971 resultados para PCR‑RFLP


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Introduction This work presents the initial findings of a molecular epidemiological investigation of Trypanosoma cruzi in triatomine insects in State of Mato Grosso do Sul. Methods A total of 511 triatomines from different regions of the state were examined. Deoxyribonucleic acid (DNA) was extracted from the intestinal contents of the insects using phenol-chloroform-isoamyl alcohol (25:24:1). Polymerase chain reaction (PCR) using primers 121/122 targeting DNA kinetoplast (kDNA) was then performed to identify T. cruzi, and positive samples were subjected to PCR using the primer pair TcSC5D-F/R followed by restriction fragment length polymorphism (RFLP) with the restriction enzymes SphI and HpaI (1 U/reaction), cloning and sequencing. Results One hundred samples were positive for T. cruzi, and three discrete typing units (DTUs) were identified (TcI, TcII, and TcBat). Triatoma sordida had the highest T. cruzi occurrence (83.3%), and DTUs were found in three samples: 58.3% of the samples were TcI, 33.3% were TcII and 8.3% were TcBat. There was a clear geographical distribution of the DTUs throughout the state, with TcI, TcII and TcBat located in the center, TcI located in the east, and TcII located in the west. Conclusions This study showed the occurrence of overlapping DTUs in State of Mato Grosso do Sul. The distributions of the DTUs were different, with TcI, TcII and TcBat in the center of the state, TcI predominantly in the east, and TcII in the west. Further studies may reveal a more defined mosaic distribution of DTUs in MS.

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Toxoplasmosis and leishmaniasis are two worldwide zoonoses caused by the protozoan parasites Toxoplasma gondii and Leishmania spp., respectively. This report describes the clinical and laboratorial findings of a co-infection with both parasites in a 4-year-old female dog suspected of ehrlichiosis that presented anemia, thrombocytopenia, hypoalbuminemia, hyperglobulinemia, tachyzoite-like structures to the lung imprints, and polymerase chain reaction (PCR) results positive for T. gondii (kidney, lung, and liver) and Leishmania spp. Co-infection with Toxoplasma gondii and Leishmania braziliensis was confirmed by sequencing; restriction fragment length polymorphism-polymerase chain reaction (RFLP-PCR) confirmed an atypical T. gondii genotype circulating in dogs that has been reported to cause human congenital toxoplasmosis.

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AbstractINTRODUCTIONThe aim of this study was to detect the prevalence of the extended-spectrum beta-lactamase (ESBL)-encoding CTX-M gene in Escherichia coliisolates.METHODS:Phenotypic screening of 376 E. coli isolates for ESBL was conducted using disk diffusion. ESBL-producing isolates were tested using PCR and specific primers. The blaCTX-M cluster was identified using the RFLP method, and its genotype was sequenced.RESULTS:From 202 ESBL-producing E. coli , 185 (91.5%) possessed CTX-M genes. CTX-M-1 subtypes were found in 98% of the isolates. The blaCTX-M gene was identical to CTX-M-15.CONCLUSIONS:A high prevalence of CTX-M-1-producing E. coli apparently exists in Shiraz, Iran.

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Abstract: INTRODUCTION : Molecular analyses are auxiliary tools for detecting Koch's bacilli in clinical specimens from patients with suspected tuberculosis (TB). However, there are still no efficient diagnostic tests that combine high sensitivity and specificity and yield rapid results in the detection of TB. This study evaluated single-tube nested polymerase chain reaction (STNPCR) as a molecular diagnostic test with low risk of cross contamination for detecting Mycobacterium tuberculosis in clinical samples. METHODS: Mycobacterium tuberculosis deoxyribonucleic acid (DNA) was detected in blood and urine samples by STNPCR followed by agarose gel electrophoresis. In this system, reaction tubes were not opened between the two stages of PCR (simple and nested). RESULTS: STNPCR demonstrated good accuracy in clinical samples with no cross contamination between microtubes. Sensitivity in blood and urine, analyzed in parallel, was 35%-62% for pulmonary and 41%-72% for extrapulmonary TB. The specificity of STNPCR was 100% in most analyses, depending on the type of clinical sample (blood or urine) and clinical form of disease (pulmonary or extrapulmonary). CONCLUSIONS: STNPCR was effective in detecting TB, especially the extrapulmonary form for which sensitivity was higher, and had the advantage of less invasive sample collection from patients for whom a spontaneous sputum sample was unavailable. With low risk of cross contamination, the STNPCR can be used as an adjunct to conventional methods for diagnosing TB.

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Abstract: INTRODUCTION: Conjunctival swab PCR was evaluated as a tool to diagnose visceral leishmaniasis in dogs. METHODS: Conjunctival swab PCR was compared to indirect immunofluorescence antibody test and blood PCR. RESULTS: Indirect immunofluorescence was significantly correlated with conjunctival swab PCR (p < 0.05), but not with blood PCR (p > 0.05). In addition, conjunctival swab PCR was significantly associated with presence of clinical symptoms (p < 0.05), whereas blood PCR was associated with absence of clinical symptoms (p < 0.05). CONCLUSIONS: Results indicate that conjunctival swab PCR is useful in epidemiological surveys of canine visceral leishmaniasis.

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As leveduras da espécie Candida albicans são comensais do ser humano, podendo em certos casos, como a toma prolongada de antibióticos de largo espectro, a diminuição da imunidade, ou a quimioterapia, causar infecções severas. Estas infecções classificam-se em superficiais ou sistémicas, consoante a zona anatómica ou os órgãos afectados. As infecções hospitalares por fungos, nomeadamente as causadas por C. albicans, têm vindo a aumentar nos últimos anos, assim como a mortalidade e a morbilidade associadas, e ainda os custos relacionados com os cuidados de saúde. Torna-se por isso importante a implementação de terapêutica de uma forma rápida, eficaz e correcta. Assim, é imperativo que os laboratórios de microbiologia clínica possuam métodos de diagnóstico rápidos, simples e económicos em relação a uma correcta identificação ao nível de espécie e em relação ao estudo da sensibilidade aos antifúngicos. Contudo, esta identificação ao nível de espécie não permite averiguar a origem das infecções, facto importante para a compreensão da evolução das infecções nosocomiais. Para tal, é necessário realizar um estudo ao nível de estirpe através de métodos moleculares que permitam fazer a distinção acurada entre isolados de C. albicans. Os métodos moleculares têm vindo a desenvolver um papel importante no diagnóstico de infecções: são rápidos, sensíveis, precisos e possuem a vantagem de se poder trabalhar pequenas quantidades de amostra. Têm no entanto a desvantagem de ser métodos caros, por vezes demasiado elaborados para serem instituídos num laboratório de microbiologia clínica com grande volume de amostras diárias. O principal objectivo deste trabalho consistiu na diferenciação de estirpes de C. albicans através de uma metodologia molecular inovadora, nunca antes efectuada no ocidente, simples e rápida, por meio de simples amplificações por PCR. Para tal, foram seleccionados 60 isolados clínicos de leveduras obtidas a partir de amostras clínicas de três localidades: Covilhã (Centro Hospitalar Cova de Beira, E.P.E) Lisboa (Instituto Português de Oncologia e Hospital de Santa Maria, E.P.E) e Viseu (Hospital de São Teotónio). O trabalho baseou-se na genotipagem de isolados clínicos de C. albicans por amplificação por PCR com primers dirigidos às sequências 25S rDNA e às regiões ALT das sequências RPS. Foi possível a sua diferenciação e distinção em estirpes, fazendo deste método um bom recurso para estudos epidemiológicos. Realizou-se ainda um estudo de sensibilidade in vitro das estirpes de C. albicans ao antifúngicos Fluconazol e Voriconazol pelo método de difusão em disco, segundo os procedimentos padronizados e publicados pelo CLSI. Através deste estudo foi verificada elevada susceptibilidade aos antifúngicos estudados. Com este trabalho conclui-se que a diferenciação ao nível de estirpe é muito importante para compreender padrões de surtos de infecções e ainda para averiguar a origem, endógena ou exógena, destas infecções nosocomiais. Como tal, este estudo epidemiológico torna-se essencial para definir um controlo mais rigoroso das infecções.

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As alergias alimentares são um grande problema de saúde pública a nível mundial, que ocorre em todas as faixas etárias, tendo maior incidência em crianças. Mediada pelo sistema imunitário, a alergia alimentar é uma reação adversa que ocorre devido à presença de alergénios alimentares, que são identificados erroneamente como sendo um perigo ao organismo. Como é uma patologia que não possui cura, a prevenção é a melhor forma de evitar que ocorram reações alérgicas em indivíduos sensíveis, sendo a rotulagem um componente indispensável para a identificação dos alergénios presentes nos alimentos. Dentro dos métodos utilizados para a deteção de alergénios está a Reação em Cadeia da Polimerase em tempo real (PCR em tempo real), que é capaz de identificar o gene que codifica a proteína alergénica. Este método possui elevada sensibilidade e especificidade, sendo atualmente utilizado na área alimentar para a deteção de organismos genéticamente modificados e alergénios. Devido a uma grande procura de clientes e consumidores, para identificação de alergénios em alimentos, o objetivo do presente trabalho foi implementar e validar, a partir de análises de sensibilidade, precisão e robustez, o método de PCR em tempo real. Dessa forma, foi testada a deteção qualitativa de oito alergénios em alimentos, sendo estes o aipo, amendoim, avelã, caju, noz, pistáchio, sésamo e soja, no Laboratório da SGS - Société Générale de Surveillance. Destes alergénios, foi possível a validação de sete, demonstrando que o método de PCR em tempo real, para os presentes alergénios, possui elevada precisão e sensibilidade nos resultados obtidos.

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O Pau-rosa (Aniba rosaeodora Ducke) é uma espécie importante economicamente para a Região Amazônica, porque sua madeira é fonte de linalol, insumo utilizado pelas perfumarias. Esta espécie foi explorada durante décadas e, ainda assim, o conhecimento acerca da diversidade genética intra-específica é muito restrito. Foram objetivos deste trabalho: 1) validar um protocolo para coleta de folhas de pau-rosa que permitisse preservar a integridade do DNA até a estocagem em "freezer"; 2) selecionar um protocolo para extração de DNA em quantidade e qualidade adequadas para geração de bandas RAPD e 3) desenvolver um critério para avaliar o grau de reprodutibilidade que pudesse auxiliar a seleção de bandas RAPD úteis para análises de diversidade genética. Imediatamente após a coleta, as folhas foram acondicionadas em tubos de polietileno com sílica gel e aí permaneceram por até 10 dias. Foram testados três protocolos para a extração de ácidos nucléicos destas folhas, condições ideais para as PCR e a reprodutibilidade dos padrões RAPD. Critérios para a eliminação das bandas que mais contribuíram para o afastamento dos resultados do ideal da reprodutibilidade total foram desenvolvidos e a significância estatística das diferenças geradas pela aplicação dos critérios ao conjunto de dados foi testada. DNA com qualidade e em quantidade suficiente para a geração de padrões RAPD, nas condições ideais definidas para as PCRs, foi obtido. A eliminação de bandas com reprodutibilidade menor que 70% não diferiu do controle. A eliminação de bandas com reprodutibilidade menor que 90% diferiu dos demais tratamentos em todos os arranjos testados (P < 5%).

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FUNDAMENTO: A aterosclerose é uma doença inflamatória e níveis séricos de marcadores inflamatórios, como a interleucina 6 (IL-6), interleucina-18 (IL-18) e proteína C reativa (PCR), são utilizados para avaliação de pacientes em quadros de coronariopatia. No paciente com diabete do tipo 2, a aterosclerose está relacionada a um maior número de eventos como infarto e morte, quando comparado aos pacientes sem diabete. OBJETIVO: Avaliar a resposta inflamatória nos pacientes com diabete e eventos agudos de instabilidade coronariana. MÉTODOS: Selecionamos primariamente dois grupos de pacientes. O primeiro grupo foi composto por pacientes ambulatoriais diabéticos com angina estável (D-SCC) e presença de coronariopatia ao estudo coronariográfico (n = 36). O segundo grupo foi composto por pacientes diabéticos atendidos no pronto-socorro com quadro de síndrome coronariana aguda (D-SCA) sem supradesnivelamento do ST (n = 38). Como controle, foram utilizados pacientes sem diabete com SCA (n = 22) e SCC (n = 16). As concentrações séricas de PCR, IL-6 e IL-18 foram determinadas pelas técnicas de nefelometria (PCR) e ELISA (IL-6 e IL-18). RESULTADOS: Níveis mais elevados de IL-6 foram observados em pacientes com ou sem diabete e SCA em relação ao grupo com SCC. Por sua vez, pacientes com diabete e SCA apresentaram concentrações maiores de PCR em comparação aos outros grupos. Os níveis séricos de IL-18 não diferiram significativamente entre os pacientes estudados. CONCLUSÃO: Os resultados obtidos sugerem uma maior atividade inflamatória no paciente com quadro de instabilidade coronariana. Essa atividade inflamatória, medida pela PCR, parece ser ainda mais intensa no paciente com diabete.

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El virus del papiloma humano (VPH) es una de las de infecciones de transmisión sexual (ITS) más frecuentes [1]. Varios genotipos de VPH pueden generar verrugas genitales, y otros están fuertemente asociados a displasia cervical, cáncer de cuello uterino, de vulva, ano, pene y de orofaringe. La alta prevalencia de la infección por este virus en caso de lesiones bucal premalignas indica que la infección podría ser un evento temprano en el proceso de transformación maligna de las c. Epitelial de la cavidad bucal. La asociación epidemiológica del VPH con Carcinoma de Células escamosa, así como la evidencia biológica dado por la transformación de las células epitelial por oncogenes del virus sugiere que los VPH específicos son importantes para el proceso de malignización, sin que este determine el tamaño ni el estado del tumor. Objetivos 1) Analizar el grado de conocimiento de la población incluida en una encuesta, respecto de las vías de transmisión del VPH, los métodos de prevención, los factores de riesgo y su asociación con las verrugas genitales y el cáncer de cuello de útero, ano, pene y de orofaringe. 2) Determinar la prevalencia y genotipos del VPH en lesiones preneoplásicas y neoplásicas de las vías aerodigestivas superiores de pacientes adultos que acuden a la Fac de Odontología y evaluar los factores de riesgo asociados (sexuales, hhábito de fumar, etc) 3) Determinar la prevalencia y genotipos del VPH en mucosa sana y que presenten lesiones de pacientes pediátricos que acuden a la Facultad de Odontología de la U.N.C.; Servicio del Hospital de Niños de la Pcia de Córdoba y evaluar los factores de riesgo asociados (sexuales, otras ITS por ej: C.trachomatis, M.genital) MATERIALES Y METODOS: Objetivo 1: Se entregará un cuestionario de 28 ítems, con carácter anónimo no vinculante, a estudiantes (mayores de 18 años de edad) universitarios de primer año de las carreras de Medicina, Odontología, FAMAF, Psicopedagogía del Inst Sup Dr. D.Cabred, de la catedra Bacteriologia y Virologia de la F.C.M., pacientes que asisten a los servicios de: Infectología y Ginecología del H.N.C., Ginecología e Infectología del Hospital Italiano, Urología del Hospital San Roque, Ginecología del H.M.N., Lab de Andrología y Reproducción y Lab de Chlamydias y HPV del Instituto de Virología y a empleados y afiliados que asisten a APROSS. Objetivo 2/3: Las muestras con PAP, serán receptadas en 500µl de PBS, luego se extraerá ADN, utilizando un equipo comercial (Bioneer). Se amplificará por PCR, un segmento (450 pb), correspondientes a la región L1 del genoma viral, utilizando los llamados “primer” degenerados MY09 y MY11. La amplificación del gen de la beta-globina se utilizará para comprobar la presencia de un templado; a partir de los productos VPH positivos se realizará digestión enzimática (BamHI, HaeIII, HinfI, PstI, RsaI, DdeI y Sau3A1) lo que permitirá la identificación del genotipo a por RFLP en gel de agarosa al 2%. Se utilizará para el análisis estadístico el programa Epi Info versión 3.5.1 2008 (http://www.cdc.gov/epiinfo/). Se alinearán las secuencias de ADN empleando el programa Clustal X (23). Las secuencias serán utilizadas para genotipificación por métodos filogenético [o utilizando la herramienta de genotipificación viral del NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genotyping/formpage.cgi)] El análisis filogenético se realizará empleando el Programa MEGA 3 (11) empleando la metodología de Neighbor Joining y se evaluarán por Bootstrap. Resultados esperados:La encuesta brindará datos que se podrán aprovechar para los programas de prevención de la infección con VPH. Se podrá determinar cuáles son los genotipos circulantes en nuestra población y cuáles son los factores de riesgo asociados. Se podrá establecer cuáles son los genotipos asociados a las lesiones preneoplásicas y neoplásicas de la mucosa oral, y determinar la probabilidad de que la vacunación contra los VPH 6, 11, 16 y 18 pueda prevenir la aparición de estas lesiones.

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El descubrimiento de técnicas más sensibles para la detección del T. cruzi en el enfermo chagásico rescató el rol primordial del parásito en la patogenia y actualmente se considera a la enfermedad como el producto de la interacción de los genomas del parásito y el humano. Sin embargo aún queda por responder por qué el 30% de las personas infectadas evolucionan hacia una enfermedad cardíaca y el 70% permanece asintomático aunque con serología persistente; así como también la amplia variabilidad clínica, que puede resultar desde una cardiopatía sin consecuencias hasta producir muerte súbita. En este sentido, se ha descripto que la variabilidad genética del parásito debe estar relacionada con el tropismo del mismo a los diferentes órganos del huésped y, por lo tanto, con la forma clínica de la enfermedad y con las diferencias observadas luego del tratamiento específico de la enfermedad. Es por ello que proponemos determinar la importancia que tiene la composición genética del aislamiento de T. cruzi que infectó al huésped y/o la de los clones diferentes que pueden aparecer en sangre para explicar la amplia variabilidad de síntomas y signos que manifiestan los pacientes con cardiopatía chagásica crónica. Estos resultados contribuirán al entendimiento de la fisiopatogenia de la miocardiopatía chagásica y sus variabilidades clínicas y facilitarán establecer el pronóstico y tratamiento de la enfermedad. Pacientes que concurran al Hospital Materno Infantil de la Provincia de Córdoba, al Hospital Nacional de Clínicas y a la Clínica Sucre serán tratados de acuerdo con la declaración de Helsinki y firmarán consentimiento informado. Se seguirá la evolución clínico-cardiológica por radiografía, electrocardiografía y ecocardiografía. La serología para Chagas se determinará por HAI-ELISA. Se obtendrán muestras de sangre de estos pacientes que se clasificarán con serología positiva para Chagas sin cardiopatía, con cardiopatía leve y con cardiopatía severa. Extracción del ADN: las muestras de sangre periférica de cada paciente se mezclarán con igual volumen de guanidina 6M/EDTA 0,5M. El ADN se extraerá por técnicas convencionales con fenol:cloroformo:alcohol isoamílico y luego se precipitará con etanol. Finalmente la solución se resuspenderá en agua estéril libre de nucleasas. Se conservará a -4º C hasta su uso para la amplificación del contenido de ADN del parásito por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). PCR: la detección de los parásitos en cada muestra se determinará mediante la amplificación por PCR de un fragmento de la región variable correspondiente al minicírculo del ADN del kinetoplasto (kADN), utilizando primers específicos para dicha región. Análisis de la región variable del kADN por enzimas de restricción: la caracterización de los parásitos de cada muestra se realizará además mediante el análisis de los fragmentos producidos luego de la digestión con enzimas de restricción (RFLP). El amplificado producto de la PCR se utilizará para la digestión con las enzimas de restricción y los fragmentos obtenidos serán separados por electroforesis en geles de agarosa 2% teñidos con bromuro de etidio. Análisis de los resultados: Los perfiles de bandas obtenidos luego de la digestión con las enzimas de restricción de las muestras de sangre de los pacientes se correlacionarán con la sintomatología clínica de cada uno de ellos para determinar si existe relación entre la variabilidad genética del parásito infectante y la variedad clínica presentada. Los perfiles de bandas obtenidos luego de la RFLP de las muestras de sangre se analizarán cualitativamente por observación de los geles.

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FUNDAMENTO: Há grande interesse no uso de proteína C-reativa de alta sensibilidade (PCR-as) para avaliação de risco. Altos níveis de PCR-as no início da síndrome coronária aguda (SCA), antes da necrose tecidual, pode ser um marcador substituto para comorbidades cardiovasculares. OBJETIVO: Dessa forma, nosso objetivo foi estudar diferentes medidas de seguimento de níveis de PCR-as em pacientes com SCA e comparar as diferenças entre infarto do miocárdio sem elevação do segmento ST (NSTEMI) com pacientes apresentando elevação do segmento ST (STEMI). MÉTODOS: Este é um estudo observacional. Dos 89 pacientes recrutados, 60 apresentavam infarto agudo do miocárdio (IAM). Três níveis seriados de PCR-us, a nível basal na hospitalização antes de 12 horas após inicio dos sintomas, níveis de pico 36-48 horas após hospitalização e níveis de acompanhamento após 4 a 6 semanas foram analisados e comparados entre pacientes com (IAMCSST) e sem supradesnivelamento do segmento ST (IAMSSST). RESULTADOS: Pacientes com IAMCSST tinham IMC significantemente mais alta quando comparados com pacientes IAMSSST. Os níveis de creatino quinase fração MB (CK-MB) e aspartato aminotransferase (AST) eram significantemente mais altos em pacientes com IAMCSST quando comparados com pacientes com IAMSSST (p<0,05). Os níveis de PCR a nível basal e no acompanhamento não diferiram de forma significante entre os dois grupos (p=0,2152 e p=0,4686 respectivamente). Houve uma diferença significante nos níveis de pico de PCR entre os dois grupos. No grupo de pacientes com IAMCSST os níveis foram significantemente mais altos quando comparados aos pacientes com IAMSSST (p=0,0464). CONCLUSÃO: Pacientes com IAMCSST apresentam picos significantemente mais elevados de PCR quando comparados a pacientes IAMSSST. Esses dados sugerem que o processo inflamatório tem um papel independente na patogênese do infarto do miocárdio. Dessa forma, os níveis de PCR podem ajudar na estratificação de risco após o infarto do miocárdio.

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Fundamento: Em pacientes com hipertensão arterial sistêmica, a microalbuminúria é um marcador de lesão endotelial e está associada a um risco aumentado de doença cardiovascular. Objetivo: O objetivo do presente estudo foi determinar os fatores que influenciam a ocorrência de microalbumiúria em pacientes hipertensos com creatinina sérica menor que 1,5 mg/dL. Métodos: Foram incluídos no estudo 133 pacientes brasileiros atendidos em um ambulatório multidisciplinar para hipertensos. Pacientes com creatinina sérica maior do que 1,5 mg/dL e aqueles com diabete mellitus foram excluídos do estudo. A pressão arterial sistólica e diastólica foi aferida. O índice de massa corporal (IMC) e a taxa de filtração glomerular estimada pela fórmula CKD-EPI foram calculados. Em um estudo transversal, creatinina, cistatina C, colesterol total, HDL colesterol, LDL colesterol, triglicerídeos, proteína C-reativa (PCR) e glicose foram mensurados em amostra de sangue. A microalbuminúria foi determinada na urina colhida em 24 horas. Os hipertensos foram classificados pela presença de um ou mais critérios para síndrome metabólica. Resultados: Em análise de regressão múltipla, os níveis séricos de cistatina C, PCR, o índice aterogênico log TG/HDLc e a presença de três ou mais critérios para síndrome metabólica foram positivamente correlacionados com a microalbuminuria (r2: 0,277; p < 0,05). Conclusão: Cistatina C, PCR, log TG/HDLc e presença de três ou mais critérios para síndrome metabólica, independentemente da creatinina sérica, foram associados com a microalbuminúria, um marcador precoce de lesão renal e de risco cardiovascular em pacientes com hipertensão arterial essencial.