Importance of the HSP90 molecular chaperoning pathway for antibody diversification by determining AID stability

La protéine AID (déaminase induite par l’activation) joue un rôle central dans la réponse immunitaire adaptative. En désaminant des désoxycytidines en désoxyuridines au niveau des gènes immunoglobulines, elle initie l’hypermutation somatique (SHM), la conversion génique (iGC) et la commutation isotypique (CSR). Elle est essentielle à une réponse humorale efficace en contribuant à la maturation de l’affinité des anticorps et au changement de classe isotypique. Cependant, son activité mutagénique peut être oncogénique et causer une instabilité génomique propice au développement de cancers et de maladies autoimmunes. Il est donc critique de réguler AID, en particulier ses niveaux protéiques, pour générer une réponse immunitaire efficace tout en minimisant les risques de cancer et d’autoimmunité. Un élément de régulation est le fait qu’AID transite du cytoplasme vers le noyau mais reste majoritairement cytoplasmique à l’équilibre. AID est par ailleurs plus stable dans le cytoplasme que dans le noyau, ce qui contribue à réduire sa présence à proximité de l’ADN. Le but de cette thèse était d’identifier de nouveaux partenaires et déterminants d’AID régulant sa stabilité et ses fonctions biologiques. Dans un premier temps, nous avons identifié AID comme une nouvelle protéine cliente d’HSP90. Nous avons montré qu’HSP90 interagit avec AID dans le cytoplasme, ce qui empêche la poly-ubiquitination d’AID et sa dégradation par le protéasome. En conséquence, l’inhibition d’HSP90 résulte en une diminution significative des niveaux endogènes d’AID et corrèle avec une réduction proportionnelle de ses fonctions biologiques dans la diversification des anticorps mais aussi dans l’introduction de mutations aberrantes. Dans un second temps, nous avons montré que l’étape initiale dans la stabilisation d’AID par la voie de chaperonnage d’HSP90 dépend d’HSP40 et d’HSP70. En particulier, la protéine DnaJa1, qui fait partie de la famille des protéines HSP40s, limite la stabilisation d’AID dans le cytoplasme. La farnésylation de DnaJa1 est importante pour l’interaction entre DnaJa1 et AID et moduler les niveaux de DnaJa1 ou son état de farnésylation impacte à la fois les niveaux endogènes d’AID mais aussi la diversification des anticorps. Les souris DNAJA1-/- présentent une réponse immunitaire compromise en cas d’immunisation, qui est dûe à des niveaux réduits d’AID et un défaut de commutation de classe. Dans un troisième temps, nous avons montré que la protéine AID est intrinsèquement plus instable que sesprotéines paralogues APOBEC. Nous avons identifié l’acide aspartique en seconde position d’AID ainsi qu’un motif semblable au PEST comme des modulateurs de la stabilité d’AID. La modification de ces motifs augmente la stabilité d’AID et résulte en une diversification des anticorps plus efficace. En conclusion, l’instabilité intrinsèque d’AID est un élément de régulation de la diversification des anticorps. Cette instabilité est en partie compensée dans le cytoplasme par l’action protective de la voie de chaperonnage DnaJa1-HSP90. Par ailleurs, l’utilisation d’inhibiteurs d’HSP90 ou de farnésyltransférases pourrait être un outil intéressant pour la modulation indirecte des niveaux d’AID et le traitement de lymphomes/leucémies et de maladies auto-immunes causés par AID.

Comparison of 3M Petrifilm™ Staph Express, 3M Petrifilm™ Rapid Coliform and 3M Petrifilm™ Aerobic count plates with standard bacteriology of bovine milk

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Aerobic oxidations catalyzed by combinations of transition metal salts and N-hydroxyphthalimide

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Stability studies of intravenous cyclosporine preparations stored in non-PVC containers

Dans cette étude, la stabilité de préparations intraveineuses de cyclosporine (0.2 et 2.5 mg/mL dans NaCl 0.9% ou dextrose 5%) entreposées dans des seringues de polypropylène, des sacs de polypropylène-polyoléfine et des sacs de vinyle acétate d’éthylène a été évaluée. Une méthode HPLC indicatrice de la stabilité à base de méthanol a été développée et validée suite a des études de dégradation forcée. Les solutions évaluées ont été préparées de façon aseptique, puis entreposées à 25°C. La stabilité chimique a été évaluée par HPLC et la stabilité physique a été évaluée par inspection visuelle et aussi par diffusion dynamique de la lumière (DLS). Tous les échantillons sont demeurés stables chimiquement et physiquement dans des sacs de polypropylène-polyoléfine (>98% de cyclosporine récupérée après 14 jours). Lorsqu’entreposés dans des seringues de polypropylène, des contaminants ont été extraits des composantes de la seringue. Toutefois, aucune contamination n’a été observée après 10 min de contact entre la préparation de cyclosporine non-diluée et ces mêmes seringues. Les préparations de 2.5 mg/mL entreposées dans des sacs de vinyle acétate d’éthylène sont demeurés stables chimiquement et physiquement (>98% de cyclosporine récupérée après 14 jours). Toutefois, une adsorption significative a été observée avec les échantillons 0.2 mg/mL entreposés dans des sacs de vinyle acétate d’éthylène (<90% de cyclosporine récupéré après 14 jours). Une étude cinétique a démontré une bonne corrélation linéaire entre la quantité adsorbée et la racine carrée du temps de contact (r2 > 0.97). Un nouveou modèle de diffusion a été établi. En conclusion, les sacs de polypropylène-polyoléfine sont le meilleur choix; les seringues de polypropylène présentent un risque de contamination, mais sont acceptables pour un transfert rapide. Les sacs de vinyle acétate d’éthylène ne peuvent être recommandés à cause d’un problème d’adsorption.

A proteome-wide strategy reveals a novel mechanism of control of cell cycle progression through modulation of cyclin mRNA stability

La quantité de données générée dans le cadre d'étude à grande échelle du réseau d'interaction protéine-protéine dépasse notre capacité à les analyser et à comprendre leur sens; d'une part, par leur complexité et leur volume, et d'un autre part, par la qualité du jeu de donnée produit qui semble bondé de faux positifs et de faux négatifs. Cette dissertation décrit une nouvelle méthode de criblage des interactions physique entre protéines à haut débit chez Saccharomyces cerevisiae, la complémentation de fragments protéiques (PCA). Cette approche est accomplie dans des cellules intactes dans les conditions natives des protéines; sous leur promoteur endogène et dans le respect des contextes de modifications post-traductionnelles et de localisations subcellulaires. Une application biologique de cette méthode a permis de démontrer la capacité de ce système rapporteur à répondre aux questions d'adaptation cellulaire à des stress, comme la famine en nutriments et un traitement à une drogue. Dans le premier chapitre de cette dissertation, nous avons présenté un criblage des paires d'interactions entre les protéines résultant des quelques 6000 cadres de lecture de Saccharomyces cerevisiae. Nous avons identifié 2770 interactions entre 1124 protéines. Nous avons estimé la qualité de notre criblage en le comparant à d'autres banques d'interaction. Nous avons réalisé que la majorité de nos interactions sont nouvelles, alors que le chevauchement avec les données des autres méthodes est large. Nous avons pris cette opportunité pour caractériser les facteurs déterminants dans la détection d'une interaction par PCA. Nous avons remarqué que notre approche est sous une contrainte stérique provenant de la nécessité des fragments rapporteurs à pouvoir se rejoindre dans l'espace cellulaire afin de récupérer l'activité observable de la sonde d'interaction. L'intégration de nos résultats aux connaissances des dynamiques de régulations génétiques et des modifications protéiques nous dirigera vers une meilleure compréhension des processus cellulaires complexes orchestrés aux niveaux moléculaires et structuraux dans les cellules vivantes. Nous avons appliqué notre méthode aux réarrangements dynamiques opérant durant l'adaptation de la cellule à des stress, comme la famine en nutriments et le traitement à une drogue. Cette investigation fait le détail de notre second chapitre. Nous avons déterminé de cette manière que l'équilibre entre les formes phosphorylées et déphosphorylées de l'arginine méthyltransférase de Saccharomyces cerevisiae, Hmt1, régulait du même coup sont assemblage en hexamère et son activité enzymatique. L'activité d'Hmt1 a directement un impact dans la progression du cycle cellulaire durant un stress, stabilisant les transcrits de CLB2 et permettant la synthèse de Cln3p. Nous avons utilisé notre criblage afin de déterminer les régulateurs de la phosphorylation d'Hmt1 dans un contexte de traitement à la rapamycin, un inhibiteur de la kinase cible de la rapamycin (TOR). Nous avons identifié la sous-unité catalytique de la phosphatase PP2a, Pph22, activé par l'inhibition de la kinase TOR et la kinase Dbf2, activé durant l'entrée en mitose de la cellule, comme la phosphatase et la kinase responsable de la modification d'Hmt1 et de ses fonctions de régulations dans le cycle cellulaire. Cette approche peut être généralisée afin d'identifier et de lier mécanistiquement les gènes, incluant ceux n'ayant aucune fonction connue, à tout processus cellulaire, comme les mécanismes régulant l'ARNm.

Alliance Politics in Hybrid Regimes : Political Stability and Instability since World War II

Cette thèse étudie la stabilité et l’instabilité politique des régimes hybrides. Elle pose la question suivante : dans quelles conditions l’autorité des élites au pouvoir est-elle reconnue ou contestée? Notre réponse s’articule en lien avec le caractère inclusif ou exclusif de la coalition dirigeante : c’est-à-dire, l’alliance stratégique des élites dirigeantes avec les groupes sociaux dominants. L’inclusion de ces derniers favorise le consentement et la stabilité; leur exclusion entraîne l’affrontement et l’instabilité politique. Sa composition dépend (i) du degré de violence organisée extra-légale et (ii) du degré de pénétration de l’État sur le territoire et dans l’économie. La première variable permet d’identifier quel groupe social au sein de l’État (militaires) ou du régime (partis d’opposition) est dominant et influence les formes de communication politique avec les élites dirigeantes. La deuxième variable permet d’identifier quel groupe social au sein de l’État (fonctionnaires) ou de la société (chefs locaux) est dominant et oriente les rapports entre les régions et le pouvoir central. L’apport de la recherche est d’approfondir notre compréhension des institutions politiques dans les régimes hybrides en mettant l’accent sur l’identité des groupes sociaux dominants dans un contexte donné. La thèse propose un modèle simple, flexible et original permettant d’appréhender des relations causales autrement contre-intuitives. En ce sens, la stabilité politique est également possible dans un pays où l’État est faible et/ou aux prises avec des mouvements de rébellion; et l’instabilité dans un contexte inverse. Tout dépend de la composition de la coalition dirigeante. Afin d’illustrer les liens logiques formulés et d’exposer les nuances de notre théorie, nous employons une analyse historique comparative de la coalition dirigeante en Malaisie (1957-2010), en Indonésie (1945-1998), au Sénégal (1960-2010) et au Paraguay (1945-2008). La principale conclusion est que les deux variables sont incontournables. L’une sans l’autre offre nécessairement une explication incomplète des alliances politiques qui forgent les conditions de stabilité et d'instabilité dans les régimes hybrides.

A study of the polycomb group complexes in the maintenance of heterochromatic genome stability and Alzheimer's disease.

La démence d'Alzheimer est une maladie neurodégénérative caractérisée par une perte progressive et irreversible des fonctions cognitives et des compétences intellectuelles. La maladie d’Alzheimer se présente sous deux formes: la forme familiale ou précoce (EOAD) qui représente 5% des cas et elle est liée à des mutations génétiques affectant le métabolisme des peptides amyloïde; et la forme tardive ou sporadique (LOAD) qui représente 95% des cas mais son étiologie est encore mal définie. Cependant, le vieillissement reste le principal facteur de risque pour développer LOAD. Les changements épigénétiques impliquant des modifications des histones jouent un rôle crucial dans les maladies neurodégénératives et le vieillissement lié à l'âge. Des données récentes ont décrit LOAD comme un désordre de l'épigénome et ont associé ce trouble à l'instabilité génomique. Les protéines Polycomb sont des modificateurs épigénétiques qui induisent le remodelage de la chromatine et la répression des gènes à l'hétérochromatine facultative. Nous rapportons que les souris hétérozygotes pour une protéine Polycomb développent avec l'âge un trouble neurologique ressemblant à LOAD caractérisé par l’altération des fonctions cognitives, la phosphorylation de la protéine tau, l'accumulation des peptides amyloïde, et le dysfonctionnement synaptique. Ce phénotype pathologique est précédé par la décondensation de l’hétérochromatine neuronale et l'activation de la réponse aux dommages à l'ADN. Parallèlement, une réduction d’expression de polycomb, malformations de l'hétérochromatine neuronale, et l'accumulation de dommages à l'ADN étaient également présents dans les cerveaux de patients LOAD. Remarquablement, les dommages de l'ADN ne sont pas distribués de façon aléatoire sur le génome mais sont enrichis au niveau des séquences répétitives. Les conclusions présentées dans cette thèse ont identifié des modifications épigénétiques spécifiques qui conduisent à une instabilité génomique aberrante menant à la formation de LOAD. Ces résultats vont aider au développement de nouveaux traitements qui peuvent potentiellement ralentir la neurodégénérescence.

Interpretation of the centromere epigenetic mark to maintain genome stability

Le centromère est la région chromosomique où le kinétochore s'assemble en mitose. Contrairement à certaines caractéristiques géniques, la séquence centromérique n'est ni conservée entre les espèces ni suffisante à la fonction centromérique. Il est donc bien accepté dans la littérature que le centromère est régulé épigénétiquement par une variante de l'histone H3, CENP-A. KNL-2, aussi connu sous le nom de M18BP1, ainsi que ces partenaires Mis18α et Mis18β sont des protéines essentielles pour l'incorporation de CENP-A nouvellement synthétisé aux centromères. Des évidences expérimentales démontrent que KNL-2, ayant un domaine de liaison à l'ADN nommé Myb, est la protéine la plus en amont pour l'incorporation de CENP-A aux centromères en phase G1. Par contre, sa fonction dans le processus d'incorporation de CENP-A aux centromères n'est pas bien comprise et ces partenaires de liaison ne sont pas tous connus. De nouveaux partenaires de liaison de KNL-2 ont été identifiés par des expériences d'immunoprécipitation suivies d'une analyse en spectrométrie de masse. Un rôle dans l'incorporation de CENP-A nouvellement synthétisé aux centromères a été attribué à MgcRacGAP, une des 60 protéines identifiées par l'essai. MgcRacGAP ainsi que les protéines ECT-2 (GEF) et la petite GTPase Cdc42 ont été démontrées comme étant requises pour la stabilité de CENP-A incorporé aux centromères. Ces différentes observations ont mené à l'identification d'une troisième étape au niveau moléculaire pour l'incorporation de CENP-A nouvellement synthétisé en phase G1, celle de la stabilité de CENP-A nouvellement incorporé aux centromères. Cette étape est importante pour le maintien de l'identité centromérique à chaque division cellulaire. Pour caractériser la fonction de KNL-2 lors de l'incorporation de CENP-A nouvellement synthétisé aux centromères, une technique de microscopie à haute résolution couplée à une quantification d'image a été utilisée. Les résultats générés démontrent que le recrutement de KNL-2 au centromère est rapide, environ 5 minutes après la sortie de la mitose. De plus, la structure du domaine Myb de KNL-2 provenant du nématode C. elegans a été résolue par RMN et celle-ci démontre un motif hélice-tour-hélice, une structure connue pour les domaines de liaison à l'ADN de la famille Myb. De plus, les domaines humain (HsMyb) et C. elegans (CeMyb) Myb lient l'ADN in vitro, mais aucune séquence n'est reconnue spécifiquement par ces domaines. Cependant, il a été possible de démontrer que ces deux domaines lient préférentiellement la chromatine CENP-A-YFP comparativement à la chromatine H2B-GFP par un essai modifié de SIMPull sous le microscope TIRF. Donc, le domaine Myb de KNL-2 est suffisant pour reconnaître de façon spécifique la chromatine centromérique. Finalement, l'élément reconnu par les domaines Myb in vitro a potentiellement été identifié. En effet, il a été démontré que les domaines HsMyb et CeMyb lient l'ADN simple brin in vitro. De plus, les domaines HsMyb et CeMyb ne colocalisent pas avec CENP-A lorsqu'exprimés dans les cellules HeLa, mais plutôt avec les corps nucléaires PML, des structures nucléaires composées d'ARN. Donc, en liant potentiellement les transcrits centromériques, les domaines Myb de KNL-2 pourraient spécifier l'incorporation de CENP-A nouvellement synthétisé uniquement aux régions centromériques.

Gastric stability and oral bioavailability of colistin sulfate in pigs challenged or not with Escherichia coli O149: F4 (K88)

The aim of the present study was to investigate the in vitro gastric stability of colistin sulfate (CS) and its antimicrobial activity against Escherichia coli and to study the impact of ETEC O149: F4 (K88) infection in pigs on CS intestinal absorption. The stability profile of CS was evaluated in a simulated gastric fluid (SGF). Antimicrobial activity of CS and its degradation products were examined in a 96-well polystyrene microplate model. The effect of experimental infection with ETEC O149: F4 on CS intestinal absorption was determined by quantification of CS systemic concentration using a validated LC–MS/MS method. A rapid degradation of CS accompanied by an increase in CS antimicrobial activity by comparison with non-degraded CS (P < 0.0001) was observed in SGF. Additionally, CS levels were not quantifiable in systemic circulation using a highly sensitive method and concurrent oral challenge did not affect CS absorption in an induction model of subclinical post-weaning diarrhea (PWD).

On Truncated Versions of Certain Measures of Inequality and Stability

The present study focuses attention on defining certain measures of income inequality for the truncated distributions and characterization of probability distributions using the functional form of these measures, extension of some measures of inequality and stability to higher dimensions, characterization of bivariate models using the above concepts and estimation of some measures of inequality using the Bayesian techniques. The thesis defines certain measures of income inequality for the truncated distributions and studies the effect of truncation upon these measures. An important measure used in Reliability theory, to measure the stability of the component is the residual entropy function. This concept can advantageously used as a measure of inequality of truncated distributions. The geometric mean comes up as handy tool in the measurement of income inequality. The geometric vitality function being the geometric mean of the truncated random variable can be advantageously utilized to measure inequality of the truncated distributions. The study includes problem of estimation of the Lorenz curve, Gini-index and variance of logarithms for the Pareto distribution using Bayesian techniques.

Stability of Random Sums and Extremes

This study is about the stability of random sums and extremes.The difficulty in finding exact sampling distributions resulted in considerable problems of computing probabilities concerning the sums that involve a large number of terms.Functions of sample observations that are natural interest other than the sum,are the extremes,that is , the minimum and the maximum of the observations.Extreme value distributions also arise in problems like the study of size effect on material strengths,the reliability of parallel and series systems made up of large number of components,record values and assessing the levels of air pollution.It may be noticed that the theories of sums and extremes are mutually connected.For instance,in the search for asymptotic normality of sums ,it is assumed that at least the variance of the population is finite.In such cases the contributions of the extremes to the sum of independent and identically distributed(i.i.d) r.vs is negligible.

Effect of the Vulcanization Time and Storage on the Stability and Physical Properties of Sulfur-Prevulcanized Natural Rubber Latex

Prevulcanized natural rubber latex was prepared by the heating of the latex compound at 55°C for different periods of time (2, 4, 6, 8, and 10 h). The changes in the colloidal stability and physical properties were evaluated during the course of prevulcanization. The prevulcanized latex compounds were stored for 300 days, and the properties were monitored at different storage intervals (0, 20, 40, 60, 120, 180, 240, and 300 days). During prevulcanization, the mechanical stability time increased, and the viscosity remained almost constant. The tensile strength increased during storage for a period of 20 days. The degree of crosslinking, modulus, elongation at break, and chloroform number were varied with the time of storage.

Biochemical Investigations on the Stability of Biological Membranes

In this project, an attempt has been made to study the stability of erythrocyte and lysosomal membranes biochemically. Erythrocytes were chosen for the study because of their ready availability and relative simplicity. Biological membranes forming closed boundaries between compartments of varying composition consist mainly of proteins and lipids. They are asymmetric, fluid structures that are thermodynamically stable and metabolically active. Normal cellular function begins with normal membrane structure and any variation in it may upset the normal functions. The degree of fluidity of a membrane depends on the chain length of its lipids and degree of unsaturation of constituent fatty acids. In response to environmental changes, many cells can regulate composition of their membranes to maintain the overall semi fluid environment necessary for many membrane associated functions. The assembly and Maintenance of membrane structures in cells is a dynamic process. The components are not only synthesized and inserted into a growing membrane but are also continuously degraded at a slower rate. This turnover process varies with each individual molecule.Lysosomes are important in the catabolic processes occurring in the cell. Lysosomes contain hydrolytic enzymes and are stable under normal conditions. In certain pathological conditions, the lysosomal membrane may rupture, releasing the hydrolytic enzymes into the cell and digestion of cell takes place as a whole. This is very dangerous. In normal life processes of multi cellular organisms, lysosomes rupture following the death of a cell and it may have some value as a built in mechanism for selfremoval of dead cells.An attempt has also been made in this project towards developing lysosome membrane stability as an index of fish spoilage during storage. Different membranes within the cell and between cells have different compositions as reflected in the ratio of protein to lipid. The difference is not surprising given the very different functions of membranes

Influence of Processing Variables on Protein Quality and Frozen Storage Stability of Two Commercially Important Species of Squid (Loligo duvaucelii and Doryteuthis sibogae )

Cephalopods are utilized as an important food item in various countries because of its delicacy as raw consumed food. Mainly sepia and loligo are consumed raw by Japanese and Russians. The freshness of the products is very important when the product is consumed raw. The major species that dominate our squid catch are Loligo duvaucelii and Doryteuthis sibogae. There is a noticeable difference in the quality of both the species. The needle squid (Doryteuthis sibogae ) contributes about 35% of the total squid landing. Due to the fast deterioration , a major portion of the needle squid, which is caught during the first few hauls, is thrown back to sea. The catch in the last hauls only are taken to the landing centers. At present the needle squid is processed as blanched rings and the desired quality is not obtained if it is processed as whole, whole cleaned or as tubes. In this study an attempt is made to investigate the biochemical characteristics in both the species of squid in relation to their quality and, the process control measures to be adopted. The effect of various treatments on their quality and the changes in proteolytic and lysosomal enzymes under various processing conditions are also studied in detail.Thus this study can provide the seafood industry with relevant suggestions and solutions for effective utilization of both the species of squid with emphasis on needle squid.