inquiridas sobre dados pessoais, pré-natal, atendimento no parto, no puerpério e quadro clínico. A mastite foi classificada pelos critérios de Vinha. Nos casos que evoluíram para abscesso, foi realizada análise bacteriológica, utilizando-se o meio de cultura caldo de enriquecimento Tryptone Soya Broth. Resultados: das 70 lactantes, 57% eram primíparas, 57% com idade entre 20 e 29 anos e 51% com 1º grau incompleto. A renda era menor que um salário mínimo em 63% dos casos. Exerciam atividade domiciliar sem apoio em 66% dos casos. Em 50%, as mamas não foram examinadas. No pré-natal não tiveram orientação sobre aleitamento e ordenha em respectivamente 50% e 58% dos casos. Em 63% o parto não foi em hospitais Amigos da Criança. Ocorreu ingurgitamento em 46% e fissura mamilar em 47% dos casos. Na classificação citada: 44% eram do tipo lobar, 39% ampolar e 17% glandular. No material de cultura houve crescimento de Staphylococcus aureus em 55%. Conclusões: fatores como baixa escolaridade, baixa renda, atividade familiar sem apoio, primiparidade e falta de orientação são fatores de risco para o aparecimento da mastite.

Atipia de células glandulares em esfregaços do colo do útero: avaliação dos métodos propedêuticos

OBJETIVO: avaliar a propedêutica em mulheres com atipias de células glandulares no resultado colpocitológico. PACIENTES E MÉTODOS: foram avaliadas prospectivamente 159 mulheres atendidas por resultado citológico de atipias de células glandulares, entre janeiro e dezembro de 2000. Todas foram submetidas a coleta de nova colpocitologia e a colposcopia. Foi realizada biópsia dirigida em 50 casos, curetagem endocervical em 21 e conização em 75. O desempenho dos métodos propedêuticos foi descrito por estimativas de sensibilidade, especificidade, valores preditivos e razão de verossimilhanças, tendo como padrão-ouro o resultado histológico. RESULTADOS: entre as 51 mulheres que apresentaram neoplasia intra-epitelial escamosa, 29 foram de baixo grau e 22 de alto grau. Cinco mulheres apresentaram adenocarcinoma in situ e seis, neoplasias invasoras. Isoladamente, a sensibilidade e a especificidade da colpocitologia foram respectivamente 88,5 e 39%, e da colposcopia, 74 e 42%. A associação da colposcopia com a colpocitologia elevou a sensibilidade para 98,4%, com queda da especificidade para 10%. A curetagem endocervical apresentou sensibilidade muito baixa (25%). CONCLUSÃO: a presença de atipias glandulares na colpocitologia relacionou-se com lesões cervicais pré-neoplásicas e neoplásicas em 62,2% dos casos submetidos a avaliação histológica. A repetição da citologia e a colposcopia permitiram selecionar as mulheres que se beneficiaram com a avaliação histológica. A conização mostrou-se adequada quando os exames mantiveram alterações morfológicas.

Densidade mamográfica em mulheres climatéricas em uso de terapia de reposição hormonal

OBJETIVOS: avaliar a densidade mamográfica antes e após um ano de terapia de reposição hormonal. METODOLOGIA: participaram 70 mulheres climatéricas, admitidas em Ambulatório do Climatério. As pacientes usaram, regularmente, a TRH estrogênica ou estroprogestativa por um ano, possuíam uma mamografia basal e, outra após um ano de TRH. Os esquemas de TRH possuíam a mesma bioequivalência hormonal. Foram avaliados: a densidade mamográfica antes e após um ano de TRH, faixa etária, estado da função ovariana, índice de massa corporal, relação cintura/quadril, e o tabagismo. A densidade mamográfica foi avaliada segundo BI-RADS do Colégio Americano de Radiologia (1998), e classificada em: A) mamas inteiramente lipossubstituídas, B) mamas lipossubstituídas com parênquima glandular disperso, C) mamas heterogeneamente densas e D) mamas extremamente densas. Foi proposta subdivisão das categorias em A e A1, B e B1, C e C1, D e D1, às quais atribuiram-se escores iniciais (antes da TRH) e finais (após um ano de TRH), que variaram de 1 a 8, respectivamente. Foram computadas as proporções de mulheres que mostraram aumento, diminuição ou não modificaram a densidade mamográfica, após 1 ano de TRH. Além disso, calcularam-se variações nos escores iniciais e após um ano de TRH, utilizando-se o teste t pareado do SPSS. RESULTADOS: a densidade mamográfica aumentou em 22,9%, diminuiu em 7,1; e em 70% permaneu inalterada. Constatamos diferença nas médias dos escores basal (2,2 ± 1,82) e após um ano da TRH (2,5 ± 1,9) (p = 0.019). A relação cintura/quadril foi significativamente maior (0,87) nas mulheres que mostraram aumento da densidade mamográfica, quando comparadas àquelas que mostraram diminuição ou não alteraram a densidade mamográfica (0,82), após um ano de TRH. CONCLUSÕES: a TRH, após um ano de uso, pode aumentar a densidade mamográfica, principalmente em mulheres com distribuição da gordura corporal tipo androgênica.

Fatores de risco de recidiva de lesões intra-epiteliais cervicais após conização por cirurgia de alta freqüência em mulheres portadoras e não portadoras do vírus da imunodeficiência humana

OBJETIVOS: avaliar os fatores de risco associados à recidiva das lesões intra-epiteliais, após conização do colo com cirurgia de alta freqüência. MÉTODOS: estudo caso-controle aninhado em coorte de 201 pacientes que se submeteram à conização com cirurgia de alta freqüência por apresentarem lesão intra-epitelial cervical, acompanhadas, em média, por dois anos. Participaram 94 portadoras do HIV e 107 não-portadoras do vírus. A conização cervical foi realizada por cirurgia de alta freqüência e a peça cirúrgica encaminhada para exame histopatológico, que avaliou o grau da lesão, as margens e a ocupação glandular. Após a cirurgia, as pacientes foram examinadas a cada seis meses com citologia oncótica e colposcopia. Foram consideradas recidivas as lesões que, após a cirurgia, foram confirmadas novamente por biópsia. Neste estudo, foram considerados casos as pacientes com recidiva e controles as sem recidiva. As comparações entre os grupos foram realizadas pelo teste do chi2 e a análise multivariada pela regressão logística. Para a análise de sobrevida foi utilizado o método de Kaplan-Meier (teste log-rank). RESULTADOS: houve recidiva das lesões em 40 pacientes. As variáveis que inicialmente apresentaram significância estatística foram: número de parceiros, soropositividade, margens do cone e envolvimento glandular, como indicadores do risco para recidiva. A ocorrência simultânea de ocupação glandular e margens comprometidas apresentou as recidivas mais freqüentes. Após análise pela regressão logística, permaneceram significativamente associados à recorrência das lesões: ocupação glandular (OR=9,1; IC a 95%:13,0-27,5); presença do HIV (OR=4,6; IC a 95%:1,1-6,3); margens comprometidas (OR-2,6; IC a 95%:1,9-11,2). CONCLUSÕES: os fatores de risco associados à recidiva das lesões intra-epiteliais cervicais foram: soropositividade, ocupação glandular e margens comprometidas.

Avaliação da classificação histológica da endometriose observada em implantes de mulheres portadoras de endometriose pélvica superficial e profunda

OBJETIVO: avaliar o padrão de diferenciação histológica em lesões de peritônio superficial e lesões de endometriose pélvica profunda (EPP), localizadas em ligamentos úteros-sacros, intestino (reto e sigmóide) e septo retovaginal. MÉTODOS: estudo prospectivo não randomizado, que incluiu 139 pacientes. Foram obtidas 234 biópsias (179 com EPP - Grupo Profundas - e 55 com endometriose superficial - Grupo Superficiais). Das 179 lesões de EPP (Grupo Profundas), 15 foram obtidas do septo retovaginal, 72 de nódulos do reto e sigmóide e 92 de ligamentos útero-sacrais. As biópsias foram classificadas em glandulares bem diferenciadas, glandulares indiferenciadas, glandulares mistas e estromal, com base em uma classificação morfológica específica. RESULTADOS: no Grupo Profundas, 33,5% das biópsias apresentaram padrão glandular indiferenciado e 46,9%, padrão glandular misto. No Grupo Superficiais, houve predominância do padrão glandular diferenciado (41,8%). Comparando especificamente as diferentes localizações das biópsias de lesão de EPP (Grupo Profundas), notou-se que o padrão glandular misto foi predominante nos nódulos intestinais (61,1%). CONCLUSÕES: foi possível concluir que há predomínio de endometriose glandular bem diferenciada na endometriose superficial, predomínio da doença mista e indiferenciada na EPP e, especificamente estudando a endometriose de reto e sigmóide, houve predomínio da endometriose glandular mista.

Efeitos do tamoxifeno sobre a expressão das proteínas TGF-β e p27 em pólipos e endométrio adjacente de mulheres após a menopausa

OBJETIVO:avaliar os efeitos do uso do tamoxifeno sobre a expressão das proteínas TGF-β e p27 em pólipos e endométrio adjacente de mulheres após a menopausa. MÉTODOS: estudo prospectivo, com 30 mulheres, após a menopausa com diagnóstico de câncer de mama, usuárias de tamoxifeno (20 mg/dia), que apresentavam diagnóstico de pólipo endometrial suspeito por meio de ultrassonografia transvaginal, submetidas à histeroscopia diagnóstica e cirúrgica para retirada dos pólipos e do endométrio adjacente. Realizado estudo imunoistoquímico para verificar a expressão das proteínas TGF-β e p27 nos pólipos e no endométrio adjacente. A quantificação dessas proteínas foi realizada por morfometria. RESULTADOS: a média de idade foi 61,7 anos; média da idade na menopausa, 49,5 anos; e o tempo médio de uso do tamoxifeno, de 25,3 meses. A concentração média de células positivas para proteína TGF-β no pólipo epitélio glandular e estroma foi 62,6±4,5 células/mm². Para a p27, no pólipo epitélio glandular, foi de 24,2±18,6 cel/mm² e estroma 19,2±15,2 cel/mm². Não houve diferença significante entre a expressão do TGF-β e p27 nos epitélios glandulares dos pólipos e do endométrio adjacente. A expressão das proteínas do pólipo e endométrio adjacente com os seus respectivos epitélios glandular e estromal apresentou diferença significativa para a proteína p27 (r=0,9, p<0,05). CONCLUSÕES: concluímos que a expressão do TGF-β não está relacionada ao efeito do tamoxifeno sobre o crescimento dos pólipos endometriais, mas a ausência de malignização dos pólipos induzida pelo tamoxifeno pode ser explicada pela alta expressão da proteína p27 no seu epitélio glandular.

Lesões cervicais intraepiteliais de alto grau: avaliação dos fatores determinantes de evolução desfavorável após conização

OBJETIVO: Avaliar os fatores determinantes de evolução desfavorável da neoplasia intraepitelial cervical (NIC), tratada por conização. MÉTODOS: Foi feito um estudo retrospectivo com acompanhamento de pacientes, com diagnóstico cito-histológico de NIC, tratadas por conização (técnica clássica e cirurgia de alta frequência), no período de janeiro de 1999 a janeiro de 2006. Os pacientes foram divididos em dois grupos: Estudo (evolução desfavorável: persistência, recorrência ou progressão da lesão) e Controle (cura clínica, amostra aleatória dentro do grupo conizado), num seguimento mínimo de 18 meses. Foram feitas análises estatísticas uni e bivariada das variáveis, usando-se teste das proporções (teste do c2 ou teste exato de Fischer) e considerando-se valor p£0,05. RESULTADOS: Quarenta e oito pacientes apresentaram recorrência ou progressão da doença (grupo estudo) e 65 apresentaram cura clínica (grupo controle). A idade e a paridade foram semelhantes nos dois grupos, conforme média e desvio padrão calculados. Não houve diferença entre os grupos quanto ao hábito de fumar e ao método anticoncepcional utilizado. O percentual de recorrência nessa amostra foi de 14,6%. Somente margens excisionais comprometidas por lesão foram preditoras de recorrência/progressão da doença (p<0,001). A técnica de conização, o cirurgião, o grau da NIC, a presença de extensão glandular e o volume de colo uterino retirados não foram determinantes de evolução desfavorável da doença, após o tratamento cirúrgico, nesta amostra. CONCLUSÃO: A recidiva/persistência ou progressão de NIC2 e 3, pós-tratamento cirúrgico por conização, foi relacionada apenas à margens excisionais comprometidas do produto de conização.