Análisis bioinformático de los genes de lacasas YfiH en clones virulentos de Acinetobacter baumannii

[ES] Acinetobacter baumannii es una bacteria Gram negativa, patógena y multirresistente. Su alta capacidad de supervivencia en hospitales y su resistencia a químicos puede deberse a la producción de lacasas. Estas enzimas son capaces de oxidar un sinfín de compuestos como los fenoles utilizados en hospitales para la desinfección de superficies. En este estudio se ha realizado un análisis de actividad lacasa en aislamientos altamente virulentos de los clones internaciones I y II, observando que estas cepas presentan actividad lacasa. Paralelamente, se ha realizado un análisis bioinformático con el que se ha determinado la similitud de los genes de estas lacasas con las ya descritas de la familia “YfiH” y con otras enzimas procedentes de otras especies, demostrando su similitud de secuencia con la lacasa RL5, procedente de una muestra de rumen bovino. Estos hechos suponen un avance en el estudio de lacasas bacterianas en Acinetobacter baumannii cuya caracterización podría desembocar en nuevas líneas de lucha contra dicho patógeno.

Gen LPP : Avances en el conocimiento de uno de los genes candidato de la enfermedad celíaca

[ES] La enfermedad celíaca (EC) es una enteropatía autoinmune de predisposición genética, producida por la ingestión en la dieta de péptidos derivados de cereales como el trigo o la cebada. Aunque se creía que afectaba casi de forma exclusiva a los individuos europeos (1%), actualmente se conocen casos en todo el mundo. El modelo patogénico se centra en los mecanismos de la inmunidad adaptativa dependientes de la estimulación de linfocitos T CD4+ reactivos, pero existe además un efecto tóxico directo del gluten sobre el epitelio intestinal, dependiente de la inmunidad innata. La participación de la Genética en la susceptibilidad a la enfermedad es conocida desde hace tiempo, siendo el locus HLA el que explica aproximadamente el 40% del componente genético de la enfermedad. Para tratar de identificar otros genes con susceptibilidad, se han venido realizando múltiples esfuerzos durante los últimos años. Uno de los últimos, llevado a cabo en 2011, fue el Proyecto Immunochip. En él, se analizaron más de 200.000 variantes y se descubrieron 13 nuevos loci de riesgo para la EC, que junto con los descubiertos en anteriores trabajos y el locus HLA, daban un total de 40 loci de riesgo. Entre ellos, se encontraba la región que ocupa el gen LPP . Localizado en el cromosoma 3, un estudio reciente lo vincula con los procesos de adhesión celular en el intestino. En el presente trabajo, se ha estudiado el efecto de la gliadina sobre la expresión del gen de interés (LPP ) y el posible efecto de un silenciamiento del mismo sobre dos genes relacionados con las uniones celulares (ACTB y TJP1). En el caso de la gliadina, no se halló un cambio significativo en la expresión del gen. Mientras, los resultados del efecto del silenciamiento fueron dispares, no siendo concluyentes para el gen ACTB, pero encontrando una posible asociación entre los genes LPP y TJP1.

Relação entre fatores genéticos envolvidos em vias metabólicas mitocondriais e a doença de Parkinson

A doença de Parkinson (DP) é uma das desordens neurodegenerativas mais comuns associada ao envelhecimento, alcançando 2% aos 70 anos. É uma doença caracterizada pela degeneração progressiva de neurônios dopaminérgicos nigrais nos gânglios basais e pela presença de inclusões protéicas citoplasmáticas denominadas corpúsculos e neuritos de Lewy nos neurônios sobreviventes. A etiologia da DP é pouco conhecida, sendo considerada, na maioria dos casos, idiopática. Conhecimentos alcançados nos últimos 15 anos sobre a base genética da DP demonstram, claramente, que os fatores genéticos desempenham um importante papel na etiologia desta desordem. Neste trabalho, rastreamos mutações nos genes que codificam proteínas participantes de vias metabólicas mitocondriais (Parkin, PINK1 e DJ-1) em 136 pacientes brasileiros com manifestação precoce da DP, através do sequenciamento automático e da técnica de MLPA. Avaliamos a presença de variantes de sequência por meio do sequenciamento dos exons 1 a 12 do gene Parkin e dos exons 1 a 8 do gene PINK1. Em Parkin foram identificadas três mutações patogênicas ou potencialmente patogênicas, ambas em heterozigose: p.T240M, p.437L e p.S145N. Em PINK1 não encontramos variantes de ponto patogênicas. Através da técnica de MLPA investigamos alterações de dosagem nos genes Parkin, PINK1 e DJ-1. Identificamos cinco alterações no gene Parkin em quatro pacientes: uma duplicação heterozigota do exon 4 no paciente PAR2256, uma deleção heterozigota do exon 4 no probando PAR2099, uma deleção homozigota do exon 4 na paciente PAR3380 e um probando heterozigoto composto (PAR2396) com duas alterações, uma duplicação do exon 3 e uma deleção dos exons 5 e 6. No gene PINK1 identificamos uma deleção heterozigota do exon 1, que nunca foi descrita na literatura, em um paciente (PAR2083). Não encontramos alteração quantitativa no gene DJ-1. Neste estudo obtivemos uma frequência total de mutações patogênicas (pontuais e de dosagem) nos genes estudados de 7,3%, sendo 6,6% no gene Parkin e 0,7% no gene PINK1.

Genetic Variants in MiRNA Processing Genes and Pre-MiRNAs Are Associated with the Risk of Chronic Lymphocytic Leukemia

Genome wide association studies (GWAS) have identified several low-penetrance susceptibility alleles in chronic lymphocytic leukemia (CLL). Nevertheless, these studies scarcely study regions that are implicated in non-coding molecules such as microRNAs (miRNAs). Abnormalities in miRNAs, as altered expression patterns and mutations, have been described in CLL, suggesting their implication in the development of the disease. Genetic variations in miRNAs can affect levels of miRNA expression if present in pre-miRNAs and in miRNA biogenesis genes or alter miRNA function if present in both target mRNA and miRNA sequences. Therefore, the present study aimed to evaluate whether polymorphisms in pre-miRNAs, and/or miRNA processing genes contribute to predisposition for CLL. A total of 91 SNPs in 107 CLL patients and 350 cancer-free controls were successfully analyzed using TaqMan Open Array technology. We found nine statistically significant associations with CLL risk after FDR correction, seven in miRNA processing genes (rs3805500 and rs6877842 in DROSHA, rs1057035 in DICER1, rs17676986 in SND1, rs9611280 in TNRC6B, rs784567 in TRBP and rs11866002 in CNOT1) and two in pre-miRNAs (rs11614913 in miR196a2 and rs2114358 in miR1206). These findings suggest that polymorphisms in genes involved in miRNAs biogenesis pathway as well as in pre-miRNAs contribute to the risk of CLL. Large-scale studies are needed to validate the current findings.

Pharmacological Blockade of Cannabinoid CB1 Receptors in Diet-Induced Obesity Regulates Mitochondrial Dihydrolipoamide Dehydrogenase in Muscle

Cannabinoid CB1 receptors peripherally modulate energy metabolism. Here, we investigated the role of CB1 receptors in the expression of glucose/pyruvate/tricarboxylic acid (TCA) metabolism in rat abdominal muscle. Dihydrolipoamide dehydrogenase (DLD), a flavoprotein component (E3) of alpha-ketoacid dehydrogenase complexes with diaphorase activity in mitochondria, was specifically analyzed. After assessing the effectiveness of the CB1 receptor antagonist AM251 (3 mg kg(-1), 14 days) on food intake and body weight, we could identified seven key enzymes from either glycolytic pathway or TCA cycle-regulated by both diet and CB1 receptor activity-through comprehensive proteomic approaches involving two-dimensional electrophoresis and MALDI-TOF/LC-ESI trap mass spectrometry. These enzymes were glucose 6-phosphate isomerase (GPI), triosephosphate isomerase (TPI), enolase (Eno3), lactate dehydrogenase (LDHa), glyoxalase-1 (Glo1) and the mitochondrial DLD, whose expressions were modified by AM251 in hypercaloric diet-induced obesity. Specifically, AM251 blocked high-carbohydrate diet (HCD)-induced expression of GPI, TPI, Eno3 and LDHa, suggesting a down-regulation of glucose/pyruvate/lactate pathways under glucose availability. AM251 reversed the HCD-inhibited expression of Glo1 and DLD in the muscle, and the DLD and CB1 receptor expression in the mitochondrial fraction. Interestingly, we identified the presence of CB1 receptors at the membrane of striate muscle mitochondria. DLD over-expression was confirmed in muscle of CB1-/- mice. AM251 increased the pyruvate dehydrogenase and glutathione reductase activity in C2C12 myotubes, and the diaphorase/oxidative activity in the mitochondria fraction. These results indicated an up-regulation of methylglyoxal and TCA cycle activity. Findings suggest that CB1 receptors in muscle modulate glucose/pyruvate/lactate pathways and mitochondrial oxidative activity by targeting DLD.

Análise de marcadores moleculares do DNA mitocondrial em anuros da Mata Atlântica

A Mata Atlântica brasileira concentra uma das maiores diversidades biológicas da Terra com cerca de 7% das espécies animais e vegetais do planeta. Esse bioma abriga atualmente mais de 50% das espécies de anuros do Brasil (c.a. 500 espécies), mas sofre intensa perda e fragmentação de habitat. Um dos principais fragmentos da Mata Atlântica, a Reserva Ecológica de Guapiaçu (REGUA) abriga vasta anurofauna, com cerca de 71 espécies já descritas. Acredita-se, porém, que muitas ainda precisam ser identificadas e estudadas. A identificação de espécies baseada em caracteres moleculares vem se mostrando uma alternativa para dar suporte à identificação morfológica, e dentro deste contexto os genes de DNA mitocondrial, como o 16S, são utilizados para a realização de barcode. O objetivo deste estudo foi testar a metodologia de identificação molecular de espécies (DNA barcode) na comunidade de anfíbios anuros da REGUA utilizando o gene mitocondrial 16S. Para isso, foram coletados tecidos de 99 indivíduos, entre adultos e girinos de 23 espécies, agrupados em seis famílias distintas. Desses 99 indivíduos, 88 foram amplificados corretamente para o gene em referência e foram realizadas, com sucesso, a determinação de espécies de 84 anuros (95,45%) da REGUA. As espécies de Scinax albicans, Scinax flavoguttatus e Hylodes charadranaetes, cujas identificações haviam sido determinadas com base em critérios morfológicos, agruparam em clados de mesmo gênero, porém de espécies diferentes quando analisadas pelas metodologias neighbor-joining e maximum-likelihood. Além de altos valores de distância intraespecífica (2,18%, 3,49% e 3,77%, respectivamente) e distâncias interespecíficas nulas (0%) temos a indicação de possíveis equívocos em determinações de espécies feitas exclusivamente por critérios morfológicos. Nesse caso, as discordâncias morfológica e molecular são exclusivamente de girinos, demonstrando a dificuldade na identificação morfológica e a escassez de chaves de identificação dessas espécies em estágio larval. Os resultados mostram que o gene mitocondrial 16S teve seu uso na identificação de anuros da REGUA confirmada e apontam que, em casos de estudos com indivíduos em estágios larvais, como em girinos, a metodologia de barcode, quando complementada a identificação morfológica, suporta a correta identificação das espécies de anfíbios anuros.

Progress toward a global genealogy of common carp (Cyprinus carpio L.) strains using mitochondrial nucleotide sequences data

As part of a study of genetic variation in the Vietnamese strains of the common carp (Cyprinus carpio L.) using direct DNA sequencing of mitochondrial control and ATPase6/8 gene regions, samples from a number of other countries were analyzed for comparison. Results show that the levels of sequence divergence in common carp is low on a global scale, with the Asian carp having the highest diversity while Koi and European carp are invariant. A genealogical analysis supports a close relationship among Vietnamese, Koi, Chinese Color and, to a lesser extent, European carp. Koi carp appear to have originated from a strain of Chinese red carp. There is considerable scope to extend this research through the analysis of additional samples of carp from around the world, especially from China, in order to generate a comprehensive global genealogy of common carp strains.

Mitochondrial gene sequences useful for species identification of western North Atlantic Ocean sharks

Molecular-based approaches for shark species identification have been driven largely by issues specific to the fishery. In an effort to establish a more comprehensive identification data set, we investigated DNA sequence variation of a 1.4-kb region from the mitochondrial genome covering partial sequences from the 12S rDNA, 16S rDNA, and the complete valine tRNA from 35 shark species from the Atlantic fishery. Generally, within-species variability was low in relation to interspecific divergence because species haloptypes formed monophyletic groups. Phylogenetic analyses resolved ordinal relationships among Carcharhiniformes and Lamniformes, and revealed support for the families Sphyrnidae and Triakidae (within Carcharhiniformes) and Lamnidae and Alopidae (within Lamniformes). The combination of limited intraspecific variability and sufficient between-species divergence indicates that this locus is suitable for species identification.

Efeitos da exposição precoce ao etanol na atividade locomotora e na expressão dos genes de controle do ritmo circadiano de camundongos adolescentes em diferentes períodos do ciclo claro/escuro

A hiperatividade locomotora e as alterações nos ritmos circadianos têm sido descritas em roedores e humanos expostos ao etanol durante o desenvolvimento. Considerando que a atividade locomotora em camundongos é conhecida por variar ao longo das fases do ciclo claro escuro, é possível que o fenótipo hiperativo resultante da exposição precoce ao etanol também varie em função da hora do dia. Além disso, é possível que a hiperatividade apresentada pelos indivíduos expostos ao etanol durante o desenvolvimento esteja associada com distúrbios no sistema de controle do ritmo circadiano. Neste estudo, avaliamos estas duas possibilidades realizando uma análise circadiana da atividade locomotora e da expressão dos genes de relógio de camundongos adolescentes expostos ao etanol durante o período de surto de crescimento cerebral. Para tanto, camundongos suíços criados e mantidos em um ciclo claro/escuro de 12h (luzes acesas às 2:00h, apagadas as 14:00h) foram injetados com etanol (5g/kg ip, grupo ETOH) ou um volume equivalente de solução salina (grupo SAL) em dias alternados do segundo ao oitavo dias pós-natais. No 30 dia pós-natal, os animais foram testados em campo aberto por 15 minutos em diferentes momentos do ciclo claro/escuro: durante a fase clara entre 6:00 e 7:30h e entre12:00 e 13:30h; durante a fase escura entre 18:00 e 19:30h e entre 0:00 e 01:30h. Durante a fase escura os testes foram realizados sob iluminação com luz vermelha. Após os testes comportamentais, alguns animais foram randomicamente selecionados para as análises de imunofluorescência da expressão dos genes PER 1, 2 e 3 no núcleo supraquiasmático. Ao longo dos seis primeiros minutos, a atividade locomotora dos animais testados durante o período claro não mudou significativamente ou apresentou um leve aumento e a dos animais testados no período escuro apresentou uma marcante redução. Além disso, o grupo de animais testados entre 00:00 e 1:30h apresentou a maior atividade locomotora e o grupo dos animais testados entre 12:00 e 13:30h apresentou a menor atividade locomotora. De modo importante, a exposição neonatal ao etanol promoveu hiperatividade locomotora apenas no grupo de animais testados entre 00:00 e 1:30h. Em relação aos genes de controle do ritmo circadiano, a exposição precoce ao etanol afetou apenas a expressão do gene Per1 que foi menor entre 18:00 e 19:30h. O fato de que a expressão dos genes de controle do ritmo circadiano foi alterada no meio da fase escura e que a hiperatividade locomotora foi observada apenas no final da fase escura é compatível com a hipótese de que a hiperatividade induzida pelo etanol pode estar associada com as perturbações de controle do ritmo circadiano.

Investigação de alterações em genes de microRNAs expressos no cérebro como causa de deficiência intelectual ligada ao cromossomo X

A Deficiência Intelectual (DI) é uma condição definida como um funcionamento intelectual significativamente prejudicado, expresso juntamente com limitações em pelo menos duas áreas do comportamento adaptativo que se manifestam antes dos 18 anos de idade. A prevalência estimada da DI na população em geral é de 2-3% e um número expressivo de casos permanece sem um diagnóstico definitivo. Há um consenso geral de que a DI é mais comum em indivíduos do sexo masculino em relação aos do sexo feminino. Entre as explicações para este excesso está a concentração de genes específicos para a habilidade cognitiva no cromossomo X. MicroRNAs (miRNAs) são pequenas moléculas de RNA não codificador que modulam a expressão gênica pós-transcricional de RNAs mensageiros alvo. Recentemente, estudos têm demonstrado a importância essencial dos miRNAs para o desenvolvimento e funcionamento cerebrais e sabe-se que o cromossomo X tem uma alta densidade de genes de miRNAs. Neste contexto, os miRNAs são candidatos potenciais como fatores genéticos envolvidos na Deficiência Intelectual Ligada ao X (DILX). Neste estudo, foram analisadas as regiões genômicas de 17 genes de miRNAs expressos no cérebro localizados no cromossomo X, com o objetivo de investigar o possível envolvimento de variantes na sequência destes miRNAs na DILX. Para este fim, selecionamos amostras de DNA genômico (sangue periférico) de 135 indivíduos do sexo masculino portadores de DI sugestiva de DILX de um grupo de mais de 1.100 pacientes com DI encaminhados ao Serviço de Genética Humana da UERJ. O critério de inclusão para este estudo era de que os probandos apresentassem um ou mais parentes do sexo masculino afetados pela DI que fossem interligados por via materna. As amostras de DNA dos pacientes foram amplificadas utilizando a técnica de reação em cadeia da polimerase, seguida por purificação e sequenciamento direto pelo método de Sanger dos fragmentos amplificados. Para avaliar a conservação dos 17 miRNAs foi realizada uma análise filogenética in silico incluindo sequências dos miRNAs selecionados de humanos e de outras 8 espécies de primatas estreitamente relacionadas. Não foram encontradas alterações nas sequências nos genes de 17 miRNAs analisados, mesmo diante do padrão genético altamente heterogêneo da população brasileira. Adicionalmente, a análise filogenética destes miRNAs revelou uma alta conservação entre as espécies comparadas. Considerando o papel dos miRNAs como reguladores da expressão gênica, a ausência de alterações e a alta conservação entre primatas sugerem uma forte pressão seletiva sobre estas moléculas, reforçando a sua importância funcional para o organismo em geral. Apesar de não termos encontrado variantes de sequência nos miRNAs estudados, o envolvimento de miRNAs na DI não pode ser completamente descartado. Alterações fora da molécula de miRNA precursor, nos fatores de processamento, nos sítios alvo e variações no número de cópias de genes de miRNAs podem implicar em alteração na expressão dos miRNAs e, consequentemente, na funcionalidade do miRNA maduro. Sendo assim, uma análise sistemática da expressão de miRNAs em pacientes com DILX é urgentemente necessária, a fim de desvendar novos genes/mecanismos moleculares relacionados a esta condição.