Untersuchungen zum Vorkommen und molekularen Mechanismus der Biofilm-Bildung bei Enterokokken aus verschiedenen klinischen Bereichen

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde eine größere Anzahl an E. faecalis Isolaten aus Vaginalabstrichen, erstmals insbesondere von Patientinnen, die an Bakterieller Vaginose litten, untersucht und mit E. faecalis Stämme aus verschiedenen anderen klinischen Bereichen auf das Vorkommen von Virulenzfaktoren verglichen. Weiterhin wurden Korrelationen zwischen bestimmten Faktoren und der Menge an produziertem Biofilm erstellt, um mögliche Zusammenhänge zum Mechanismus der Biofilm-Bildung zu erfassen. Mittels statistischer Analysen konnte hinsichtlich der 150 untersuchten E. faecalis Isolate nachgewiesen werden, dass keine signifikanten Unterschiede der Inzidenzen von Virulenzfaktoren (esp, asa1, gelE, GelE, cylA, β-Hämolyse) zwischen den Stämmen der verschiedenen Herkunftsbereiche bestanden. In Bezug auf das Auftreten von Biofilm-Bildung zeigte sich ein erhöhtes Vorkommen bei Stämmen aus Urin sowie invasiver Herkunft (insgesamt jeweils ca. 70 % mäßige und starke Biofilm-Bildner) im Vergleich zu E. faecalis Isolaten aus Wunden oder Faeces (je ca. 40 %). Statistische Auswertungen bzgl. des Zusammenhangs eines oder einer Kombination von Virulenzfaktoren mit der Menge an gebildetem Biofilm wiesen darauf hin, dass Isolate, die das esp Gen besaßen, in erhöhtem Maße zur Biofilm-Bildung befähigt waren. Dies zeigte einen gewissen Einfluss des Zellwandproteins auf die Fähigkeit zur Biofilm-Bildung bei E. faecalis. Allerdings wurden stets auch Stämme identifiziert, die die Fähigkeit zur Biofilm-Bildung trotz des Fehlens der jeweils untersuchten genetischen Determinante bzw. der Determinanten aufwiesen, so dass auf das Vorhandensein weiterer, unbekannter Einflussfaktoren auf den Mechanismus der Biofilm-Bildung bei E. faecalis geschlossen werden konnte. Unter 78 untersuchten E. faecium Isolaten aus verschiedenen klinischen Bereichen konnte lediglich ein Stamm (1,3 %) als mäßiger Biofilm-Bildner charakterisiert werden, so dass die Fähigkeit bei dieser Spezies in der hier untersuchten Region unter diesen Bedingungen kaum nachgewiesen werden konnte. Einen Schwerpunkt dieser Arbeit bildete die Untersuchung zum Vorkommen von Virulenzfaktoren und Biofilm-Bildung bei E. faecalis Isolaten aus Vaginalabstrichen. Bzgl. des Auftretens von Virulenzfaktoren und Biofilm-Produktion konnte kein Unterschied zwischen Stämmen assoziiert mit Bakterieller Vaginose und Isolaten einer Vergleichsgruppe festgestellt werden. Allerdings zeigte eine Gegenüberstellung mit den untersuchten E. faecalis Stämmen aus anderen klinischen Bereichen, dass die 80 Isolate aus Vaginalabstrichen eine ähnlich hohe Inzidenz bestimmter Virulenzfaktoren wie Stämme aus Faeces, Urin, Wunden oder invasiver Herkunft sowie eine mit den Isolaten aus Urin und invasiver Herkunft vergleichbar hohe Fähigkeit zur Biofilm-Bildung aufwiesen (ca. 75 % mäßige und starke Biofilm-Bildner). Dies deutete auf eine Verbreitung der Biofilm-Bildungsfähigkeit bei E. faecalis Stämmen der Vaginalflora und somit auf eine große Bedeutung der Eigenschaft für Isolate dieser Herkunft hin. Die statistische Auswertung der Korrelationen von Virulenzfaktoren mit der Menge an gebildetem Biofilm lieferte ähnliche Ergebnisse wie die Analysen bzgl. der 150 E. faecalis Isolate aus anderen klinischen Bereichen und untermauerte die Annahme, dass zusätzliche Faktoren zu den hier untersuchten Determinanten bei E. faecalis vorhanden sein müssen, die Einfluss auf den Mechanismus der Biofilm-Bildung nehmen. Deshalb konzentrierte sich ein weiterer Teil der vorliegenden Arbeit auf die Herstellung und Charakterisierung von E. faecalis Biofilm-Spontanmutanten, um bisher noch ungeklärte Mechanismen oder neue Faktoren zu erkennen, die Einfluss auf die Biofilm-Bildung bei E. faecalis nehmen. Die Untersuchung einer Mutante (1.10.16) und ihres Wildtypstamms lieferte erstmals den phänotypischen Nachweis des HMW-Komplexes der drei Bee-Proteine sowie die Identifizierung konservierter Pili-Motive dieser Proteine. Des Weiteren schien die in diesem Cluster ebenfalls codierte Sortase-1 dasjenige Enzym zu sein, das höchstwahrscheinlich die Bindung des Proteins Bee-2 innerhalb dieses HMW-Komplexes katalysiert. Insofern lieferten diese Untersuchungen neue, konkrete Hinweise zur Rolle des bee Genclusters bei der Pili-Biogenese und Biofilm-Bildung von E. faecalis. Darüber hinaus stellen Erkenntnisse aus der Charakterisierung von zwei weiteren hergestellten Biofilm-Spontanmutanten viel versprechende Ausgangspunkte für zukünftige Untersuchungen dar, die ein weitergehendes Verständnis der molekularen Mechanismen der Biofilm-Bildung bei E. faecalis erzielen könnten.

Protokoll der Gewässerschau in Kassel am 19. April 2005

Bei der Begehung von Olebach, Losse und Alte Losse wurden der ökomorphologische Zustand von Sohle, Böschung, Linienführung, Verzahnung von Wasser und Land und der Ufergehölze sowie die Landnutzung notiert. Einleitungen von Abwässern und die Ablagerung von Abfällen auf Böschung und Ufer wurde protokolliert. Wassertemperatur und elektrische Leitfähigkeit wurden an mehreren Punkten gemessen. Die Leitfähigkeitswerte werden vor dem Hintergrund der Geologie der Einzugsgebiete interpretiert und zur chemischen Indikation von diffusen und punktförmigen Einleitungen genutzt. Es werden Maßnahmen zur Renaturierung, Maßnahmen gegen die Ablagerung von Gartenabfällen auf Ufer und Böschung, Maßnahmen gegen die ackerbauliche Nutzung und Bebauung im Gewässerrandstreifen vorgeschlagen.

Protokoll der Gewässerschau in Kassel am 20. April 2005

Bei der Begehung von Neuem Wasserfallgraben, Marbachsgraben und Dönchebach wurden der ökomorphologische Zustand von Sohle, Böschung, Linienführung, Verzahnung von Wasser und Land und der Ufergehölze sowie die Landnutzung notiert. Einleitungen von Abwässern und die Ablagerung von Abfällen auf Böschung und Ufer wurden protokolliert. Wassertemperatur und elektrische Leitfähigkeit wurden an mehreren Punkten gemessen. Es werden Maßnahmen zur Renaturierung, Regenwasserbewirtschaftung sowie zur Pflege des Naturschutzgebiets Dönche, Maßnahmen gegen die Ablagerung von Gartenabfällen auf Ufer und Böschung, Maßnahmen gegen die ackerbauliche Nutzung, Viehtritt und die Bebauung im Gewässerrandstreifen vorgeschlagen.

Biochemische und Zellbiologische Charakterisierung der humanen Proteinkinase X

Diese Dissertation befasst sich mit der Charakterisierung der humanen Proteinkinase (PRKX) mittels zellbiologischer (rekombinante Expression in Baculovirus, endogenes Protein, BRET) wie auch biochemischer Elemente (Aktivitaetsassays, Biacore). Dabei wurde die humane PRKX mit den Drosophila- und Maus-Isoformen DC2 und PKARE verglichen, wie auch putative Phosphorylierungsstellen durch andere Kinasen identifiziert, welche einen Einfluss auf Interaktion und Lokalisation des Enzyms haben koennten.

Molekulare Mechanismen der cAMP-vermittelten Signaltransduktion

Zusammenfassung - Der sekundäre Botenstoff zyklisches Adenosinmonophosphat (cAMP) reguliert viele fundamentale zelluläre Prozesse wie Zellproliferation, Differenzierung, Energiemetabolismus und Genexpression. In eukaryotischen Zellen vermittelt die cAMP-abhängige Proteinkinase (PKA) die meisten biologischen Funktionen von cAMP. Die PKA besteht aus jeweils zwei regulatorischen (R) und katalytischen (C) Untereinheiten, die zusammen einen inaktiven Holoenzymkomplex bilden, der durch cAMP aktiviert wird. In dieser Arbeit wurde die Bindung von cAMP und cAMP-Analoga an die R Untereinheit der PKA unter funktionellen und mechanistischen Aspekten untersucht. Eine neue, auf Fluoreszenzpolarisation basierende Methode wurde entwickelt, um die Affinität von cAMP-Analoga in einem homogenen Ansatz schnell, reproduzierbar und nicht radioaktiv zu quantifizieren. Zur detaillierten Untersuchung des Bindungsmechanismus von cAMP und cAMP Analoga (Agonisten und Antagonisten) wurden thermodynamische Studien im direkten Vergleich mittels isothermaler Titrationskalorimetrie und kinetischen Analysen (Oberflächenplasmonresonanz, SPR) durchgeführt, wodurch thermodynamische Signaturen für das Bindungsverhalten der Nukleotide an die R Untereinheit der PKA erhalten werden konnten. Durch Interaktionsstudien an mutagenisierten R Untereinheiten wurde der intramolekulare Aktivierungsmechanismus der PKA in Bezug auf cAMP-Bindung, Holoenzymkomplex-Formierung und -Aktivierung untersucht. Die dabei erhaltenen Ergebnisse wurden mit zwei Modellen der cAMP-induzierten Konformationsänderung verglichen, und ein Aktivierungsmechanismus postuliert, der auf konservierten hydrophoben Aminosäuren basiert. Für in vivo Untersuchungen wurden zusammen mit Kooperationspartnern membranpermeable, fluoreszierende cAMP Analoga entwickelt, die Einblicke in die Dynamik der cAMP-Verteilung in Zellen erlauben. Neu entwickelte, Festphasen gebundene cAMP-Analoga (Agonisten und Antagonisten) wurden in einem (sub)proteomischen Ansatz dazu genutzt, natürliche Komplexe der R Untereinheit und des PKA-Holoenzyms aus Zelllysaten zu isolieren und zu identifizieren. Diese Untersuchungen fließen letztlich in einem systembiologischen Ansatz zusammen, der neue Einblicke in die vielschichtigen cAMP gesteuerten Netzwerke und Regulationsprozesse erlaubt.

Biomolekulare Interaktionsanalyse

Dieser populärwissenschaftliche Übersichtsartikel beschreibt eine Auswahl von Biomolekularen Interaktionsanalysen und ihre Anwendung in der funktionellen Proteomforschung. Die verschiedenen Meßprinzipien sowie die generierten Daten und deren Aussagekraft werden kurz und prägnant vorgestellt.

Biomolecular interaction analysis in functional proteomics

In der funktionellen Proteomforschung werden bekannte Interaktionen eines zellulären Netzwerkes qualitativ untersucht. Diese Veröffentlichung beschreibt verschiedene biomolekulare Interaktionsanalysen, anhand des Modellsystems PKA, die zur detaillierten Charakterisierung von Bindungen herangezogen werden können. Neben den Gleichgewichtsbindungsdaten (generiert aus AlphaScreen, FP, SPR und ITC Messungen) wurden aus ITC Messungen die thermodynamischen Parameter G, H und S ermittelt. Durch Anwendung der BRET2 (Bioluminescence resonance energy transfer) Methode konnten in lebenden Zellen Aussagen über Bindungsereignisse und deren Lokalisation getroffen werden.

Die Masse macht's!

Die biochemische Beschreibung funktioneller Proteininteraktionsnetzwerke hat in den letzten Jahren einen starken Wandel erfahren. Mittels hochauflösender biologischer Massenspektrometrie(MS) ist es möglich Netzwerkkomponenten, wie Proteine schnell und zuverlässig zu identifizieren und auf ihre Modifikationen hin zu untersuchen. Innerhalb des Promotionskollegs (PK) Proteomics der Universität Kassel bietet die MS neue Ansatzpunkte für die Beantwortung molekularbiologischer Fragestellungen und liefert Ergänzungen zu den bislang genutzten klassischen Methoden der Biochemie.

Proteomics Day 2008 in Rotenburg an der Fulda

Dieses Projekt wurde innerhalb des Graduiertenkollegs „Proteomics“ der Universität Kassel gefördert.

Enzymkinetik in der Schule

Urease ist ein Enzym, das Harnstoff spaltet und dessen Reaktionsgeschwindigkeit leicht mittels Leitfähigkeitsmessungen bestimmt werden kann. Dieses Experiment kann, als Schüler- oder Demonstrationsversuch, im Biologie- und Chemieunterricht der Oberstufe von qualitativen Betrachtungen bis hin zur Ermittlung komplexer kinetischer Beschreibungen (Michaelis-Menten-Kinetik) ausgewertet werden.

Die Rolle von Fibronektin in der Leber und im Knochen

In der vorliegenden Arbeit sollten der Einfluss des Fibronektins auf eine Leberfibrose und die Wirkung veränderter Fibronektin-Isoformen auf den Knochen experimentell untersucht werden. Dazu wurden konditionelle Fibronektin Knockout-Mäuse verwendet. Die spezifische Ausschaltung in hepatischen Sternzellen konnte sowohl auf der Ebene der DNA und RNA als auch anhand der gebildeten Proteinmenge bewiesen werden. Fehlendes Fibronektin hatte bereits bei gesunden Mäusen einen leichten Anstieg der Kollagenmenge zur Folge. Durch die Induktion einer Fibrose mit der Chemikalie DMN kam es zu einer auffällig starken Akkumulation von Kollagen in den konditionellen Knockout-Mäusen. Zusätzlich ließ sich eine Häufung des Fibronektins in fibrotischen Bereichen erkennen. Nachfolgend konnte die erhöhte Kollagenmenge auf eine vermehrte Aktivierung der hepatischen Sternzellen zurückgeführt werden, außerdem kam es zu einer erhöhten Proliferation dieser Zellen. In vitro Untersuchungen bestätigten eine Grundaktivierung der konditionellen Knockout-Sternzellen, welche sich durch eine Stimulation mit TGF-β noch erheblich verstärkte. Diese verstärkte Aktivierung ließ sich auf eine erhöhte Menge von TGF-β Rezeptor Typ II auf der Zellmembran zurückführen, was eine zunehmende Aktivierung der Signalmoleküle im Inneren der Sternzellen zur Folge hatte. Dabei konnte anhand von Untersuchungen des Smad4 und der p38 Kinase bewiesen werden, dass beide Wege zu einer verstärkten Kollagen Typ I Expression in den konditionellen Knockout-Sternzellen beitrugen. Letztlich zeigte sich, dass es durch fehlendes Fibronektin zu einer verstärkten Freisetzung von aktivem TGF-β kam, wodurch sich die oben beschriebenen profibrotischen Effekte erklären lassen. Durch eine Leberfibrose kommt es zur Bildung veränderter Fibronektin-Isoformen, welche über den Blutstrom andere Organe erreichen und ihre Funktion beeinflussen könnten. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Differenzierungsfähigkeit kultivierter muriner Osteoblasten durch die Gegenwart des Fibronektins oFN, einer Isoform, die in Patienten mit der Lebererkrankung primäre biliäre Zirrhose erhöht ist, nahezu vollständig inhibiert wurde. Dies wurde anhand der Knotenbildung sowie durch die Prüfung der Differenzierungsmarker Osteokalzin und alkalische Phosphatase belegt. Außerdem konnte eine Rolle der EDA-Domäne des Fibronektins zusätzlich ausgeschlossen werden. Desweiteren führte die Injektion von amniotischem Fibronektin, das oFN enthielt in gesunde Mäuse zu einer erheblichen Beeinträchtigung des Knochens, was an einer Verminderung der Knochendichte erkennbar war. Die histomorphometrische Auswertung der Knochen ergab, dass die Gegenwart von aFN eine starke Reduktion der Knochenneubildung verursachte, die durch eine drastisch verminderte Zahl von Osteoblasten hervorgerufen wurde. Zusammenfassend zeigte sich, dass fehlendes Fibronektin die Entwicklung einer Leberfibrose verstärkt und dass eine Isoform die von der erkrankten Leber vermehrt produziert wird eine schädigende Wirkung auf den Knochen ausübt.

Nuclear organisation and epigenetic regulation of gene expression in Dictyostelium discoideum

A series of vectors for the over-expression of tagged proteins in Dictyostelium were designed, constructed and tested. These vectors allow the addition of an N- or C-terminal tag (GFP, RFP, 3xFLAG, 3xHA, 6xMYC and TAP) with an optimized polylinker sequence and no additional amino acid residues at the N or C terminus. Different selectable markers (Blasticidin and gentamicin) are available as well as an extra chromosomal version; these allow copy number and thus expression level to be controlled, as well as allowing for more options with regard to complementation, co- and super-transformation. Finally, the vectors share standardized cloning sites, allowing a gene of interest to be easily transfered between the different versions of the vectors as experimental requirements evolve. The organisation and dynamics of the Dictyostelium nucleus during the cell cycle was investigated. The centromeric histone H3 (CenH3) variant serves to target the kinetochore to the centromeres and thus ensures correct chromosome segregation during mitosis and meiosis. A number of Dictyostelium histone H3-domain containing proteins as GFP-tagged fusions were expressed and it was found that one of them functions as CenH3 in this species. Like CenH3 from some other species, Dictyostelium CenH3 has an extended N-terminal domain with no similarity to any other known proteins. The targeting domain, comprising α-helix 2 and loop 1 of the histone fold is required for targeting CenH3 to centromeres. Compared to the targeting domain of other known and putative CenH3 species, Dictyostelium CenH3 has a shorter loop 1 region. The localisation of a variety of histone modifications and histone modifying enzymes was examined. Using fluorescence in situ hybridisation (FISH) and CenH3 chromatin-immunoprecipitation (ChIP) it was shown that the six telocentric centromeres contain all of the DIRS-1 and most of the DDT-A and skipper transposons. During interphase the centromeres remain attached to the centrosome resulting in a single CenH3 cluster which also contains the putative histone H3K9 methyltransferase SuvA, H3K9me3 and HP1 (heterochromatin protein 1). Except for the centromere cluster and a number of small foci at the nuclear periphery opposite the centromeres, the rest of the nucleus is largely devoid of transposons and heterochromatin associated histone modifications. At least some of the small foci correspond to the distal telomeres, suggesting that the chromosomes are organised in a Rabl-like manner. It was found that in contrast to metazoans, loading of CenH3 onto Dictyostelium centromeres occurs in late G2 phase. Transformation of Dictyostelium with vectors carrying the G418 resistance cassette typically results in the vector integrating into the genome in one or a few tandem arrays of approximately a hundred copies. In contrast, plasmids containing a Blasticidin resistance cassette integrate as single or a few copies. The behaviour of transgenes in the nucleus was examined by FISH, and it was found that low copy transgenes show apparently random distribution within the nucleus, while transgenes with more than approximately 10 copies cluster at or immediately adjacent to the centromeres in interphase cells regardless of the actual integration site along the chromosome. During mitosis the transgenes show centromere-like behaviour, and ChIP experiments show that transgenes contain the heterochromatin marker H3K9me2 and the centromeric histone variant H3v1. This clustering, and centromere-like behaviour was not observed on extrachromosomal transgenes, nor on a line where the transgene had integrated into the extrachromosomal rDNA palindrome. This suggests that it is the repetitive nature of the transgenes that causes the centromere-like behaviour. A Dictyostelium homolog of DET1, a protein largely restricted to multicellular eukaryotes where it has a role in developmental regulation was identified. As in other species Dictyostelium DET1 is nuclear localised. In ChIP experiments DET1 was found to bind the promoters of a number of developmentally regulated loci. In contrast to other species where it is an essential protein, loss of DET1 is not lethal in Dictyostelium, although viability is greatly reduced. Loss of DET1 results in delayed and abnormal development with enlarged aggregation territories. Mutant slugs displayed apparent cell type patterning with a bias towards pre-stalk cell types.