Étude structure-fonction des fructose-1,6-bisphosphate aldolases métallo-dépendantes : mécanisme catalytique et développement d’antimicrobiens

Les fructose-1,6-bisphosphate aldolases (FBPA) sont des enzymes glycolytiques (EC 4.1.2.13) qui catalysent la transformation réversible du fructose-1,6-bisphosphate (FBP) en deux trioses-phosphates, le glycéraldéhyde-3-phosphate (G3P) et le dihydroxyacétone phosphate (DHAP). Il existe deux classes de FBPA qui diffèrent au niveau de leur mécanisme catalytique. Les classes I passent par la formation d’un intermédiaire covalent de type iminium alors que les classes II, métallodépendantes, utilisent généralement un zinc catalytique. Contrairement au mécanisme des classes I qui a été très étudié, de nombreuses interrogations subsistent au sujet de celui des classes II. Nous avons donc entrepris une analyse détaillée de leur mécanisme réactionnel en nous basant principalement sur la résolution de structures cristallographiques. De nombreux complexes à haute résolution furent obtenus et ont permis de détailler le rôle de plusieurs résidus du site actif de l’enzyme. Nous avons ainsi corrigé l’identification du résidu responsable de l’abstraction du proton de l’O4 du FBP, une étape cruciale du mécanisme. Ce rôle, faussement attribué à l’Asp82 (chez Helicobacter pylori), est en fait rempli par l’His180, un des résidus coordonant le zinc. L’Asp82 n’en demeure pas moins essentiel car il oriente, active et stabilise les substrats. Enfin, notre étude met en évidence le caractère dynamique de notre enzyme dont la catalyse nécessite la relocalisation du zinc et de nombreux résidus. La dynamique de la protéine ne permet pas d’étudier tous les aspects du mécanisme uniquement par l’approche cristallographique. En particulier, le résidu effectuant le transfert stéréospécifique du proton pro(S) sur le carbone 3 (C3) du DHAP est situé sur une boucle qui n’est visible dans aucune de nos structures. Nous avons donc développé un protocole de dynamique moléculaire afin d’étudier sa dynamique. Validé par l’étude d’inhibiteurs de la classe I, l’application de notre protocole aux FBPA de classe II a confirmé l’identification du résidu responsable de cette abstraction chez Escherichia coli (Glu182) mais pointe vers un résidu diffèrent chez H. pylori (Glu149 au lieu de Glu142). Nos validations expérimentales confirment ces observations et seront consolidées dans le futur. Les FBPA de classe II sont absentes du protéome humain mais sont retrouvées chez de nombreux pathogènes, pouvant même s'y révéler essentielles. Elles apparaissent donc comme étant une cible idéale pour le développement de nouveaux agents anti-microbiens. L’obtention de nouveaux analogues des substrats pour ces enzymes a donc un double intérêt, obtenir de nouveaux outils d’étude du mécanisme mais aussi développer des molécules à visée pharmacologique. En collaboration avec un groupe de chimistes, nous avons optimisé le seul inhibiteur connu des FBPA de classe II. Les composés obtenus, à la fois plus spécifiques et plus puissants, permettent d’envisager une utilisation pharmacologique. En somme, c’est par l’utilisation de techniques complémentaires que de nouveaux détails moléculaires de la catalyse des FBPA de classe II ont pu être étudiés. Ces techniques permettront d’approfondir la compréhension fine du mécanisme catalytique de l’enzyme et offrent aussi de nouvelles perspectives thérapeutiques.

Développement d'une méthode d'isolation des noyaux adaptée aux macrophages pour une caractérisation protéomique d'une nouvelle structure autophagique induite par le virus HSV-1

L’autophagie est un processus cellulaire catabolique qui a été conservé durant l’évolution de la levure à l’homme. Cet important mécanisme consiste en une dégradation des composants cytoplasmiques dans une structure lytique, le lysosome. Il existe trois types de l’autophagie : la microautophagie, l’autophagie médiée par les chaperones et la macroautophagie nommée « autophagie ». Il a été démontré que lors de l’autophagie, le matériel cytoplasmique (protéines cytosoliques et organites) est séquestré dans l’autophagosome qui finit par fusionner avec le lysosome, formant ainsi l’autophagolysosome. Le matériel séquestré et la membrane interne de l’autophagosome seront dégradés par les hydrolases lysosomales. Plusieurs études se sont focalisées sur la détermination de la machinerie moléculaire et les mécanismes de l’autophagie. Il a été démontré l’implication de 31 molécules Atg essentielles dans le processus de l’autophagie. L’identification de ces protéines a permis de déceler le rôle de l’autophagie non seulement dans le maintien de l’homéostasie cellulaire mais aussi dans la défense contre les agents pathogènes. En effet, l’autophagie joue un rôle important dans l’immunité innée conduisant à contrôler l’évasion des pathogènes dont les bactéries et les virus. Également, l’autophagie est impliquée dans l’immunité adaptative en favorisant la présentation des antigènes viraux par le CMH de classe II aux cellules T CD4+. De plus, une étude récente suggère que l’autophagie contribue à la présentation antigénique par le CMH de classe I aux cellules T CD8+ durant une infection virale par le virus HSV-1 (Herpes simplex type 1). Toutefois, certains virus y compris HSV-1 ont pu développer des mécanismes pour contourner et inhiber en partie le rôle protecteur de l’autophagie. Récemment, une étude dans notre laboratoire a mis en évidence, lors d’une infection virale par HSV-1 des cellules macrophages BMA, la présence d’une nouvelle structure autophagique dans une phase tardive de l’infection. Cette nouvelle structure est différente des autophagosomes classiques à double membrane et est caractérisée morphologiquement par quatre membranes dérivées de l’enveloppe nucléaire interne et externe. Peu de choses ont été rapportées sur cette nouvelle voie autophagique qui peut être un mécanisme de défense cellulaire quand l’autophagie classique dans le cytosol est inhibée par HSV-1. Il devient donc intéressant de caractériser les molécules impliquées dans la formation de ces autophagosomes issus du noyau par spectrométrie de masse. Pour ce faire, il était impératif d’établir un outil d’isolation des noyaux à partir de macrophages infectés par HSV-1 dans lesquels les autophagosomes issus des noyaux seront formés. La validation de cette méthode d’isolation a été effectuée en déterminant la pureté et l’intégrité des noyaux isolés à partir des cellules non infectées (contrôle) et infectées par HSV-1. La pureté des préparations de noyaux isolés a été caractérisée par l’absence de contaminants cellulaires et un enrichissement en noyaux. Également, il a fallu déterminer la cinétique de formation des autophagosomes issus des noyaux pour les deux lignées cellulaires de macrophages utilisées dans ce projet. Dans une perspective future, l’analyse protéomique à partir des échantillons purs des noyaux isolés (non infectés et infectés) mènera à identifier les protéines impliquées dans la formation des autophagosomes dérivés des noyaux, ce qui permettra ultérieurement d’effectuer des études sur les mécanismes moléculaires et les fonctions de cette nouvelle voie autophagique.

Étude pilote des effets du Tandem Forsus Maxillary Corrector sur la croissance des maxillaires

Objectif : Récemment, un nouvel appareil issu de la technologie du Forsus™ et visant à corriger les malocclusions de classe III a été mis sur le marché et se popularise dans la pratique orthodontique : le Tandem Forsus Maxillary Corrector (TFMC). L’objectif de la présente étude est de mesurer les effets squelettiques, l’influence réelle sur la croissance, et les effets dento-alvéolaires du port du TFMC. Matériel et méthodes : 14 patients présentant une malocclusion de classe III (âge moyen de 9 ans 6 mois) traités par le même orthodontiste ont participé à cette étude prospective. Le groupe consiste en 10 garçons et 4 filles. Le Tandem Forsus Maxillary Corrector est porté de 12 à 14 heures par jour jusqu’à l’obtention d’une surcorrection du surplomb horizontal et une relation dentaire de classe I. Le traitement est généralement d’une durée de 8 à 9 mois. Des radiographies céphalométriques latérales prises avant (T1) et après (T2) le traitement ont été analysées afin de déterminer les changements dentaires et squelettiques. Les résultats ont été comparés à un groupe contrôle composé de 42 enfants provenant du Centre de croissance de l’Université de Montréal. Les radiographies ont été tracées et analysées de manière aveugle à l’aide du logiciel Dolphin Imaging (ver 11.0, Patterson Dental, Chatsworth, California). L’erreur sur la méthode a été évaluée avec la formule de Dahlberg, le coefficient de corrélation intra-classe et l’indice de Bland-Altman. L’effet du traitement a été évalué à l’aide du test t pour échantillons appariés. L’effet de la croissance pour le groupe contrôle a été calculé à l’aide d’un test t pour échantillons indépendants. Résultats : L’utilisation du TFMC produit un mouvement antérieur et une rotation antihoraire du maxillaire. De plus, il procline les incisives supérieures et rétrocline les incisives inférieures. Une rotation antihoraire du plan occlusal contribue aussi à la correction de la malocclusion de classe III. Par contre, le TFMC ne semble pas avoir pour effet de restreindre la croissance mandibulaire. Conclusion : La présente étude tend à démontrer que le port de l’appareil TFMC a un effet orthopédique et dento-alvéolaire significatif lors du traitement correctif des malocclusions modérées de classe III.

Implication des protéines WHIRLY dans la biogénèse du chloroplaste en association avec la protéine SIG6

Le mode vie autotrophique des plantes repose entièrement sur l’intégrité du chloroplaste et notamment l’étape de la biogénèse. La transcription des gènes chloroplastiques, assurée par une PEP (ARN polymérase encodée par le chloroplaste) et deux NEPs (ARN polymérase encodée par le noyau), est l’une des étapes primordiales dans le développement d’un chloroplaste photosynthétique. On distingue trois classes de gènes chloroplastiques : les gènes de classe I, transcrit par la PEP exclusivement; les gènes de classe II, transcrits par la PEP ou les NEPs; et les gènes de classe III, transcrits exclusivement par les NEPs. Pour assurer sa fonction, la PEP doit être associée à des facteurs sigmas. L’un de ceux-ci, la protéine SIG6, est un facteur sigma général et, associé à la PEP, assure la transcription de l’ensemble des gènes de classe I et II lors du développement du chloroplaste photosynthétique. Ainsi, le mutant sig6 présente un phénotype de cotylédons pâles, associé à un retard de biogénèse chloroplastique, ainsi qu’une diminution de la transcription des gènes de classe I, provoquant la diminution de la quantité de protéines de classe I. Dans le laboratoire, nous étudions les deux protéines WHIRLY chloroplastiques (WHY1 et WHY3) pour leur rôle dans le maintien de la stabilité génomique chloroplastique. Toutefois, peu de choses sont encore connues sur leur rôle potentiel dans la transcription ou la biogénèse chloroplastique. Par exemple, lorsque l’on tente de purifier la PEP, on obtient un gros complexe transcriptionnel nommé PTAC (Plastid Transcriptionally Active Chromosome) dans lequel sont retrouvées les deux protéines WHIRLY, suggérant qu’elles pourraient être impliquées dans la transcription chloroplastique. De plus, un possible rôle dans la biogénèse chloroplastique leur a été prêté, notamment chez le maïs. Dans cette étude, nous avons donc cherché à vérifier l’implication des protéines WHIRLY dans la biogénèse chloroplastique par une approche génétique de croisements entre les mutants sig6 et why1why3. Pour cela, nous avons isolé des doubles mutants sig6why1 et sig6why3, ainsi qu’un triple mutant sig6why1why3. À l’aide d’une caractérisation phénotypique et de la quantification de quelques protéines chloroplastiques, nous avons remarqué que la perte d’un des WHIRLY permet de complémenter le phénotype de cotylédons pâles du mutant sig6 et favorise l’expression normale de protéines en principe sous-exprimées dans le mutant sig6. Toutefois, la perte des deux WHIRLY ne permet pas de compenser le phénotype de cotylédons pâles et provoque l’apparition d’un phénotype persistant associé à une expression anormale des protéines chloroplastiques. Ces résultats ne peuvent être expliqués par le rôle des WHIRLY dans le maintien de la stabilité génomique chloroplastique étant donné que le triple mutant sig6why1why3 présente moins de réarrangements que le double mutant why1why3. Finalement, nous montrons que les effets de la perte d’un WHIRLY sur le mutant sig6 peuvent être mimés par l’utilisation de la rifampicine, une drogue inhibant l’ARN polymérase chloroplastique de type bactérienne (PEP). Ensemble, ces résultats démontrent donc l’implication des protéines WHIRLY chloroplastiques dans la biogénèse chloroplastique en association avec la protéine SIG6. Nous proposons un modèle selon lequel les deux protéines WHIRLY permettraient de favoriser l’activité de l’ARN polymérase de type bactérienne, notamment lors du développement du chloroplaste photosynthétique. En cas d’absence d’une des deux protéines, cette diminution partielle d’activité de la PEP favoriserait la mise en place d’un mécanisme de complémentation par le NEPs, permettant finalement de rétablir la biogénèse chloroplastique dans un mutant sig6. En l’absence des deux WHIRLY, le mécanisme de complémentation par les NEPs serait incapable de compenser la forte inhibition de la PEP, se traduisant par une aggravation du retard de développement du chloroplaste dans le mutant sig6.

Inférence topologique

Les données provenant de l'échantillonnage fin d'un processus continu (champ aléatoire) peuvent être représentées sous forme d'images. Un test statistique permettant de détecter une différence entre deux images peut être vu comme un ensemble de tests où chaque pixel est comparé au pixel correspondant de l'autre image. On utilise alors une méthode de contrôle de l'erreur de type I au niveau de l'ensemble de tests, comme la correction de Bonferroni ou le contrôle du taux de faux-positifs (FDR). Des méthodes d'analyse de données ont été développées en imagerie médicale, principalement par Keith Worsley, utilisant la géométrie des champs aléatoires afin de construire un test statistique global sur une image entière. Il s'agit d'utiliser l'espérance de la caractéristique d'Euler de l'ensemble d'excursion du champ aléatoire sous-jacent à l'échantillon au-delà d'un seuil donné, pour déterminer la probabilité que le champ aléatoire dépasse ce même seuil sous l'hypothèse nulle (inférence topologique). Nous exposons quelques notions portant sur les champs aléatoires, en particulier l'isotropie (la fonction de covariance entre deux points du champ dépend seulement de la distance qui les sépare). Nous discutons de deux méthodes pour l'analyse des champs anisotropes. La première consiste à déformer le champ puis à utiliser les volumes intrinsèques et les compacités de la caractéristique d'Euler. La seconde utilise plutôt les courbures de Lipschitz-Killing. Nous faisons ensuite une étude de niveau et de puissance de l'inférence topologique en comparaison avec la correction de Bonferroni. Finalement, nous utilisons l'inférence topologique pour décrire l'évolution du changement climatique sur le territoire du Québec entre 1991 et 2100, en utilisant des données de température simulées et publiées par l'Équipe Simulations climatiques d'Ouranos selon le modèle régional canadien du climat.

Size invariant measures of association: characterization and difficulties

A measure of association is row-size invariant if it is unaffected by the multiplication of all entries in a row of a cross-classification table by a same positive number. It is class-size invariant if it is unaffected by the multiplication of all entries in a class (i.e., a row or a column). We prove that every class-size invariant measure of association as-signs to each m x n cross-classification table a number which depends only on the cross-product ratios of its 2 x 2 subtables. We propose a monotonicity axiom requiring that the degree of association should increase after shifting mass from cells of a table where this mass is below its expected value to cells where it is above .provided that total mass in each class remains constant. We prove that no continuous row-size invariant measure of association is monotonic if m ≥ 4. Keywords: association, contingency tables, margin-free measures, size invariance, monotonicity, transfer principle.

Molecular characterization of the contribution of autophagy to antigen presentation using quantitative proteomics

L’autophagie est une voie hautement conservée de dégradation lysosomale des constituants cellulaires qui est essentiel à l’homéostasie cellulaire et contribue à l’apprêtement et à la présentation des antigènes. Les rôles relativement récents de l'autophagie dans l'immunité innée et acquise sous-tendent de nouveaux paradigmes immunologiques pouvant faciliter le développement de nouvelles thérapies où la dérégulation de l’autophagie est associée à des maladies auto-immunes. Cependant, l'étude in vivo de la réponse autophagique est difficile en raison du nombre limité de méthodes d'analyse pouvant fournir une définition dynamique des protéines clés impliquées dans cette voie. En conséquence, nous avons développé un programme de recherche en protéomique intégrée afin d’identifier et de quantifier les proteines associées à l'autophagie et de déterminer les mécanismes moléculaires régissant les fonctions de l’autophagosome dans la présentation antigénique en utilisant une approche de biologie des systèmes. Pour étudier comment l'autophagie et la présentation antigénique sont activement régulés dans les macrophages, nous avons d'abord procédé à une étude protéomique à grande échelle sous différentes conditions connues pour stimuler l'autophagie, tels l’activation par les cytokines et l’infection virale. La cytokine tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha) est l'une des principales cytokines pro-inflammatoires qui intervient dans les réactions locales et systémiques afin de développer une réponse immune adaptative. La protéomique quantitative d'extraits membranaires de macrophages contrôles et stimulés avec le TNF-alpha a révélé que l'activation des macrophages a entrainé la dégradation de protéines mitochondriales et des changements d’abondance de plusieurs protéines impliquées dans le trafic vésiculaire et la réponse immunitaire. Nous avons constaté que la dégradation des protéines mitochondriales était sous le contrôle de la voie ATG5, et était spécifique au TNF-alpha. En outre, l’utilisation d’un nouveau système de présentation antigènique, nous a permi de constater que l'induction de la mitophagie par le TNF-alpha a entrainée l’apprêtement et la présentation d’antigènes mitochondriaux par des molécules du CMH de classe I, contribuant ainsi la variation du répertoire immunopeptidomique à la surface cellulaire. Ces résultats mettent en évidence un rôle insoupçonné du TNF-alpha dans la mitophagie et permet une meilleure compréhension des mécanismes responsables de la présentation d’auto-antigènes par les molécules du CMH de classe I. Une interaction complexe existe également entre infection virale et l'autophagie. Récemment, notre laboratoire a fourni une première preuve suggérant que la macroautophagie peut contribuer à la présentation de protéines virales par les molécules du CMH de classe I lors de l’infection virale par l'herpès simplex virus de type 1 (HSV-1). Le virus HSV1 fait parti des virus humains les plus complexes et les plus répandues. Bien que la composition des particules virales a été étudiée précédemment, on connaît moins bien l'expression de l'ensemble du protéome viral lors de l’infection des cellules hôtes. Afin de caractériser les changements dynamiques de l’expression des protéines virales lors de l’infection, nous avons analysé par LC-MS/MS le protéome du HSV1 dans les macrophages infectés. Ces analyses nous ont permis d’identifier un total de 67 protéines virales structurales et non structurales (82% du protéome HSV1) en utilisant le spectromètre de masse LTQ-Orbitrap. Nous avons également identifié 90 nouveaux sites de phosphorylation et de dix nouveaux sites d’ubiquitylation sur différentes protéines virales. Suite à l’ubiquitylation, les protéines virales peuvent se localiser au noyau ou participer à des événements de fusion avec la membrane nucléaire, suggérant ainsi que cette modification pourrait influer le trafic vésiculaire des protéines virales. Le traitement avec des inhibiteurs de la réplication de l'ADN induit des changements sur l'abondance et la modification des protéines virales, mettant en évidence l'interdépendance des protéines virales au cours du cycle de vie du virus. Compte tenu de l'importance de la dynamique d'expression, de l’ubiquitylation et la phosphorylation sur la fonction des proteines virales, ces résultats ouvriront la voie vers de nouvelles études sur la biologie des virus de l'herpès. Fait intéressant, l'infection HSV1 dans les macrophages déclenche une nouvelle forme d'autophagie qui diffère remarquablement de la macroautophagie. Ce processus, appelé autophagie associée à l’enveloppe nucléaire (nuclear envelope derived autophagy, NEDA), conduit à la formation de vésicules membranaires contenant 4 couches lipidiques provenant de l'enveloppe nucléaire où on retrouve une grande proportion de certaines protéines virales, telle la glycoprotéine B. Les mécanismes régissant NEDA et leur importance lors de l’infection virale sont encore méconnus. En utilisant un essai de présentation antigénique, nous avons pu montrer que la voie NEDA est indépendante d’ATG5 et participe à l’apprêtement et la présentation d’antigènes viraux par le CMH de classe I. Pour comprendre l'implication de NEDA dans la présentation des antigènes, il est essentiel de caractériser le protéome des autophagosomes isolés à partir de macrophages infectés par HSV1. Aussi, nous avons développé une nouvelle approche de fractionnement basé sur l’isolation de lysosomes chargés de billes de latex, nous permettant ainsi d’obtenir des extraits cellulaires enrichis en autophagosomes. Le transfert des antigènes HSV1 dans les autophagosomes a été determine par protéomique quantitative. Les protéines provenant de l’enveloppe nucléaire ont été préférentiellement transférées dans les autophagosome lors de l'infection des macrophages par le HSV1. Les analyses protéomiques d’autophagosomes impliquant NEDA ou la macroautophagie ont permis de decouvrir des mécanismes jouant un rôle clé dans l’immunodominance de la glycoprotéine B lors de l'infection HSV1. Ces analyses ont également révélées que diverses voies autophagiques peuvent être induites pour favoriser la capture sélective de protéines virales, façonnant de façon dynamique la nature de la réponse immunitaire lors d'une infection. En conclusion, l'application des méthodes de protéomique quantitative a joué un rôle clé dans l'identification et la quantification des protéines ayant des rôles importants dans la régulation de l'autophagie chez les macrophages, et nous a permis d'identifier les changements qui se produisent lors de la formation des autophagosomes lors de maladies inflammatoires ou d’infection virale. En outre, notre approche de biologie des systèmes, qui combine la protéomique quantitative basée sur la spectrométrie de masse avec des essais fonctionnels tels la présentation antigénique, nous a permis d’acquérir de nouvelles connaissances sur les mécanismes moléculaires régissant les fonctions de l'autophagie lors de la présentation antigénique. Une meilleure compréhension de ces mécanismes permettra de réduire les effets nuisibles de l'immunodominance suite à l'infection virale ou lors du développement du cancer en mettant en place une réponse immunitaire appropriée.

Caractérisation de stratégies stimulant l’immunité cellulaire par l’étude de la présentation antigénique d’une nanoparticule vaccinale et du blocage d’un mécanisme d’immunosuppression

Il existe plusieurs défis au développement d’une thérapie visant à stimuler l’immunité cellulaire. Dans la prévention contre certains virus et en immunothérapie du cancer, l’induction de lymphocytes T spécifiques est cependant primordiale. Dans la première partie de l’étude, nous avons porté notre attention sur la compréhension de la présentation croisée par le complexe majeur d’histocompatibilité de classe I (CMH I) médiée par des particules pseudo-virales (VLP) composées de la protéine de surface de potexvirus à laquelle nous avons ajouté un épitope de la protéine M1 du virus de l’influenza ou un épitope de la protéine gp100 du mélanome. Cette VLP se caractérise par sa capacité à stimuler, sans l’aide d’adjuvant, le système immunitaire et de présenter de façon croisée l’épitope inséré dans sa protéine de surface et ce, indépendamment de l’activité du protéasome. Nous avons, tout d’abord, comparé les propriétés de présentation antigénique croisée des VLP formées du virus de la mosaïque de la malva (MaMV) à celles des VLP du virus de la mosaïque de la papaye (PapMV). Les résultats confirment que ces propriétés sont partagées par plusieurs membres de la famille des potexvirus malgré des divergences de séquences (Hanafi et al. Vaccine 2010). De plus, nous avons procédé à des expériences pour préciser le mécanisme menant à la présentation de l’épitope inséré dans les VLP de PapMV. Les résultats nous confirment une voie vacuolaire dépendante de l’activité de la cathepsine S et de l’acidification des lysosomes pour l’apprêtement antigénique. L’induction de l’autophagie par les VLP semble également nécessaire à la présentation croisée par les VLP de PapMV. Nous avons donc établi un nouveau mécanisme de présentation croisée vacuolaire dépendant de l’autophagie (Hanafi et al. soumis Autophagy). En second lieu, en immunothérapie du cancer, il est aussi important de contrôler les mécanismes d’évasion immunitaire mis en branle par la tumeur. Nous avons spécifiquement étudié l’enzyme immunosuppressive indoleamine 2,3-dioxygénase (IDO) (revue de la littérature dans les tumeurs humaines; Hanafi et al. Clin. Can. Res 2011) et son inhibition dans les cellules tumorales. Pour ce faire, nous avons tenté d’inhiber son expression par la fludarabine, agent chimiothérapeutique précédemment étudié pour son activité inhibitrice de l’activation de STAT1 (signal transducers and activators of transcription 1). Étonnamment, nos résultats ont montré l’inhibition d’IDO dans les cellules tumorales par la fludarabine, indépendamment de l’inhibition de la phosphorylation de STAT1. Nous avons démontré que le mécanisme d’action dépendait plutôt de l’induction de la dégradation d’IDO par le protéasome (Hanafi et al. PlosOne 2014). Les travaux présentés dans cette thèse ont donc portés autant sur la compréhension d’une nouvelle plateforme de vaccination pouvant médier l’activation de lymphocytes T CD8+ cytotoxiques et sur le contrôle d’une immunosuppression établie par les cellules tumorales pour évader au système immunitaire. Ces deux grandes stratégies sont à considérer en immunothérapie du cancer et la combinaison avec d’autres thérapies déjà existantes pourra permettre une meilleure réponse clinique.

La petite GTPase Rab11 et ses interacteurs orchestrent la migration cellulaire collective et la cytocinèse chez la Drosophile

Le trafic vésiculaire permet un échange coordonné de molécules entre les différents organites de la cellule et dépend largement des petites GTPases de la famille des Rabs dont le nombre varie entre 27 chez la Drosophile et 70 chez l’Homme. Un des prochains défis consiste donc à élucider les mécanismes cellulaires qui coordonnent l’activité de ces Rabs, laquelle garantit un transport vésiculaire ordonné au sein de la cellule. Les Rabs agissent comme des interrupteurs moléculaires grâce à leur capacité à cycler entre un état actif et inactif. L’activité des Rabs est contrôlée par des protéines régulatrices puis des effecteurs en aval coordonnent leurs différentes fonctions. La petite GTPase Rab11 est essentielle au développement de plusieurs organismes incluant la Drosophile, C. elegans et la souris puisqu’elle se retrouve au cœur de différentes voies de transport. D’ailleurs, le trafic de molécules dépendant de Rab11 est perturbé dans plusieurs pathologies. Malgré son rôle central dans le trafic vésiculaire, la régulation de Rab11 reste peu comprise in vivo. Cette thèse se penche sur les mécanismes moléculaires contrôlant les fonctions de Rab11 et de ses effecteurs lors de la migration cellulaire collective et lors de la cytocinèse. Nous avons identifié Evi5 comme un nouvel acteur clé de la migration cellulaire collective, et nous montrons qu’elle possède une activité Rab11-GAP essentielle pour maintenir les récepteurs de guidance actifs de façon polarisée au front de migration. Nous avons ensuite déterminé que Rab11 régule la communication cellulaire lors de la migration collective par l’entremise de son interaction avec la Moésine. Une question reste toutefois en suspens : sachant que Rab11 compte plus de 13 effecteurs, quels sont les mécanismes assurant la spécificité de l’interaction entre cette GTPase et un effecteur particulier? Une partie de la réponse provient peut-être de nos observations que les membres des Rab11-FIPs de classe I, une famille d’effecteurs de Rab11, interagissent avec les protéines d’échafaudage 14-3-3. Chez la Drosophile, Rip11 est le seul représentant des Rab11-FIPs de classe I et nous montrons que Rip11 aurait des fonctions inattendues durant la cytocinèse qui seraient coordonnées par 14-3-3. Nos recherches permettent de dresser un portrait plus authentique des mécanismes moléculaires régulant les différentes fonctions de Rab11 et de ses effecteurs in vivo.

Rôle de MTORC2 dans la sénescence et la différenciation myofibroblastique induites par l'autophagie

Il a été suggéré que l’autophagie pouvait participer au processus fibrotique en favorisant la différenciation du fibroblaste en myofibroblaste. La sénescence cellulaire a aussi été montrée comme impliquée dans la réparation tissulaire et la fibrose. Des liens ont été établis entre autophagie et sénescence. Cette étude a pour but d’investiguer les liens possibles entre autophagie, sénescence et différenciation myofibroblastique afin de mieux comprendre les mécanismes moléculaires régulant la réparation tissulaire et la fibrose. Les fibroblastes carencés en sérum pendant quatre jours montrent des ratios LC3B-II/-I élevés et des niveaux de SQSTM1/p62 diminués. L’augmentation de l’autophagie est accompagnée d’une augmentation de l’expression des marqueurs de différenciation myofibroblastique ACTA2/αSMA et collagènes de type 1 et 3 et de la formation de fibres de stress. Les fibroblastes autophagiques expriment les marqueurs de sénescence CDKN1A (p21) et p16INK4a (p16) et montrent une augmentation de l’activité beta-galactosidase associée à la sénescence. L’inhibition de l’autophagie à l’aide de différents inhibiteurs de phosphoinositide 3-kinase de classe I et de phosphatidylinositol 3-kinase de classe III (PtdIns3K) ou par inhibition génique à l’aide d’ARN interférant ATG7 bloquent l’expression des marqueurs de différenciation et de sénescence. L’expression et la sécrétion de CTGF (connective tissue growth factor) sont augmentées chez les fibroblastes autophagiques. L’inhibition de l’expression du CTGF par interférence génique prévient la différenciation myofibroblastique, démontrant l’importance de ce facteur pro-fibrotique pour la différenciation induite par l’autophagie. La phosphorylation de la kinase RPS6KB1/p70S6K, cible du complexe MTORC1, est abolie dans les fibroblastes autophagiques. La phosphorylation d’AKT à la Ser473, une cible du complexe MTORC2, diminue lors de la carence en sérum des fibroblastes mais est suivie d’une rephosphorylation après 2 jours. Ce résultat suggère la réactivation de MTORC2 lors d’une autophagie prolongée. Ceci a été vérifié par inhibition de l’autophagie dans les fibroblastes carencés en sérum. Les inhibiteurs de PtdIns3K et le siRNA ATG7 bloquent la rephosphorylation d’AKT. L’inhibition de la réactivation de MTORC2, et donc de la rephosphorylation d’AKT, est aussi obtenue par exposition des fibroblastes à la rapamycine, le Torin 1 ou par inhibition génique de RICTOR. Ces traitements inhibent l’augmentation de l’expression du CTGF ainsi que des marqueurs de différenciation et de sénescence, démontrant le rôle central joué par MTORC2 dans ces processus. Le stress oxydant peut induire la sénescence et la carence en sérum est connue pour augmenter la quantité de ROS (reactive oxygen species) dans les cellules. Afin d’investiguer le rôle des ROS dans la différenciation et la sénescence induites par l’autophagie, nous avons incubés les fibroblastes carencés en sérum en présence de N-acetyl-L-cysteine (NAC). Le NAC diminue la production de ROS, diminue les marqueurs d’autophagie, de sénescence et de différenciation myofibroblastique. Le NAC inhibe aussi la phosphorylation d’AKT Ser473. L’ensemble de ces résultats identifient les ROS en association avec une autophagie prolongée comme des nouveaux activateurs du complexe MTORC2. MTORC2 est central pour l’activation subséquente de la sénescence et de la différenciation myofibroblastique.

Characterization of polyhydroxyalkanoates accumulating vibrios from marine benthic environments and production studies of polyhydroxyalkanoates by Vibrio sp. BTKB33

The present work deals with the characterization of polyhydroxyalkanoates accumulating vibrios from marine benthic environments and production studies of polyhydroxyalkanoates by vibrio sp.BTKB33. Vibrios are a group of (iram negative, curved or straight motile rods that normally inhabit the aquatic environments.The present study therefore aimed at evaluating the occurrence of PHA accumulating vibrios inhabiting marine benthic environments; characterizing the potential PHA accumulators employing phenotypic and genotypic approaches and molecular characterization of the PHA synthase gene. The study also evaluated the PHA production in V:'hri0 sp. strain BTKB33, through submerged fennentation using statistical optimization and characterized the purified biopolymer. Screening for PHA producing vibrios from marine benthic environments. Characterization of PHA producers employing phenotypic and genotypic approaches.The incidence of PHA accumulation in Vibrio sp. isolated from marine sediments was observed to be high, indicating that the natural habitat of these bacteria are stressful. Considering their ubiquitous nature, the ecological role played by vibrios in maintaining the delicate balance of the benthic ecosystem besides returning potential strains, with the ability to elaborate a plethora of extracellular enzymes for industrial application, is significant. The elaboration of several hydrolytic enzymes by individuals also emphasize the crucial role of vibrios in the mineralization process in the marine environment. This study throws light on the extracellular hydrolytic enzyme profile exhibited by vibrios. It was concluded that apart from the PHA accumulation, presence of exoenzyme production and higher MAR index also aids in their survival in the highly challenging benthic enviromnents. The phylogenetic analysis of the strains and studies on intra species variation within PHA accumulating strains reveal their diversity. The isolate selected for production in this study was Vibrio sp. strain BTKB33, identified as V.azureus by 16S rDNA sequencing and phenotypic characterization. The bioprocess variables for PHA production utilising submerged fermentation was optimized employing one-factor-at-a-time-method, PB design and RSM studies. The statistical optimization of bioprocess variables revealed that NaCl concentration, temperature and incubation period are the major bioprocess variables influencing PHA production and PHA content. The presence of Class I PHA synthase genes in BTKB33 was also unveiled. The characterization of phaC genes by PCR and of the extracted polymer employing FTIR and NMR analysis revealed the presence of polyhydroxybutyrate, smallest known PI-IAs, having wider domestic, industrial and medical application. The strain BTKB33 bearing a significant exoenzyme profile, can thus be manipulatedin future for utilization of diverse substrates as C- source for PHA production. In addition to BTKB33, several fast growing Vibrio sp. having PHA accumulating ability were also isolated, revealing the prospects of this environment as a mine for novel PHA accumulating microbes. The findings of this study will provide a reference for further research in industrial production of PHAs from marine microorganisms .

Simulation and Design of a high speed Solid State Switch for Excimer Laser

Excimerlaser sind gepulste Gaslaser, die Laseremission in Form von Linienstrahlung – abhängig von der Gasmischung – im UV erzeugen. Der erste entladungsgepumpte Excimerlaser wurde 1977 von Ischenko demonstriert. Alle kommerziell verfügbaren Excimerlaser sind entladungsgepumpte Systeme. Um eine Inversion der Besetzungsdichte zu erhalten, die notwendig ist, um den Laser zum Anschwingen zu bekommen, muss aufgrund der kurzen Wellenlänge sehr stark gepumpt werden. Diese Pumpleistung muss von einem Impulsleistungsmodul erzeugt werden. Als Schaltelement gebräuchlich sind Thyratrons, Niederdruckschaltröhren, deren Lebensdauer jedoch sehr limitiert ist. Deshalb haben sich seit Mitte der 1990iger Jahre Halbleiterschalter mit Pulskompressionsstufen auch in dieser Anwendung mehr und mehr durchgesetzt. In dieser Arbeit wird versucht, die Pulskompression durch einen direkt schaltenden Halbleiterstapel zu ersetzen und dadurch die Verluste zu reduzieren sowie den Aufwand für diese Pulskompression einzusparen. Zudem kann auch die maximal mögliche Repetitionsrate erhöht werden. Um die Belastung der Bauelemente zu berechnen, wurden für alle Komponenten möglichst einfache, aber leistungsfähige Modelle entwickelt. Da die normalerweise verfügbaren Daten der Bauelemente sich aber auf andere Applikationen beziehen, mussten für alle Bauteile grundlegende Messungen im Zeitbereich der späteren Applikation gemacht werden. Für die nichtlinearen Induktivitäten wurde ein einfaches Testverfahren entwickelt um die Verluste bei sehr hohen Magnetisierungsgeschwindigkeiten zu bestimmen. Diese Messungen sind die Grundlagen für das Modell, das im Wesentlichen eine stromabhängige Induktivität beschreibt. Dieses Modell wurde für den „magnetic assist“ benützt, der die Einschaltverluste in den Halbleitern reduziert. Die Impulskondensatoren wurden ebenfalls mit einem in der Arbeit entwickelten Verfahren nahe den späteren Einsatzparametern vermessen. Dabei zeigte sich, dass die sehr gebräuchlichen Class II Keramikkondensatoren für diese Anwendung nicht geeignet sind. In der Arbeit wurden deshalb Class I Hochspannungs- Vielschicht- Kondensatoren als Speicherbank verwendet, die ein deutlich besseres Verhalten zeigen. Die eingesetzten Halbleiterelemente wurden ebenfalls in einem Testverfahren nahe den späteren Einsatzparametern vermessen. Dabei zeigte sich, dass nur moderne Leistungs-MOSFET´s für diesen Einsatz geeignet sind. Bei den Dioden ergab sich, dass nur Siliziumkarbid (SiC) Schottky Dioden für die Applikation einsetzbar sind. Für die Anwendung sind prinzipiell verschiedene Topologien möglich. Bei näherer Betrachtung zeigt sich jedoch, dass nur die C-C Transfer Anordnung die gewünschten Ergebnisse liefern kann. Diese Topologie wurde realisiert. Sie besteht im Wesentlichen aus einer Speicherbank, die vom Netzteil aufgeladen wird. Aus dieser wird dann die Energie in den Laserkopf über den Schalter transferiert. Aufgrund der hohen Spannungen und Ströme müssen 24 Schaltelemente in Serie und je 4 parallel geschaltet werden. Die Ansteuerung der Schalter wird über hochisolierende „Gate“-Transformatoren erreicht. Es zeigte sich, dass eine sorgfältig ausgelegte dynamische und statische Spannungsteilung für einen sicheren Betrieb notwendig ist. In der Arbeit konnte ein Betrieb mit realer Laserkammer als Last bis 6 kHz realisiert werden, der nur durch die maximal mögliche Repetitionsrate der Laserkammer begrenzt war.

Fliesslochformen und Gewindefurchen in dünne Bleche und Rohre aus Kupfer und Kupferlegierungen

This thesis in Thermal Flow Drilling and Flowtap in thin metal sheet and pipes of copper and copper alloys had as objectives to know the comportment of copper and copper alloys sheet metal during the Thermal Flow Drill processes with normal tools, to know the best Speed and Feed machine data for the best bushing quality, to known the best Speed for Form Tapping processes and to know the best bush long in pure copper pipes for water solar interchange equipment. Thermal Flow Drilling (TFD) and Form Tapping (FT) is one of the research lines of the Institute of Production and Logistics (IPL) at University of Kassel. At December 1995, a work meeting of IPL, Santa Catarina University, Brazil, Buenos Aires University, Argentine, Tarapacá University (UTA), Chile members and the CEO of Flowdrill B.V. was held in Brazil. The group decided that the Manufacturing Laboratory (ML) of UTA would work with pure copper and brass alloys sheet metal and pure copper pipes in order to develop a water interchange solar heater. The Flowdrill BV Company sent tools to Tarapacá University in 1996. In 1999 IPL and the ML carried out an ALECHILE research project promoted by the DAAD and CONICyT in copper sheet metal and copper pipes and sheet metal a-brass alloys. The normal tools are lobed, conical tungsten carbide tool. When rotated at high speed and pressed with high axial force into sheet metal or thin walled tube generated heat softens the metal and allows the drill to feed forward produce a hole and simultaneously form a bushing from the displacement material. In the market exist many features but in this thesis is used short and longs normal tools of TFD. For reach the objectives it was takes as references four qualities of the frayed end bushing, where the best one is the quality class I. It was used pure copper and a-brass alloys sheet metals, with different thickness. It was used different TFD drills diameter for four thread type, from M-5 to M10. Similar to the Aluminium sheet metals studies it was used the predrilling processes with HSS drills around 30% of the TFD diameter (1,5 – 3,0 mm D). In the next step is used only 2,0 mm thick metal sheet, and 9,2 mm TFD diameter for M-10 thread. For the case of pure commercial copper pipes is used for ¾” inch diameter and 12, 8 mm (3/8”) TFD drill for holes for 3/8” pipes and different normal HSS drills for predrilling processes. The chemical sheet metal characteristics were takes as reference for the material behaviour. The Chilean pure copper have 99,35% of Cu and 0,163% of Zinc and the Chilean a-brass alloys have 75,6% of Cu and 24,0% of Zinc. It is used two German a-brass alloys; Nº1 have 61,6% of Cu, 36,03 % of Zinc and 2,2% of Pb and the German a-brass alloys Nº2 have 63,1% of Cu, 36,7% of Zinc and 0% of Pb. The equipments used were a HAAS CNC milling machine centre, a Kistler dynamometer, PC Pentium II, Acquisition card, TESTPOINT and XAct software, 3D measurement machine, micro hardness, universal test machine, and metallographic microscope. During the test is obtained the feed force and momentum curves that shows the material behaviour with TFD processes. In general it is take three phases. It was possible obtain the best machining data for the different sheet of copper and a-brass alloys thick of Chilean materials and bush quality class I. In the case of a-brass alloys, the chemical components and the TFD processes temperature have big influence. The temperature reach to 400º Celsius during the TFD processes and the a-brass alloys have some percents of Zinc the bush quality is class I. But when the a-brass alloys have some percents of Lead who have 200º C melting point is not possible to obtain a bush, because the Lead gasify and the metallographic net broke. During the TFD processes the recrystallization structures occur around the Copper and a-brass alloy bush, who gives more hardness in these zones. When the threads were produce with Form Tapping processes with Flowtap tools, this hardness amount gives a high limit load of the thread when hey are tested in a special support that was developed for it. For eliminated the predrilling processes with normal HSS drills it was developed a compound tool. With this new tool it was possible obtain the best machining data for quality class I bush. For the copper pipes it is made bush without predrilling and the quality class IV was obtained. When it is was used predrilling processes, quality classes I bush were obtained. Then with different HSS drill diameter were obtained different long bush, where were soldering with four types soldering materials between pipes with 3/8” in a big one as ¾”. Those soldering unions were tested by traction test and all the 3/8” pipes broken, and the soldering zone doesn’t have any problem. Finally were developed different solar water interchange heaters and tested. As conclusions, the present Thesis shows that the Thermal Flow Drilling in thinner metal sheets of cooper and cooper alloys needs a predrilling process for frayed end quality class I bushings, similar to thinner sheets of aluminium bushes. The compound tool developed could obtain quality class I bushings and excludes predrilling processes. The bush recrystalization, product of the friction between the tool and the material, the hardness grows and it is advantageous for the Form Tapping. The methodology developed for commercial copper pipes permits to built water solar interchange heaters.

Genotipificación de HLA-B en pacientes colombianos afectados por el síndrome Stevens-Johnson y la Necrólisis Epidérmica Tóxica

Las reacciones alérgicas a medicamentos cutáneas severas (RAM) como el Síndrome Stevens Johnson (SJS) y la Necrólisis Epidérmica Tóxica (NET),caracterizadas por exantema, erosión de la piel y las membranas mucosas, flictenas, desprendimiento de la piel secundario a la muerte de queratinocitos y compromiso ocular. Son infrecuentes en la población pero con elevada morbi-mortalidad, se presentan luego de la administración de diferentes fármacos. En Asia se ha asociado el alelo HLA-B*15:02 como marcador genético para SJS. En Colombia no hay datos de la incidencia de estas RAM, ni de la relación con medicamentos específicos o potenciales y tampoco estudios de aproximación genómica de genes de susceptibilidad.

Revisión sistemática de la literatura para el manejo de dolor central en esclerosis múltiple

El dolor es un síntoma muy común en pacientes con Esclerosis Múltiple, pues del 42 al 65% de los enfermos lo presentan, y es calificado como el síntoma más severo entre el 8 y el 32%. Todos los síndromes dolorosos centrales se presentan por lesión o disfunción del sistema nervioso central, causando discapacidad severa y deterioro de la calidad de vida de los pacientes.