Análise da expressão gênica de pequenos RNAs derivados de tRNAs (tRFs) em plantas

Small non coding RNAs emerged as important characters in several biology aspects. Among then, the most studied are microRNAs (miRNAs) and short interfering RNAs (siRNAs), that regulate their target gene post-transcriptionally in plants, animals and RNAi pathway intermediates, respectively. Both of classes have similar biogenesis being processed by Dicer enzymes and subsequent association with Argonaute enzymes. In plants, miRNAs and siRNAs have important functions in development, genome integrity and biotic and abiotic stress responses. The advances in high-throughtput sequencing and in silico analisys provide the uncover of new small non coding RNAs classes, many of them with unknown functions and biogenesis. tRNA derived small RNAs (tRFs) are a small non coding RNA class, that have as precursor a tRNA molecule. These were uncovers in the last decade in many organisms and, recently, in plants. Recent works detected tRFs from different sizes, with different source portions of the mature tRNA molecule (5’ end; 3’ end, anti-codon loop) and some from the tRNA precursor (pre-tRNA), suggesting that may be a novel class of small RNA and not random degradation products. Works in humans showed that some tRFs are processed by the Dicer enzymes, have association with the Argonaute enzymes and cell differentiation, tumor appearance and gene silencing related functions. Works in Arabidopsis and pumpkin (Cucurbita maxima) showed, respectively, that the tRFs have nutritional stress response possible functions and long distance signaling function between source and drain tissues, and may affect the translation. The tRFs biogenesis in plants are, until now an unknown, absence information about it in the literature and its possible biological functions are few studied yet, making then interesting target for studies among the small non coding RNAs in plants

Filogeografia e estrutura populacional de Astyanax paranae (Pisces: Characidae) na Bacia do rio Paranapanema

Atualmente, crescentes esforços vêm sendo desenvolvidos no sentido de se caracterizar a ictiofauna Neotropical de riachos do ponto de vista taxonômico e sistemático, porém a estrutura genética destas populações ainda é pouco conhecida, sendo escassos os estudos sobre filogeografia dessa ictiofauna. Considerando que Astyanax paranae representa a única espécie do complexo scabripinnis na bacia do Alto rio Paraná, a ausência de dados moleculares populacionais e as evidências citogenéticas e morfológicas de que esta espécie não represente uma unidade monofilética, faz-se necessário um amplo estudo filogeográfico e filogenético em Astyanax paranae. O presente projeto teve como objetivo caracterizar a variabilidade genética em populações de Astyanax paranae e estabelecer as relações filogenéticas filogeográficas entre as linhagens mitocondriais na bacia do rio Paranapanema. As análises foram realizadas através da análise de sequências do DNA mitocondrial a partir do gene Citocromo B (cyt b) que foram completamente seqüenciados. Foram analisadas 8 populações de Astyanax paranae: 2 populações da bacia do rio Pardo, 1 Córrego Hortelã, 2 Véu de Noiva, Botucatu/SP; 4 populações da bacia do rio Tibagi, 1 população Maria da Serra/PR; 1 Ponta Grossa/PR, 1 Cambé/PR, 1 Castrolanda/PR; 1 população do rio Itapetiniga, rio Itapetininga, Itapetiniga/SP.; o número de indivíduos por população variou de 1 a 5. Como grupo externo foram analisados 1 população de Astyanax altiparanae com 3 indivíduos (Véu de Noiva pt2, Botucatu/SP); 1 população de Astyanax fasciatus com 5 indivíduos (região de Itapetiniga/SP) e 1 população de Astyanax bockmanni com 2 indivíduos (Véu de Noiva pt2, Botucatu/SP); num total de 39 indivíduos. Entre as...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)

Caracterização molecular de um promotor raiz-específico de eucalipto

A produção de eucalipto no Brasil, impulsionada pelo avanço na tecnologia florestal, tem alcançado índices satisfatórios a nível mundial nos últimos anos. No entanto, apesar de todo o desenvolvimento já obtido, a realização de novas pesquisas que tenham como objetivo aumentar a produtividade do eucalipto com áreas cultivadas reduzidas é muito relevante. A associação do melhoramento genético convencional com técnicas modernas de cunho biotecnológico é imprescindível para que tal benefício seja alcançado. Dentre as ferramentas moleculares necessárias para que tais objetivos sejam atingidos, a identificação e caracterização de promotores órgão-específico representa uma prioridade. Nesse contexto, um EST de eucalipto com expressão específica em raiz foi identificado pelo nosso grupo junto ao banco de dados do projeto FORESTs. A região promotora correspondente foi então amplificada usando a técnica de genome walking. A fim de dar continuidade ao processo de caracterização funcional deste promotor, no presente estudo o fragmento amplificado foi sequenciado, um cassete de expressão contendo o referido promotor foi construído, e plantas transgênicas de tabaco contendo tal cassete foram obtidas visando futuras análises funcionais

Dynamic behavior, stochasticity and enviromental heterogeneity in Tribolium castaneum

In this study we analyzed the influence of demographic parameters on the population dynamics of Tribolium castaneum, combining empiricism and population theory to analyze the different effects of environmental heterogeneity, by employing Ricker models, designed to study a two-patch system taking into account deterministic and stochastic analysis. Results were expressed by bifurcation diagrams and stochastic simulations. Dynamic equilibrium was widely investigated with results suggesting specific parametric spaces in response to environmental heterogeneity and migration. Population equilibrium patterns, synchrony and persistence in T. castaneum were discussed

Caracterização e validação de marcadores microssatélites para golfinhos-rotadores (Stenella longirostris)

A utilização de marcadores microssatélites tem auxiliado os programas de conservação, colaborando na definição de estratégias para proteção e manejo de populações de animais silvestres.Alguns microssatélites já foram desenvolvidos para algumas espécies de cetáceos, inclusive para os golfinhos-rotadores (Stenella longisrostris), aos quais recentemente foram publicados oito microssatélites espécie-específicos. A identificação e caracterização de novos SSR se faz necessário para ampliação das possibilidades de uso desses marcadores em estudos da Biologia e conservação dos golfinhos-rotadores. Deste modo, o presente projeto teve como objetivo dar continuidade a um trabalho de desenvolvimento de microssatélites para S. Longirostris iniciado no Departamento de Genética dessa Universidade, realizando a caracterização e validação de seis primers de microssatélites confeccionados para a espécie. O material tecido epidérmico de golfinhos-rotadores foi coletado no Arquipélago de Fernando de Noronha pelo método de raspagem da pele. A extração do DNA das amostras foi realizada com o uso da resina Chelex. Os primers de microssatélite foram avaliados em reação de PCR (Polymerase Chain Reaction) e validados na população natural. Dos seis primers avaliados quatro não apresentaram amplificação de produtos específicos (Slo5, Slo6, Slo7 e Slo12) e dois amplificaram bandas com tamanhos esperados (Slo8 e Slo10). O primer Slo10 foi monomórfico e o Slo8 apresentou-se polimórfico em gel de acrilamida. E, desta forma, os primers de microssatélites caracterizados neste trabalho contribuirão para a melhor compreensão da biologia da espécie, bem como no planejamento e monitoramento da população de Stenella longirostris

Polimorfismo genético-molecular de diferentes populações de cateto (Mammalia – Dicotylidae – Tayassu tajacu), Brasil

O estudo de populações naturais é imprescindível para compreendermos melhor a sua dinâmica, importância no ecossistema, necessidade de recursos, nível de preservação das espécies, entre outras. O cateto (Tayassu tajacu), apesar de possuir ampla distribuição geográfica e ocupar diversos tipos de habitats, pode sofrer alterações no equilíbrio de suas populações devido às grandes pressões sofridas pela caça e alterações ambientais. Vale lembrar que o sucesso reprodutivo de muitas espécies vegetais está ligado à disseminação de frutos e sementes realizada pelo cateto. Considerando a necessidade de preservação das espécies silvestres, a aplicação de metodologias moleculares é uma das formas de sabermos como se encontra a diversidade genética dessas populações e, a partir daí, criarmos medidas para trabalhos conservacionistas. Nesse sentido, o objetivo deste trabalho foi identificar o nível de polimorfismo genético-molecular entre diferentes populações de Tayassu tajacu no Brasil, demonstrando como essas populações, sujeitas a tantas interferências, encontram-se na natureza. Foram analisadas amostras de 17 indivíduos referentes a oito localidades do Brasil (Cascavel - PR, Foz do Iguaçu - PR, Cuiabá - MT, Ariquemes - RO, Rio Branco - AC, Manaus - AM, Belém - PA, e Carajás - PR). O polimorfismo foi identificado com marcadores de RAPD. Foram testados 38 primers, sendo que desses apenas nove forneceram as 30 marcas polimórficas para o estudo. Foi possível notar que a maioria dos indivíduos da mesma população ou de populações próximas não são os mais semelhantes entre si. Indivíduos de localidade distantes, como os de Foz de Iguaçu (PR) e Manaus (AM) mostraram-se mais semelhantes entre si do que com os animais das suas próprias populações. A variabilidade entre os indivíduos...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)

Variabilidade e diversidade genética de populações de Ocotea notata (Nees & Mart.) Mez (Lauraceae)

O presente trabalho analisou os parâmetros genéticos populacionais de variabilidade e diversidade genética de diferentes populações de Ocotea notata (Nees & Mart.) Mez, através de marcadores de DNA do tipo ISSR (Inter Single Sequence Repeats). Para tanto, foram amostrados 243 indivíduos de 12 populações selecionadas na Bahia e Espírito Santo, que ocorrem em campos rupestres e vegetações de restinga, a saber, morfotipos de Ocotea glaucina (Meisn.) Mez: Morro do Chapéu: populações do Tabuleiro dos Guaribas, Ferro Doido, Cria Bode e Lajes; Umburanas; Jacobina; Lençóis: população da Serra das Paridas, e os morfotipos de O. notata, Esplanada: população de Baixios; Salvador: população das Dunas do Abaeté, Alcobaça, Mucuri, e Vila Velha, ES: população de Jacarenema. O DNA total já se encontrava extraído e quantificado em gel de agarose. Foram testados 20 primers de ISSR (University of British Columbia), dos quais quatro apresentaram resultados adequados para as análises, a saber: Manny, Mao, John e UBC 844. A otimização dos protocolos de reações de PCR foi feita no Laboratório de Evolução Molecular, da UNESP de Rio Claro, com a execução das reações de PCR para cada um dos primers, para cada população, e subsequentemente foram feitas as análises dos resultados sob o arcabouço teóricometodológico da genética de populações. A Análise de Variância Molecular (AMOVA) indicou que 23% da variabilidade ocorre entre populações dentro de regiões e 76% entre indivíduos dentro de populações, com variação significativa de 1% ocorrendo entre regiões (populações de Restinga vs. Campos Rupestres)

Estimativa da diversidade genética de Queixadas (Tayassu pecari) da região do Taboco (Corguinho, MS)

The Brazilian fauna has been constantly threatened by deforestation and forest fragmentation. As a result, many populations become isolated and small which negatively impacts their genetic diversity, putting them at a higher risk of extinction than large and stable populations. The aim of this work was to estimate the genetic diversity of white-lipped peccaries (Tayassu pecari) in the region of Taboco (Corguinho, MS), a fragmented area; and to compare these estimates with that obtained previously for two populations from Brazilian Pantanal, which is considered a relatively well-preserved biome and where the species is not threatened. A total of 18 blood and 72 hair samples of white-lipped peccaries had their DNA extracted and amplified for five polymorphic microsatellite loci. With the individuals identified, genetic diversity indicators (such as number of alleles, allelic richness, expected end and observed) and the inbreeding coefficient FIS were calculated. In addition, to verify if the population suffered a recent population bottleneck, we used the tests implemented in the program Bottleneck. The population of Taboco showed no evidence of recent population bottleneck (p > 0.05) or inbreeding (FIS = 0.008; p > 0.022). In addition, the levels of genetic diversity in this population (mean number of alleles = 2.60; mean allelic richness = 2.56 mean observed and expected heterozygosities = 0.45 and 0.47, respectively) were statistically similar to those found previously for the two populations from Pantanal (p > 0,05); although the region of Taboco is more impacted than the Pantanal. Even though we showed no evidence of loss of genetic diversity, it does not mean that the population is not suffering with fragmentation; but that there was not sufficient time to evidence the genetic changes. In addition, may be occurring gene flow with populations of nearby fragments, which is maintaining... (Complete abstract click electronic access below)

Sensibilidade ambiental ao derrame de biocombustível e óleo: uma análise da estrutura genética populacional do Curimba (Prochilodus lineatus)

As atividades humanas vêm causando grandes pressões nos ecossistemas aquáticos continentais e nos organismos que ai vivem, sendo os peixes o grupo mais afetado. Para compreender o grau de impacto sofrido por uma comunidade é necessário conhecer como esta se encontra estruturada. Este estudo foi organizado em dois capítulos: 1) dedicado a compreender aspectos relacionados à comunidade de peixes da represa de Barra Bonita; 2) análise sobre a estrutura genética do curimba (P. lineatus) no rio Tietê, em diversos segmentos antes e depois das barragens. A estrutura da comunidade de peixes reflete a integridade ecológica do ecossistema, uma vez que diversos comportamentos dependem de determinadas condições ambientais. Por se tratar de um ambiente modificado e exposto a diversos agentes impactantes, estudos sobre a comunidade de peixes na represa de Barra Bonita (rio Tietê) se tornam essenciais para verificar as condições ambientais, auxiliando na gestão deste ecossistema. Para uma análise mais profunda das condições ambientais deste ecossistema, foi realizada também uma análise genética da população do curimba (Prochilodus lineatus), uma vez que o conhecimento da estrutura populacional é fundamental para auxiliar no manejo e conservação das populações de peixes nativos. Os resultados das análises populacionais mostraram que a comunidade de peixes encontrada é típica de ambientes represados, sendo formada por uma maioria de espécies de pequeno e médio porte, do tipo restrategistas, com desova parcelada, sedentárias e que apresentam uma alta plasticidade trófica. No entanto, a presença de espécies com algum grau de ameaça mostra que a região ainda mantém espécies sensíveis mantidas provavelmente pelos tributário que deságuam no rio Tietê. Mesmo a comunidade sendo formada por uma maioria de espécies autóctones, a presença de espécies não nativas nos faz pensar sobre a falta de valorização e conhecimento...

Clonagem e caracterização do promotor de um gene com expressão em folha de Eucalipto (Eucalyptus grandis)

Uma das principais estratégias de ação da biotecnologia na área vegetal trata da produção de plantas geneticamente modificadas com transgenes de interesse. Entretanto, para garantir a correta expressão de tais transgenes em plantas de interesse agronômico e florestal, como é o caso do eucalipto, a identificação e caracterização de seqüências promotoras com padrões conhecidos de expressão gênica se fazem necessárias. Nesse contexto, o presente trabalho objetivou clonar e sequenciar a região promotora de um gene com expressão em folha de Eucalyptus grandis. Em seguida, um cassete de expressão contendo o gene repórter GUS sobre controle do referido promotor foi construído e introduzido em vetor binário. O referido cassete foi então inserido em agrobactéria visando a futura transformação de plantas modelo para a realização de estudos funcionais

Divergência genética entre diferentes populações de Ischnocnema holti (Anura, Brachycephalidae) nas áreas de altitude da Mata Atlântica

Entre os diferentes ambientes da Mata Atlântica as áreas de maior altitude são o hábitat de algumas espécies de anfíbios anuros. Tais espécies devem ser investigadas, pois ambientes montanhosos e acidentados podem propiciar barreiras à dispersão de diversos anuros, podendo fazer com que cada população passe por processos independentes de evolução, podendo levar à especiação. Ischnocnema holti é um exemplo de espécie que encontra-se em áreas de altitude da Mata Atlântica. Trabalhos anteriores revelam que há divergência genética entre amostras de diferentes localidades em que tal espécie habita, onde muitas vezes existe uma confusão de identificação com I. lactea. Este estudo utilizou marcadores moleculares para estimar a divergência genética entre as populações atribuídas à espécie em estudo nas diferentes áreas de altitude em que esta se encontra, buscando-se contribuir à compreensão de como barreiras geográficas por altitude poderiam interferir nos padrões de diversidade desta região, além de esclarecer o conflito de identificação. Dentro do complexo de espécies I. lactea/holti observou-se sete clados genéticos que podem ser novas espécies. Os resultados obtidos no presente trabalho sugerem que os espécimes incluídos no clado II correspondem à espécie Ischnocnema holti e sua distribuição restringe-se à parte alta da Serra do Itatiaia, no município de Itamonte, estado de Minas Gerais. Já os exemplares dos clados I, III, IV, V, VI e VII provavelmente não correspondem à espécie I. holti, fazendo-se necessária uma maior amostragem para estabelecer em definitivo as relações e os limites específicos neste complexo de espécies. Para melhor entendimento deste complexo é necessária uma revisão taxonômica, sendo indispensáveis estudos com base em aspectos morfológicos, bioacústicos, ecológicos e genéticos... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)

Ecologia molecular como ferramenta no estudo populacional do último megamamífero sulamericano: a anta (Tapirus terrestris) no Pantanal de Nhecolândia, MS

O presente estudo foi desenvolvido no Núcleo São Miguel Arcanjo do Parque Estadual Carlos Botelho, situado na Serra de Paranapiacaba, região sudeste do estado de São Paulo, Brasil. Quantificaram-se os regenerantes lenhosos ≤ 10 cm de altura sob interferência da cobertura de Calathea communis Wanderley & S. Vieira (Maranthaceae), envolvendo os ambientes de encosta e fundo de vale, em três períodos: junho e outubro de 2011, assim como em fevereiro de 2012. Foram utilizados os parâmetros de densidade, sobrevivência e colonização (input) para a caracterização da regeneração. No sorteio dos pontos de amostragem, cada um de 6transectos (aproximadamente 1 Km de extensão) foi sub-dividido em 20 frações de 50 metros, sendo sorteados 10 pontos por transecção. Do total de 120 parcelas (1X1m) que amostraram as plântulas, 60 localizaram-se em ambiente de fundo de vale e 60 na encosta, sendo que em cada condição topográfica 30 parcelas foram montadas sob a cobertura de C.communis e 30 na sua ausência. Os dados foram discutidos com base na aplicação de uma análise de variância fatorial, associada ao teste de Tukey de comparação de médias “a posteriori”. Observou-se que, para a densidade, a presença e ausência de Calathea communis geraram diferenças significativas (p≤0,05) nos períodos de outubro/2011 e fevereiro/2012, no entanto, para os ambientes topográficos só ocorreu variação significativa da densidade no período de fevereiro/2012. Quanto à sobrevivência, as diferenças significativas foram relacionadas à topografia, mas apenas no período de fevereiro/2012. Considerando-se os valores de input, estes foram maiores nas parcelas situadas em fundo de vale e em condições de ausência de Calathea, embora tais diferenças não sejam significativas (p≥0,05), segundo indicações da análise de variância

Clonagem de sequências codificantes de citocinas felinas para construção de curva padrão para PCR em tempo real

A quantificação de citocinas felinas possibilita uma avaliação do sistema imune do animal em diferentes doenças, permite também a identificação de diferentes fatores que alteram sua secreção, e colabora na compreensão da patogênese das enfermidades. Em humanos e camundongos essa mensuração é feita principalmente pelo método de ELISA, mas para os felinos há uma menor disponibilidade de kits específicos para determinadas citocinas, e estes possuem um custo elevado. Assim, uma alternativa é utilizar a reação de PCR em tempo real com transcrição reversa (RT-qPCR) para quantificação absoluta dos RNAs mensageiros das citocinas felinas, uma técnica bastante sensível e específica para analisar a expressão desses genes. Com esse intuito, esse trabalho teve como objetivo clonar as sequências gênicas codificantes de citocinas, para construir uma curva padrão para a qPCR. Assim, foi feita extração de RNA de amostras de sangue total de gatos domésticos, e estes foram tratados com DNAse para evitar contaminação por DNA genômico. O cDNA foi sintetizado, e amplificado com os primers específicos para cada fragmento codificante de citocina e o GAPDH felino. Cada amplicon purificado foi inserido em um plasmídeo comercial, e introduzido em bactérias E. coli cepa DH5. Os clones recombinantes foram sequenciados para confirmar a inserção do fragmento no vetor. As curvas padrão da qPCR foram construídas com cada plasmídeo recombinante numa de 106 a 101 cópias por reação. O sequenciamento mostrou que todos os clones eram semelhantes àqueles encontrados no GenBank. A eficiência das amplificações, baseado no slope das curvas padrão foram: 101,3% para GAPDH, 99,1% para IL-1, 83,2% para IL-6, 94,4% para IL-10, 105,5% para IL-12, 83,4% para IFN- e 83,8% para TNF-. O valor de r2 foi de 0,99 em todas as reações. Dessa forma, com a clonagem dos fragmentos... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)

Padronização da técnica de PCR em tempo-real na avaliação da pluripotência de células-tronco mesequimais caninas

Este relatório final tem como objetivo apresentar as atividades desenvolvidas no período de janeiro/2009 a março/2010, pela aluna Thaila Isabel Wodewotzky, relativas ao projeto de conclusão de curso intitulado “Padronização da Técnica de PCR em tempo-real na Avaliação da Pluripotência de Células-tronco Mesenquimais Caninas”, para fins de obtenção do título de Bacharel em Ciências Biológicas. O referido projeto objetiva avaliar a quantificação e relevância dos níveis de expressão gênica do fator de transcrição Oct4 em CTM´s, por meio da padronização da técnica de PCR em tempo-real. Para tanto, o RNA total das CTM´s obtidas, isoladas e cultivadas a partir da medula óssea de cães foi extraído a partir da medula óssea de cães a fim de avaliar a quantificação e relevância dos níveis de expressão gênica do Oct4 por meio da utilização da técnica de PCR em tempo-real com transcrição reversa (RT-qPCR). O RNA total foi extraído e submetido à reação de transcriptase reversa, para a obtenção do cDNA. Posteriormente esse cDNA foi utilizado na padronização da técnica de qPCR utilizando primers desenhados a partir de sequências obtidas no genebank. . Como normalizador utilizou-se o RNA codificante de GAPDH.Verificou-se desempenho satisfatório dos primers para Otc4 na avaliação de CTM´s de cães. Também o RNAm do GAPDH foi adequado como normalizador. Dessa forma, esse sistema pode ser utilizado na realização de testes quantitativos utilizando amostras de células-tronco embrionárias caninas

Análise de 15 STRS autossômicos na população de Araraquara (São Paulo, Brasil)

Os marcadores genéticos mais utilizados para fins de identificação humana são regiões autossômicas de repetições consecutivas curtas (Short Tandem Repeats - STRs) e para interpretar a análise de DNA, os resultados de um caso necessitam ser comparados com os dados de uma pertinente população. O objetivo do trabalho, portanto, foi caracterizar o perfil genético da população de Araraquara, (São Paulo, Brasil) pela análise de 15 STRs autossômicos (D3S1358, TH01, D21S11, D18S51, Penta E, D5S818, D13S317, D7S820, D16S539, CSF1PO, Penta D, VWA, D8S1179, TPOX and FGA) inclusos no kit PowerPlex 16 (Promega) e correlacionar esses dados com a história de formação da população. Não foram observados desvio do equilíbrio de Hardy - Weinberg após correção de Bonferroni. Parâmetros forenses apresentaram valores elevados, sendo os marcadores mais polimórficos o Penta E, D18S51 e FGA. A árvore UPGMA (Unweighted Pair- Group Method with Arithmetic Mean) baseada na medida de distância genética mostrou a população de Araraquara agrupada com as populações da região sudeste do Brasil, próxima do grupo europeu e distante das populações Africana e Ameríndia. Estimativas de mistura revelaram que a contribuição parental para a população de Araraquara foi 76% européia, 18% africana e 6% ameríndia