Probabilistic Modeling of Rosette Formation

������������: Rosetting, or forming a cell aggregate between a single target nucleated cell and a number of red blood cells (RBCs), is a simple assay for cell adhesion-mediated by specific receptor-ligand interaction. For example, rosette formation between sheep RBC and human lymphocytes has been used to differentiate T cells from B cells. Rosetting assay is commonly used to determine the interaction of Fc gamma-receptors (Fc gamma R) expressed on inflammatory cells and IgG-coated on RBCs. Despite its wide use in measuring cell adhesion, the biophysical parameters of rosette formation have not been well characterized. Here we developed a probabilistic model to describe the distribution of rosette sizes, which is Poissonian. The average rosette size is predicted to be proportional to the apparent two-dimensional binding affinity of the interacting receptor-ligand pair and their site densities. The model has been supported by experiments of rosettes mediated by four molecular interactions: Fc gamma RIII interacting with IgG, T cell receptor and coreceptor CD8 interacting with antigen peptide presented by major histocompatibility molecule, P-selectin interacting with P-selectin glycoprotein ligand 1 (PSGL-1), and L-selectin interacting with PSGL-1. The latter two are structurally similar and are different from the former two. Fitting the model to data enabled us to evaluate the apparent effective two-dimensional binding affinity of the interacting molecular pairs: 7.19x10(-5) mu m(4) for Fc gamma RIII-IgG interaction, 4.66x10(-3) mu m(4) for P-selectin-PSGL-1 interaction, and 0.94x10(-3) mu m(4) for L-selectin-PSGL-1 interaction. These results elucidate the biophysical mechanism of rosette formation and enable it to become a semiquantitative assay that relates the rosette size to the effective affinity for receptor-ligand binding.

Two-Dimensional Kinetics Of Beta(2)-Integrin And Icam-1 Bindings Between Neutrophils And Melanoma Cells In A Shear Flow

Cell adhesion, mediated by specific receptor-ligand interactions, plays an important role in biological processes such as tumor metastasis and inflammatory cascade. For example, interactions between beta(2)-integrin ( lymphocyte function-associated antigen-1 and/or Mac-1) on polymorphonuclear neutrophils (PMNs) and ICAM-1 on melanoma cells initiate the bindings of melanoma cells to PMNs within the tumor microenvironment in blood flow, which in turn activate PMN-melanoma cell aggregation in a near-wall region of the vascular endothelium, therefore enhancing subsequent extravasation of melanoma cells in the microcirculations. Kinetics of integrin-ligand bindings in a shear flow is the determinant of such a process, which has not been well understood. In the present study, interactions of PMNs with WM9 melanoma cells were investigated to quantify the kinetics of beta(2)-integrin and ICAM-1 bindings using a cone-plate viscometer that generates a linear shear flow combined with a two-color flow cytometry technique. Aggregation fractions exhibited a transition phase where it first increased before 60 s and then decreased with shear durations. Melanoma-PMN aggregation was also found to be inversely correlated with the shear rate. A previously developed probabilistic model was modified to predict the time dependence of aggregation fractions at different shear rates and medium viscosities. Kinetic parameters of beta(2)-integrin and ICAM-1 bindings were obtained by individual or global fittings, which were comparable to respectively published values. These findings provide new quantitative understanding of the biophysical basis of leukocyte-tumor cell interactions mediated by specific receptor-ligand interactions under shear flow conditions.

Fine mapping and functional analysis of the multiple sclerosis risk gene CD6

CD6 has recently been identified and validated as risk gene for multiple sclerosis (MS), based on the association of a single nucleotide polymorphism (SNP), rs17824933, located in intron 1. CD6 is a cell surface scavenger receptor involved in T-cell activation and proliferation, as well as in thymocyte differentiation. In this study, we performed a haptag SNP screen of the CD6 gene locus using a total of thirteen tagging SNPs, of which three were non-synonymous SNPs, and replicated the recently reported GWAS SNP rs650258 in a Spanish-Basque collection of 814 controls and 823 cases. Validation of the six most strongly associated SNPs was performed in an independent collection of 2265 MS patients and 2600 healthy controls. We identified association of haplotypes composed of two non-synonymous SNPs [rs11230563 (R225W) and rs2074225 (A257V)] in the 2nd SRCR domain with susceptibility to MS (Pmax(T) permutation=161024). The effect of these haplotypes on CD6 surface expression and cytokine secretion was also tested. The analysis showed significantly different CD6 expression patterns in the distinct cell subsets, i.e. ��� CD4+ na����ve cells, P = 0.0001; CD8+ na����ve cells, P,0.0001; CD4+ and CD8+ central memory cells, P = 0.01 and 0.05, respectively; and natural killer T (NKT) cells, P = 0.02; with the protective haplotype (RA) showing higher expression of CD6. However, no significant changes were observed in natural killer (NK) cells, effector memory and terminally differentiated effector memory T cells. Our findings reveal that this new MS-associated CD6 risk haplotype significantly modifies expression of CD6 on CD4+ and CD8+ T cells.

Three-dimensional growth as multicellular spheroid activates the proangiogenic phenotype of colorectal carcinoma cells via LFA-1-dependent VEGF: implications on hepatic micrometastasis

Background: The recruitment of vascular stromal and endothelial cells is an early event occurring during cancer cell growth at premetastatic niches, but how the microenvironment created by the initial three-dimensional (3D) growth of cancer cells affects their angiogenesis-stimulating potential is unclear. Methods: The proangiogenic profile of CT26 murine colorectal carcinoma cells was studied in seven-day cultured 3D-spheroids of <300 mu m in diameter, produced by the hanging-drop method to mimic the microenvironment of avascular micrometastases prior to hypoxia occurrence. Results: Spheroid-derived CT26 cells increased vascular endothelial growth factor (VEGF) secretion by 70%, which in turn increased the in vitro migration of primary cultured hepatic sinusoidal endothelium (HSE) cells by 2-fold. More importantly, spheroid-derived CT26 cells increased lymphocyte function associated antigen (LFA)-1-expressing cell fraction by 3-fold; and soluble intercellular adhesion molecule (ICAM)-1, given to spheroid-cultured CT26 cells, further increased VEGF secretion by 90%, via cyclooxygenase (COX)-2-dependent mechanism. Consistent with these findings, CT26 cancer cells significantly increased LFA-1 expression in non-hypoxic avascular micrometastases at their earliest inception within hepatic lobules in vivo; and angiogenesis also markedly increased in both subcutaneous tumors and hepatic metastases produced by spheroid-derived CT26 cells. Conclusion: 3D-growth per se enriched the proangiogenic phenotype of cancer cells growing as multicellular spheroids or as subclinical hepatic micrometastases. The contribution of integrin LFA-1 to VEGF secretion via COX-2 was a micro environmental-related mechanism leading to the pro-angiogenic activation of soluble ICAM-1-activated colorectal carcinoma cells. This mechanism may represent a new target for specific therapeutic strategies designed to block colorectal cancer cell growth at a subclinical micrometastatic stage within the liver.

Molecular mechanisms of interleukin-2 gene inducibility: developmental control and combinatorial action of transcription factors

Interleukin-2 is one of the lymphokines secreted by T helper type 1 cells upon activation mediated by T-cell receptor (TCR) and accessory molecules. The ability to express IL-2 is correlated with T-lineage commitment and is regulated during T cell development and differentiation. Understanding the molecular mechanism of how IL-2 gene inducibility is controlled at each transition and each differentiation process of T-cell development is to understand one aspect of T-cell development. In the present study, we first attempted to elucidate the molecular basis for the developmental changes of IL-2 gene inducibility. We showed that IL-2 gene inducibility is acquired early in immature CD4- CD8-TCR- thymocytes prior to TCR gene rearrangement. Similar to mature T cells, a complete set of transcription factors can be induced at this early stage to activate IL-2 gene expression. The progression of these cells to cortical CD4^+CD8^+TCR^(1o) cells is accompanied by the loss of IL-2 gene inducibility. We demonstrated that DNA binding activities of two transcription factors AP-1 and NF-AT are reduced in cells at this stage. Further, the loss of factor binding, especially AP-1, is attributable to the reduced ability to activate expression of three potential components of AP-1 and NF-AT, including c-Fos, FosB, and Fra-2. We next examined the interaction of transcription factors and the IL-2 promoter in vivo by using the EL4 T cell line and two non-T cell lines. We showed an all-or-none phenomenon regarding the factor-DNA interaction, i.e., in activated T cells, the IL-2 promoter is occupied by sequence-specific transcription factors when all the transcription factors are available; in resting T cells or non-T cells, no specific protein-DNA interaction is observed when only a subset of factors are present in the nuclei. Purposefully reducing a particular set of factor binding activities in stimulated T cells using pharmacological agents cyclosporin A or forskolin also abolished all interactions. The results suggest that a combinatorial and coordinated protein-DNA interaction is required for IL-2 gene activation. The thymocyte experiments clearly illustrated that multiple transcription factors are regulated during intrathymic T-cell development, and this regulation in tum controls the inducibility of the lineage-specific IL-2 gene. The in vivo study of protein-DNA interaction stressed the combinatorial action of transcription factors to stably occupy the IL-2 promoter and to initiate its transcription, and provided a molecular mechanism for changes in IL-2 gene inducibility in T cells undergoing integration of multiple environmental signals.

Biophysics of V(D)J recombination and Genome Packaging: In singulo studies on RAG, HMGB1, and TFAM

The recombination-activating gene products, RAG1 and RAG2, initiate V(D)J recombination during lymphocyte development by cleaving DNA adjacent to conserved recombination signal sequences (RSSs). The reaction involves DNA binding, synapsis, and cleavage at two RSSs located on the same DNA molecule and results in the assembly of antigen receptor genes. Since their discovery full-length, RAG1 and RAG2 have been difficult to purify, and core derivatives are shown to be most active when purified from adherent 293-T cells. However, the protein yield from adherent 293-T cells is limited. Here we develop a human suspension cell purification and change the expression vector to boost RAG production 6-fold. We use these purified RAG proteins to investigate V(D)J recombination on a mechanistic single molecule level. As a result, we are able to measure the binding statistics (dwell times and binding energies) of the initial RAG binding events with or without its co-factor high mobility group box protein 1 (HMGB1), and to characterize synapse formation at the single-molecule level yielding insights into the distribution of dwell times in the paired complex and the propensity for cleavage upon forming the synapse. We then go on to investigate HMGB1 further by measuring it compact single DNA molecules. We observed concentration dependent DNA compaction, differential DNA compaction depending on the divalent cation type, and found that at a particular HMGB1 concentration the percentage of DNA compacted is conserved across DNA lengths. Lastly, we investigate another HMGB protein called TFAM, which is essential for packaging the mitochondrial genome. We present crystal structures of TFAM bound to the heavy strand promoter 1 (HSP1) and to nonspecific DNA. We show TFAM dimerization is dispensable for DNA bending and transcriptional activation, but is required for mtDNA compaction. We propose that TFAM dimerization enhances mtDNA compaction by promoting looping of mtDNA.

Efeitos cardiovasculares da transfer��ncia adotiva de linf��citos T reguladores em camundongos submetidos �� infus��o cr��nica de angiotensina II e de aldosterona

A angiotensina (Ang) II e aldosterona induzem hipertens��o arterial por mecanismos em parte mediados pela imunidade adaptativa, envolvendo linf��citos T auxiliares respondedores (Tresp). Os linf��citos T reguladores (Treg) s��o capazes de suprimir os efeitos pr��inflamat��rios do sistema imune. O presente estudo avaliou se a transfer��ncia adotiva de Treg �� capaz de prevenir a hipertens��o e a les��o vascular induzidas pela Ang II ou pela aldosterona, em dois protocolos distintos. No protocolo com Ang II, camundongos machos C57BL/6 sofreram a inje����o endovenosa de Treg ou Tresp, sendo depois infundidos com Ang II (1&#956;g/kg/min), ou salina (grupo controle) por 14 dias. No protocolo com aldosterona, um outro conjunto de animais sofreu inje����es de Treg ou Tresp, sendo depois infundido com aldosterona (600&#956;g/kg/d) ou salina (grupo controle), pelo mesmo intervalo de tempo. O grupo tratado com aldosterona recebeu salina 1% na ��gua. Tanto o grupo Ang II como aldosterona apresentaram eleva����o da press��o arterial sist��lica (43% e 31% respectivamente), da atividade da NADPH oxidase na aorta (1,5 e 1,9 vezes, respectivamente) e no cora����o (1,8 e 2,4 vezes, respectivamente) e uma redu����o da resposta vasodilatadora �� acetilcolina (de 70% e 56%, respectivamente), quando comparados com os respectivos controles (P<0,05). Adicionalmente, a administra����o de Ang II proporcionou um aumento rigidez vascular (P<0,001), na express��o de VCAM-1 nas art��rias mesent��ricas (P<0,05), na infiltra����o a��rtica de macr��fagos e linf��citos T (P<0,001) e nos n��veis plasm��ticos das citocinas inflamat��rias interferon (INF)-&#947;, interleucina (IL)-6, Tumor necrosis factor (TNF)-&#945; e IL-10 (P<0,05). Ang II causou uma queda de 43% no n��mero de c��lulas Foxp3+ no c��rtex renal, enquanto que a transfer��ncia adotiva de Treg aumentou as c��lulas Foxp3+ em duas vezes em compara����o com o controle. A administra����o de Treg preveniu o remodelamento vascular induzido pela aldosterona, observado na rela����o m��dia/l��men e na ��rea transversal da m��dia das art��rias mesent��ricas (P<0,05). Todos os par��metros acima foram prevenidos com a administra����o de Treg, mas n��o de Tresp. Estes resultados demonstram que Treg s��o capazes de impedir a les��o vascular e a hipertens��o mediadas por Ang II ou por aldosterona, em parte atrav��s de a����es antiinflamat��rias. Em conclus��o, uma abordagem imuno-modulat��ria pode prevenir o aumento da press��o arterial, o estresse oxidativo vascular, a inflama����o e a disfun����o endotelial induzidos por Ang II ou aldosterona.

Efeito da restri����o prot��ica materna durante a lacta����o sobre a resposta de tim��citos da prole jovem de ratos Wistar

Neste estudo investigamos as consequ��ncias da restri����o prot��ica materna durante a lacta����o sobre a resposta de tim��citos da prole jovem de ratos Wistar (grupo D), identificando o papel da leptina nas altera����es encontradas. Observamos que, quando comparados ao grupo controle, os animais do grupo D apresentaram, aos 30 dias de vida, uma diminui����o significativa tanto do peso corporal quanto do timo. Contudo, n��o observamos altera����es no n��mero de tim��citos, no perfil de c��lulas CD4/CD8 ou na resposta proliferativa destas c��lulas. Sistemicamente, o grupo D n��o apresentou altera����es nos n��veis s��ricos de corticosterona ou no conte��do nuclear do seu receptor (GR) em tim��citos. Apesar dos animais D n��o apresentarem altera����es nos n��veis circulantes de leptina, a express��o do seu receptor, ObRb, estava aumentada nos tim��citos. Esta altera����o foi acompanhada pela amplifica����o da resposta de sinaliza����o da leptina nestas c��lulas, observada por um aumento na ativa����o de JAK2 e STAT3 ap��s a incuba����o com leptina. Os tim��citos isolados do grupo D apresentaram uma diminui����o significativa na taxa de apoptose espont��nea quando comparados ao grupo controle. Corroborando estes resultados, demonstramos que os tim��citos dos animais D apresentam um aumento na express��o da prote��na antiapopt��tica Bcl-2 e uma redu����o da express��o da prote��na pr��apopt��tica Bax, al��m de um maior conte��do de Pr��-caspase-3, entretanto, n��o encontramos altera����es no conte��do de Bad. Al��m disso, tim��citos do grupo D apresentaram um maior conte��do da subunidade p65 do NF&#312;B no n��cleo, associado a uma menor express��o de I&#312;B&#945; no citoplasma. Finalmente, observamos um aumento na express��o do RNAm para o gene ob (leptina) mas n��o para o gene db (receptor) no microambiente t��mico dos animais D. Em conjunto, nossos dados mostram que a restri����o prot��ica durante a lacta����o afeta a homeostase t��mica, induzindo uma maior atividade de leptina, que protege os tim��citos da apoptose na prole jovem, sugerindo que esses animais poderiam ser mais suscet��veis a altera����es na resposta imune na vida aduta.

Avalia����o da resposta imune a Staphylococcus aureus, Escherichia coli e Candida albicans em pacientes com neuromielite ��ptica e sua correla����o com o grau de incapacidade neurol��gica

A Neuromielite ��ptica (NMO), anteriormente considerada como um subtipo de Esclerose M��ltipla, �� uma doen��a autoimune, inflamat��ria do sistema nervoso central, na qual o sistema imune ataca a mielina dos neur��nios localizados nos nervos ��pticos e medula espinhal, produzindo, ent��o, mielite e neurite ��ptica simult��nea ou sequenciais. A patog��nese da neuromielite ��ptica �� influenciada pela combina����o de fatores gen��ticos e ambientais, incluindo agentes infecciosos. Diferentes doen��as infecciosas podem tanto desencadear como exacerbar a autoimunidade. Portanto, o objetivo do presente estudo foi de analisar a responsividade imune in vitro a Escherichia coli, Staphylococcus aureus e Candida albicans em pacientes com NMO recorrente-remitente, e a correlacionar ao n��vel de incapacidade neurol��gica. Nesse contexto, a extens��o da linfoprolifera����o e perfil de citocinas em resposta a S. aureus e C. albicans, em culturas de c��lulas mononucleares do sangue perif��rico (CMSP) foram similares entre pacientes com NMO e indiv��duos saud��veis. Entretanto, maior prolifera����o de c��lulas T associada �� elevada libera����o de IL-1&#946;, IL-6 e IL-17 foi observada em culturas de c��lulas derivadas de pacientes com NMO quando estimuladas com E. coli. Ademais, nessas culturas, a produ����o de IL-10 foi significativamente menor quando comparada ao grupo controle. Ensaios conduzidos em culturas de CMSP depletadas de diferentes subtipos de linf��citos demonstraram que, enquanto c��lulas T CD4+ e T CD8+ produzem IL-6 em resposta a E. coli, a produ����o de IL-17 foi praticamente restrita ��s c��lulas T CD4+. Os n��veis de IL-6 e IL-17 in vitro induzidos por E. coli foram correlacionados positivamente ��s incapacidades neurol��gicas. Essa maior tend��ncia a produzir citocinas relacionadas ao perfil Th17 foi diretamente associada aos n��veis de IL-23 produzidos por mon��citos ativados com LPS. De modo interessante, n��veis elevados de LPS foram quantificados no plasma de pacientes com NMO e estes foram correlacionados aos n��veis plasm��ticos de IL-6. Em conclus��o, nossos resultados sugerem que uma maior responsividade a E. coli poderia estar envolvida na patog��nese da NMO. Esse tipo de investiga����o �� muito importante pois inibidores da liga����o ou sinaliza����o do TLR poderiam ser considerados terapias com grande potencial como adjuvantes no tratamento de pacientes com NMO.

Exploring Genetic Factors Involved in Huntington Disease Age of Onset: E2F2 as a New Potential Modifier Gene

Age of onset (AO) of Huntington disease (HD) is mainly determined by the length of the CAG repeat expansion (CAGexp) in exon 1 of the HTT gene. Additional genetic variation has been suggested to contribute to AO, although the mechanism by which it could affect AO is presently unknown. The aim of this study is to explore the contribution of candidate genetic factors to HD AO in order to gain insight into the pathogenic mechanisms underlying this disorder. For that purpose, two AO definitions were used: the earliest age with unequivocal signs of HD (earliest AO or eAO), and the first motor symptoms age (motor AO or mAO). Multiple linear regression analyses were performed between genetic variation within 20 candidate genes and eAO or mAO, using DNA and clinical information of 253 HD patients from REGISTRY project. Gene expression analyses were carried out by RT-qPCR with an independent sample of 35 HD patients from Basque Country Hospitals. We found suggestive association signals between HD eAO and/or mAO and genetic variation within the E2F2, ATF7IP, GRIN2A, GRIN2B, LINC01559, HIP1 and GRIK2 genes. Among them, the most significant was the association between eAO and rs2742976, mapping to the promoter region of E2F2 transcription factor. Furthermore, rs2742976 T allele patient carriers exhibited significantly lower lymphocyte E2F2 gene expression, suggesting a possible implication of E2F2-dependent transcriptional activity in HD pathogenesis. Thus, E2F2 emerges as a new potential HD AO modifier factor.

Avalia����o da resposta imunol��gica ap��s vacina����o ou infec����o por Neisseria meningitidis

A doen��a meningoc��cica (DM) ��, ainda hoje, um s��rio problema de sa��de p��blica, estando associada a elevadas taxas de morbidade e letalidade no mundo. A DM evoca prote����o imunol��gica persistente contra a doen��a em pessoas com sistema imunol��gico normal. Em contraste, a prote����o induzida por vacinas meningoc��cicas sempre requer a administra����o de doses refor��o (booster) da vacina. No Brasil, Neisseria meningitidis dos sorogrupos C (MenC) e B (MenB) s��o as principais causas de DM durante os ��ltimos anos. Atualmente, n��o existe uma vacina universal contra o meningococo B (MenB). A infec����o pelo v��rus da imunodefici��ncia humana (HIV) tem sido apontada como um fator de risco para a mortalidade da DM. Um dos pilares do tratamento do HIV �� a utiliza����o de vacinas para doen��as imuno-preven��veis. A vacina conjugada anti-MenC �� frequentemente recomendada para crian��as e adolescentes infectados pelo HIV no Brasil e em muitos outros pa��ses. Poucos estudos t��m abordado os mecanismos pelos quais as vacinas meningoc��cicas geram e sustentam a mem��ria imunol��gica. Os objetivos deste estudo foram: 1) avaliar a resposta de anticorpos bactericidas e de linf��cito T (LT) CD4 de mem��ria contra o meningococo ap��s a infec����o; 2) avaliar a resposta de anticorpos bactericidas e de LT CD4 de mem��ria e linf��cito B de mem��ria (LBm) contra o meningococo ap��s o booster da vacina cubana VA-MENGOC-BC em volunt��rios imunizados h�� aproximadamente 17 anos; 3) investigar a resposta de anticorpos funcionais (bactericidas e opsonizantes) ap��s imuniza����o com a vacina conjugada anti-MenC (CRM197) em indiv��duos infectados pelo v��rus HIV. Ap��s a infec����o, 83% dos pacientes diagnosticados como tendo DM pelo teste de l��tex e/ou cultura tiveram t��tulos de anticorpos bactericidas protetores, mas n��o houve uma associa����o entre os t��tulos de anticorpos bactericidas e a concentra����o de imunoglobulina total espec��fica. Houve aumento na frequ��ncia de linf��citos T de mem��ria central (TCM) (mediana de 15%) ativados, principalmente ap��s est��mulo com a cepa MenC. Nos volunt��rios pr��-vacinados, 3 de 5 indiv��duos soroconverteram 7 ou 14 dias ap��s a administra����o da dose booster. Houve um aumento importante da popula����o TCM 14 dias ap��s o booster, mas sem ativa����o celular diferenciada dos grupos controles. Observamos resposta positiva de LBm na maioria dos volunt��rios, mas sem correla����o com os anticorpos bactericidas. Em rela����o aos pacientes HIV positivos, os resultados mostraram a necessidade de uma segunda dose da vacina, j�� que apenas 15% soroconverteram a uma ��nica dose e a segunda dose resultou em soroconvers��o de cerca de 55% dos indiv��duos. Observamos correla����o positiva (r= 0,43) e significativa (P= 0,0007) entre os anticorpos opsonizantes e bactericidas ap��s a vacina����o. N��o observamos diferen��as significativas quando relacionamos os t��tulos de anticorpos bactericidas com o n��mero absoluto de LT CD4 P= 0,051) e LT CD4 nadir (P= 0,09) entre os pacientes que soroconverteram (n= 43) ou n��o soroconverteram (n= 106) ap��s a primeira dose. Desta forma, os resultados desta tese indicaram que: 1) os pacientes convalescentes da DM adquirem anticorpos bactericidas ap��s infec����o por N. meningitidis; 2) nos volunt��rios vacinados, a dose booster da vacina anti-MenB n��o foi plenamente eficaz em ativar a mem��ria imunol��gica atrav��s da produ����o de anticorpos bactericidas ou ativa����o de LTm; 3) os pacientes HIV positivos necessitam de uma dose booster da vacina conjugada anti-MenC.

Hansen��ase neural, aspectos diagn��sticos da forma neural pura e mecanismos imunopatog��nicos da les��o do nervo na doen��a. Participa����o de quimiocinas CCL2 e CXCL10 e metaloproteinases 2 e 9

O diagn��stico da hansen��ase neural pura baseia-se em dados cl��nicos e laboratoriais do paciente, incluindo a histopatologia de esp��cimes de bi��psia de nervo e detec����o de DNA de Mycobacterium leprae (M. leprae) pelo PCR. Como o exame histopatol��gico e a t��cnica PCR podem n��o ser suficientes para confirmar o diagn��stico, a imunomarca����o de lipoarabinomanana (LAM) e/ou Glicolip��dio fen��lico 1 (PGL1) - componentes de parede celular de M. leprae foi utilizada na primeira etapa deste estudo, na tentativa de detectar qualquer presen��a vestigial do M. leprae em amostras de nervo sem bacilos. Al��m disso, sabe-se que a les��o do nervo na hansen��ase pode diretamente ser induzida pelo M. leprae nos est��gios iniciais da infec����o, no entanto, os mecanismos imunomediados adicionam severidade ao comprometimento da fun����o neural em per��odos sintom��ticos da doen��a. Este estudo investigou tamb��m a express��o imuno-histoqu��mica de marcadores envolvidos nos mecanismos de patogenicidade do dano ao nervo na hansen��ase. Os imunomarcadores selecionados foram: quimiocinas CXCL10, CCL2, CD3, CD4, CD8, CD45RA, CD45RO, CD68, HLA-DR, e metaloproteinases 2 e 9. O estudo foi desenvolvido em esp��cimes de bi��psias congeladas de nervo coletados de pacientes com HNP (n=23 / 6 BAAR+ e 17 BAAR - PCR +) e pacientes diagnosticados com outras neuropatias (n=5) utilizados como controle. Todas as amostras foram criosseccionadas e submetidas �� imunoperoxidase. Os resultados iniciais demonstraram que as 6 amostras de nervos BAAR+ s��o LAM+/PGL1+. J�� entre as 17 amostras de nervos BAAR-, 8 s��o LAM+ e/ou PGL1+. Nas 17 amostras de nervos BAAR-PCR+, apenas 7 tiveram resultados LAM+ e/ou PGL1+. A detec����o de imunorreatividade para LAM e PGL1 nas amostras de nervo do grupo HNP contribuiu para a maior efici��ncia diagn��stica na aus��ncia recursos a diagn��sticos moleculares. Os resultados da segunda parte deste estudo mostraram que foram encontradas imunoreatividade para CXCL10, CCL2, MMP2 e MMP9 nos nervos da hansen��ase, mas n��o em amostras de nervos com outras neuropatias. Al��m disso, essa imunomarca����o foi encontrada predominantemente em c��lulas de Schwann e em macr��fagos da popula����o celular inflamat��ria nos nervos HNP. Os outros marcadores de ativa����o imunol��gica foram encontrados em leuc��citos (linf��citos T e macr��fagos) do infiltrado inflamat��rio encontrados nos nervos. A express��o de todos os marcadores, exceto CXCL10, apresentou associa����o com a fibrose, no entanto, apenas a CCL2, independentemente dos outros imunomarcadores, estava associada a esse excessivo dep��sito de matriz extracelular. Nenhuma diferen��a na frequ��ncia da imunomarca����o foi detectada entre os subgrupos BAAR+ e BAAR-, exce����o feita apenas ��s c��lulas CD68+ e HLA-DR+, que apresentaram discreta diferen��a entre os grupos BAAR + e BAAR- com granuloma epitelioide. A express��o de MMP9 associada com fibrose �� consistente com os resultados anteriores do grupo de pesquisa. Estes resultados indicam que as quimiocinas CCL2 e CXCL10 n��o s��o determinantes para o estabelecimento das les��es com ou sem bacilos nos em nervo em est��gios avan��ados da doen��a, entretanto, a CCL2 est�� associada com o recrutamento de macr��fagos e com o desenvolvimento da fibrose do nervo na les��o neural da hansen��ase.

Influ��ncia das altera����es imunes em gestantes infectadas pelo HIV-1 no perfil funcional das c��lulas T de neonatos n��o infectados

O n��mero de mulheres jovens infectadas pelo HIV-1 vem crescendo desde o in��cio da epidemia da aids, principalmente nos pa��ses em desenvolvimento, onde a frequ��ncia de gravidez �� elevada. O desenvolvimento de estrat��gias para evitar a transmiss��o vertical tem aumentado o n��mero de rec��m-nascidos n��o infectados nascidos de gestantes portadora do v��rus. O objetivo da presente tese foi avaliar, in vivo e in vitro, o perfil de citocinas de neonatos n��o infectados, por��m nascidos de mulheres infectadas pelo HIV-1. Os resultados demonstraram elevados n��veis de citocinas pr��-inflamat��rias relacionadas ao fen��tipo Th17, associadas �� baixa produ����o de IL-10, tanto nos plasmas quanto nos sobrenadantes das culturas de c��lulas T ativadas obtidas do sangue do cord��o umbilical de neonatos nascidos de gestantes infectadas pelo HIV-1 com cargas virais plasm��ticas(PVL) detect��veis. De modo interessante, um perfil similar pr��-inflamat��rio foi observado em amostras de sangue perif��rico de suas respectivas m��es. Por outro lado, n��veis elevados de IL-10, associados �� reduzida produ����o de citocinas inflamat��rias, foram dosados no sangue e nos sobrenadantes das culturas de c��lulas T ativadas de gestantes que controlavam a PVL, assim como de seus neonatos. Com rela����o �� caracteriza����o fenot��pica das c��lulas T maternas produtoras de IL-10, a an��lise por citometria de fluxo demonstrou que essa citocina �� majoritariamente produzida por c��lulas T CD4+Foxp3-. Curiosamente, a replica����o viral in vitro do HIV-1 foi inferior nas culturas das gestantes infectadas pelo HIV-1 e foi relacionada aos efeitos inibit��rios da IL-10 sobre a produ����o de TNF-&#945;. Por fim, os neonatos n��o infectados expostosin utero �� terapia antirretroviral (ART) apresentaram um menor peso ao nascer, e este achado foi inversamente correlacionado com os n��veis perif��ricos maternos de TNF-&#945;. Em conclus��o, nossos achados sugerem que gestantes que conseguem controlar a PVL, e o incremento na produ����o de IL-10 materna possam favorecer a expans��o das c��lulas Tr-1, as quais podem auxiliar em reduzir o risco de transmiss��o vertical do HIV-1 por reduzir a taxa de replica����o viral. Por outro lado, outros resultados tamb��m apresentados aqui, apesar de preliminares, revelaram efeitos adversos da replica����o viral e da ART em gestantes infectadas pelo HIV-1 no desenvolvimento funcional das c��lulas T de neonatos n��o infectados. Esses dados podem ajudar a explicar por que algumas dessas crian��as apresentam elevado risco �� morbidade e mortalidade devido a um estado basal de hipersensibilidade patol��gica.

Estudo do potencial anti-inflamat��rio e antiartr��tico de Pterodon polygalaeflorus e dos seus mecanismos de a����o

O g��nero Pterodon pertence �� fam��lia das Fabaceae e inclui quatro esp��cies nativas do Brasil: P. emarginatus Vog., P. apparicioi Pedersoli, P. abruptus Benth. e a esp��cie objeto deste estudo P. polygalaeflorus Benth.. Seus frutos s��o utilizados pela medicina popular devido ��s propriedades antirreum��tica, analg��sica, anti-inflamat��ria, dentre outros. O objetivo deste trabalho foi avaliar a esp��cie Pterodon polygalaeflorus quanto ao seu potencial anti-inflamat��rio, antiartr��tico e toxicol��gico, atrav��s da an��lise de seus efeitos em modelos in vitro e in vivo. Os extratos EEPpg, EHPpg e EDPpg reduziram (p<0,01) a produ����o in vitro de NO, por macr��fagos ativados por LPS, com baixa citotoxicidade e diminu��ram a celularidade (p<0,05) no exsudato inflamat��rio no modelo de inflama����o in vivo conhecido como air pouch. O extrato mais ativo (EHPpg) foi selecionado e submetido a fracionamento em coluna de s��lica gel 60 gerando quatro fra����es. Todas as fra����es (Fr I-Fr IV) reduziram: a produ����o de NO (p<0,001) por macr��fagos ativados, com baixa ou nenhuma citotoxicidade; a migra����o de macr��fagos in vitro (p<0,01, ensaio de wound healing) e in vivo (p<0,05, peritonite induzida por tioglicolato); e a prolifera����o de esplen��citos estimulados com Con A (p<0,001). As fra����es III e IV, mais ativas nos ensaios anteriores, mostraram a����o antiartr��tica (com 0,02 mg/kg), utilizando o modelo in vivo de artrite induzida por adjuvante completo de Freund (AIA), demonstrada por redu����o: do ��ndice de edema de pata em 23,7% (Fr III) e 43,95% (Fr IV); das les��es histopatol��gicas na regi��o t��bio-tarsal t��picas de articula����es com AIA (p< 0,05); do peso e celularidade do linfonodo e do ba��o, mas n��o da celularidade da medula ��ssea; das subpopula����es de linf��citos (CD4+, CD8+ e CD19+) nos linfonodos inguinais, por��m com significativo aumento das subpopula����es ativadas CD4+CD69+, redu����o da CD8+CD69+ e aumento de CD19+CD69+ (apenas na Fr III); e redu����o da popula����o de macr��fagos no ba��o (p<0,001). As fra����es III e IV mostraram a����o imunossupressora em n��vel celular e molecular, reduzindo (p<0,001) os n��veis do mRNA da iNOS, assim como as citocinas IL-1&#946;, TNF-&#945; e IL-10, em n��vel de mRNA e prote��na, em cultura de macr��fagos. A express��o do receptor CD14, em macr��fagos estimulados por LPS (31,74%), foi inibida apenas pela Fr III. A osteoclastog��nese foi inibida pelas fra����es III e IV, sugerindo uma a����o antiartr��tica das fra����es em n��vel de diferencia����o celular para osteoclastos (inibi����o). Este efeito pode resultar da inibi����o da express��o do fator de transcri����o NFATc1, no caso da Fr III. Por fim, as fra����es Fr III e Fr IV n��o apresentaram toxicidade subaguda, potencial mutag��nico (teste de Ames) ou genot��xico (teste do micron��cleo). A aus��ncia de toxicidade in vivo das fra����es ficou demonstrada pela aus��ncia de altera����o no peso corporal e de ��rg��os, nas concentra����es s��ricas de creatinina, ��cido ��rico, triglicer��deos, colesterol, ALT e ALP, ou de CYP1A1 e GSTs no f��gado. An��lises fitoqu��micas (GC-MS e TLC) mostraram uma grande variedade de terpenos nas fra����es III e IV, sendo majorit��rios os furano-diterpenos derivados do vouacapano. O diterpeno isolado, Ppg-01, presente nas fra����es III (5,12%) e IV (18,47%), reduziu a produ����o in vitro de NO e o edema de pata induzido por carragenina (p<0,001). Em conjunto, os dados sugerem que o Ppg-01 esteja contribuindo para as a����es anti-inflamat��rias e imunomoduladoras das fra����es III e IV, e que estas propriedades estejam associadas aos efeitos antiartr��ticos observados.

Modula����o por Sucupira (Pterodon polygalaeflorus, Benth) da distribui����o de Linf��citos T ativados e T de mem��ria em linfonodos (LN) de camundongos com Artrite Induzida por Col��geno tipo II (CIA) e da mielopoiese em ba��os de camundongos primados com Adjuvante Completo de Freund (AFC)

Sementes de ��rvores do g��nero Pterodon, conhecidas principalmente pelo nome Sucupira, s��o utilizadas popularmente para o tratamento de doen��as reum��ticas. Na presente disserta����o, temos como objetivo estudar a poss��vel a����o do extrato hidroalco��lico de sementes de Pterodon polygalaeflorus (EHPp) no tratamento de Artrite Induzida por Col��geno tipo II (CIA) em camundongos DBA/1J. Verificou-se a distribui����o de Linf��citos T CD4+ com fen��tipo de mem��ria em linfonodos de animais com CIA; a poss��vel interfer��ncia do tratamento no segundo aumento de c��lulas miel��ides (Mac-1+) espl��nicas gerado pela segunda inje����o de col��geno tipo II (CII) para indu����o da CIA e confirmou-se o fen��tipo granuloc��tico dessas c��lulas miel��ides. Al��m disso, atrav��s de outro modelo experimental de 10 dias de dura����o, objetivou-se estudar as c��lulas miel��ides Mac-1+: se o tratamento com EHPp interfere na mielopoese espl��nica induzida somente pela inje����o de Adjuvante de Freund Completo (AFC) em camundongos DBA1/J e avaliar uma eventual diferen��a entre o grau de ativa����o dessas c��lulas em animais primados com AFC tratados ou n��o com EHPp. A CIA foi induzida em camundongos DBA/1J machos, por inje����o intrad��rmica (i.d.) de CII em AFC com refor��o intraperitonial de CII tr��s semanas ap��s a primeira inje����o. O tratamento oral, di��rio, com EHPp por cerca de 30 dias foi iniciado no dia do refor��o com CII. No modelo de curta dura����o, com o intuito de verificar o poss��vel aumento de c��lulas Mac-1+ no ba��o, os animais foram tratados oralmente com EHPp, por 9 dias, sendo o AFC injetado, i.d., no 5o dia do tratamento e os animais sacrificados no 10o. Os resultados obtidos foram: o tratamento com EHPp interfere na distribui����o de Linf��citos T com fen��tipo de mem��ria em animais com indu����o de CIA; resultados preliminares sugerem que o tratamento com EHPp n��o interfere no segundo aumento de c��lulas miel��ides no ba��o no modelo CIA; a maioria das c��lulas miel��ides presentes no ba��o de animais sadios ou de animais com CIA apresenta fen��tipo granuloc��tico (GR.1+); o tratamento com EHPp reduz significantemente a mielopoese espl��nica induzida pela inje����o de AFC; a fra����o significante de c��lulas Mac-1+ no ba��o de animais primados com AFC apresenta aumento de produ����o de Esp��cies Reativas de Oxig��nio em rela����o aos animais sadios ou tratados com EHPp. Em conjunto, estes resultados permitem identificar uma poss��vel a����o anti-inflamat��ria do EHPp ao impedir o aumento de c��lulas inflamat��rias no ba��o de animais primados com AFC, bem como uma atividade imunossupressora, evidenciada pela redu����o de Linf��citos com perfil de rec��m ativa����o e de Linf��citos com perfil de mem��ria nos LNs em rela����o aos animais com CIA, sugerindo o seu envolvimento nos processos de ativa����o e de migra����o linfocit��rios.