Brain-Computer Interfaces: Desarrollo de un sistema de identificación de estados mentales alfa

En el mundo actual las aplicaciones basadas en sistemas biométricos, es decir, aquellas que miden las señales eléctricas de nuestro organismo, están creciendo a un gran ritmo. Todos estos sistemas incorporan sensores biomédicos, que ayudan a los usuarios a controlar mejor diferentes aspectos de la rutina diaria, como podría ser llevar un seguimiento detallado de una rutina deportiva, o de la calidad de los alimentos que ingerimos. Entre estos sistemas biométricos, los que se basan en la interpretación de las señales cerebrales, mediante ensayos de electroencefalografía o EEG están cogiendo cada vez más fuerza para el futuro, aunque están todavía en una situación bastante incipiente, debido a la elevada complejidad del cerebro humano, muy desconocido para los científicos hasta el siglo XXI. Por estas razones, los dispositivos que utilizan la interfaz cerebro-máquina, también conocida como BCI (Brain Computer Interface), están cogiendo cada vez más popularidad. El funcionamiento de un sistema BCI consiste en la captación de las ondas cerebrales de un sujeto para después procesarlas e intentar obtener una representación de una acción o de un pensamiento del individuo. Estos pensamientos, correctamente interpretados, son posteriormente usados para llevar a cabo una acción. Ejemplos de aplicación de sistemas BCI podrían ser mover el motor de una silla de ruedas eléctrica cuando el sujeto realice, por ejemplo, la acción de cerrar un puño, o abrir la cerradura de tu propia casa usando un patrón cerebral propio. Los sistemas de procesamiento de datos están evolucionando muy rápido con el paso del tiempo. Los principales motivos son la alta velocidad de procesamiento y el bajo consumo energético de las FPGAs (Field Programmable Gate Array). Además, las FPGAs cuentan con una arquitectura reconfigurable, lo que las hace más versátiles y potentes que otras unidades de procesamiento como las CPUs o las GPUs.En el CEI (Centro de Electrónica Industrial), donde se lleva a cabo este TFG, se dispone de experiencia en el diseño de sistemas reconfigurables en FPGAs. Este TFG es el segundo de una línea de proyectos en la cual se busca obtener un sistema capaz de procesar correctamente señales cerebrales, para llegar a un patrón común que nos permita actuar en consecuencia. Más concretamente, se busca detectar cuando una persona está quedándose dormida a través de la captación de unas ondas cerebrales, conocidas como ondas alfa, cuya frecuencia está acotada entre los 8 y los 13 Hz. Estas ondas, que aparecen cuando cerramos los ojos y dejamos la mente en blanco, representan un estado de relajación mental. Por tanto, este proyecto comienza como inicio de un sistema global de BCI, el cual servirá como primera toma de contacto con el procesamiento de las ondas cerebrales, para el posterior uso de hardware reconfigurable sobre el cual se implementarán los algoritmos evolutivos. Por ello se vuelve necesario desarrollar un sistema de procesamiento de datos en una FPGA. Estos datos se procesan siguiendo la metodología de procesamiento digital de señales, y en este caso se realiza un análisis de la frecuencia utilizando la transformada rápida de Fourier, o FFT. Una vez desarrollado el sistema de procesamiento de los datos, se integra con otro sistema que se encarga de captar los datos recogidos por un ADC (Analog to Digital Converter), conocido como ADS1299. Este ADC está especialmente diseñado para captar potenciales del cerebro humano. De esta forma, el sistema final capta los datos mediante el ADS1299, y los envía a la FPGA que se encarga de procesarlos. La interpretación es realizada por los usuarios que analizan posteriormente los datos procesados. Para el desarrollo del sistema de procesamiento de los datos, se dispone primariamente de dos plataformas de estudio, a partir de las cuales se captarán los datos para después realizar el procesamiento: 1. La primera consiste en una herramienta comercial desarrollada y distribuida por OpenBCI, proyecto que se dedica a la venta de hardware para la realización de EEG, así como otros ensayos. Esta herramienta está formada por un microprocesador, un módulo de memoria SD para el almacenamiento de datos, y un módulo de comunicación inalámbrica que transmite los datos por Bluetooth. Además cuenta con el mencionado ADC ADS1299. Esta plataforma ofrece una interfaz gráfica que sirve para realizar la investigación previa al diseño del sistema de procesamiento, al permitir tener una primera toma de contacto con el sistema. 2. La segunda plataforma consiste en un kit de evaluación para el ADS1299, desde la cual se pueden acceder a los diferentes puertos de control a través de los pines de comunicación del ADC. Esta plataforma se conectará con la FPGA en el sistema integrado. Para entender cómo funcionan las ondas más simples del cerebro, así como saber cuáles son los requisitos mínimos en el análisis de ondas EEG se realizaron diferentes consultas con el Dr Ceferino Maestu, neurofisiólogo del Centro de Tecnología Biomédica (CTB) de la UPM. Él se encargó de introducirnos en los distintos procedimientos en el análisis de ondas en electroencefalogramas, así como la forma en que se deben de colocar los electrodos en el cráneo. Para terminar con la investigación previa, se realiza en MATLAB un primer modelo de procesamiento de los datos. Una característica muy importante de las ondas cerebrales es la aleatoriedad de las mismas, de forma que el análisis en el dominio del tiempo se vuelve muy complejo. Por ello, el paso más importante en el procesamiento de los datos es el paso del dominio temporal al dominio de la frecuencia, mediante la aplicación de la transformada rápida de Fourier o FFT (Fast Fourier Transform), donde se pueden analizar con mayor precisión los datos recogidos. El modelo desarrollado en MATLAB se utiliza para obtener los primeros resultados del sistema de procesamiento, el cual sigue los siguientes pasos. 1. Se captan los datos desde los electrodos y se escriben en una tabla de datos. 2. Se leen los datos de la tabla. 3. Se elige el tamaño temporal de la muestra a procesar. 4. Se aplica una ventana para evitar las discontinuidades al principio y al final del bloque analizado. 5. Se completa la muestra a convertir con con zero-padding en el dominio del tiempo. 6. Se aplica la FFT al bloque analizado con ventana y zero-padding. 7. Los resultados se llevan a una gráfica para ser analizados. Llegados a este punto, se observa que la captación de ondas alfas resulta muy viable. Aunque es cierto que se presentan ciertos problemas a la hora de interpretar los datos debido a la baja resolución temporal de la plataforma de OpenBCI, este es un problema que se soluciona en el modelo desarrollado, al permitir el kit de evaluación (sistema de captación de datos) actuar sobre la velocidad de captación de los datos, es decir la frecuencia de muestreo, lo que afectará directamente a esta precisión. Una vez llevado a cabo el primer procesamiento y su posterior análisis de los resultados obtenidos, se procede a realizar un modelo en Hardware que siga los mismos pasos que el desarrollado en MATLAB, en la medida que esto sea útil y viable. Para ello se utiliza el programa XPS (Xilinx Platform Studio) contenido en la herramienta EDK (Embedded Development Kit), que nos permite diseñar un sistema embebido. Este sistema cuenta con: Un microprocesador de tipo soft-core llamado MicroBlaze, que se encarga de gestionar y controlar todo el sistema; Un bloque FFT que se encarga de realizar la transformada rápida Fourier; Cuatro bloques de memoria BRAM, donde se almacenan los datos de entrada y salida del bloque FFT y un multiplicador para aplicar la ventana a los datos de entrada al bloque FFT; Un bus PLB, que consiste en un bus de control que se encarga de comunicar el MicroBlaze con los diferentes elementos del sistema. Tras el diseño Hardware se procede al diseño Software utilizando la herramienta SDK(Software Development Kit).También en esta etapa se integra el sistema de captación de datos, el cual se controla mayoritariamente desde el MicroBlaze. Por tanto, desde este entorno se programa el MicroBlaze para gestionar el Hardware que se ha generado. A través del Software se gestiona la comunicación entre ambos sistemas, el de captación y el de procesamiento de los datos. También se realiza la carga de los datos de la ventana a aplicar en la memoria correspondiente. En las primeras etapas de desarrollo del sistema, se comienza con el testeo del bloque FFT, para poder comprobar el funcionamiento del mismo en Hardware. Para este primer ensayo, se carga en la BRAM los datos de entrada al bloque FFT y en otra BRAM los datos de la ventana aplicada. Los datos procesados saldrán a dos BRAM, una para almacenar los valores reales de la transformada y otra para los imaginarios. Tras comprobar el correcto funcionamiento del bloque FFT, se integra junto al sistema de adquisición de datos. Posteriormente se procede a realizar un ensayo de EEG real, para captar ondas alfa. Por otro lado, y para validar el uso de las FPGAs como unidades ideales de procesamiento, se realiza una medición del tiempo que tarda el bloque FFT en realizar la transformada. Este tiempo se compara con el tiempo que tarda MATLAB en realizar la misma transformada a los mismos datos. Esto significa que el sistema desarrollado en Hardware realiza la transformada rápida de Fourier 27 veces más rápido que lo que tarda MATLAB, por lo que se puede ver aquí la gran ventaja competitiva del Hardware en lo que a tiempos de ejecución se refiere. En lo que al aspecto didáctico se refiere, este TFG engloba diferentes campos. En el campo de la electrónica:  Se han mejorado los conocimientos en MATLAB, así como diferentes herramientas que ofrece como FDATool (Filter Design Analysis Tool).  Se han adquirido conocimientos de técnicas de procesado de señal, y en particular, de análisis espectral.  Se han mejorado los conocimientos en VHDL, así como su uso en el entorno ISE de Xilinx.  Se han reforzado los conocimientos en C mediante la programación del MicroBlaze para el control del sistema.  Se ha aprendido a crear sistemas embebidos usando el entorno de desarrollo de Xilinx usando la herramienta EDK (Embedded Development Kit). En el campo de la neurología, se ha aprendido a realizar ensayos EEG, así como a analizar e interpretar los resultados mostrados en el mismo. En cuanto al impacto social, los sistemas BCI afectan a muchos sectores, donde destaca el volumen de personas con discapacidades físicas, para los cuales, este sistema implica una oportunidad de aumentar su autonomía en el día a día. También otro sector importante es el sector de la investigación médica, donde los sistemas BCIs son aplicables en muchas aplicaciones como, por ejemplo, la detección y estudio de enfermedades cognitivas.

O DINHEIRO E O SAGRADO Uma leitura das interfaces de fenômenos culturais, religiosos e econômicos e de seus reflexos existenciais, à luz das Ciências Sociais e da Psicologia Analítica

Esta tese é o resultado de uma pesquisa sobre o uso e a influência do dinheiro no que tange às questões existenciais, no contexto capitalista, ligadas ao trinômio: saúde, amor e espiritualidade. Para isso, foram analisados vários tipos de vínculo, afetivos ou não, existentes nas relações humanas, no âmbito da família, do mercado e do Estado, convergindo para a busca do sagrado que dá sentido e significado existenciais. O eixo teórico se localiza em uma interface entre as Ciências Sociais e a Psicologia Analítica, de Carl Gustav Jung (1875-1961), que expressa em sua obra a necessidade humana de encontrar a realização do ser pela conquista consciente de um estado de integração evolutiva. Esta dimensão integral existe quando é realizada a unificação dos vários aspectos do eu com o inconsciente, expressos teleologicamente no processo de individuação. O resultado da evolução científica e tecnológica, acrescido pela supremacia do mercado, abrange praticamente todas as esferas da vida humana, imprimindo uma importância excessiva ao dinheiro. Por exemplo, até o campo religioso foi invadido pela lógica monetária, que se instalou impondo uma atitude monetarizada nas práticas e ritos religiosos, como ocorre em algumas igrejas neopentecostais. Por sua vez, a supervalorização do dinheiro contribui para um processo que combina dessacralização e exclusão social, bem como para o aumento significativo de doenças em todas as instâncias em que as trocas deixaram de acontecer livremente. Com a interdição das trocas, a vida se esvai, comprometendo a evolução humana nas instâncias físicas, psíquicas, sociais, espirituais, familiares, afetivas ou profissionais. Como os desejos de lucro e de acúmulo impedem as trocas, a conquista da dimensão integral vai ficando sombreada até ser substituída pela anestesia do consumo, no sentido de aliviar, apesar de não eliminar, os sentimentos de angústia pela falta de sentido existencial. Busca-se neste trabalho o entendimento da razão pela qual o ser humano contemporâneo deixou de trocar livremente e passou a acumular, muitas vezes por meio de consumo do supérfluo, ficando à mercê de um mercado que pretende ser hegemônico, colocando inclusive o dinheiro como caminho de cura e salvação. Fizemos um levantamento das possibilidades que podem restar para a concretização de uma readequação do uso do dinheiro a serviço da individuação e da realização existencial.(AU)

O DINHEIRO E O SAGRADO Uma leitura das interfaces de fenômenos culturais, religiosos e econômicos e de seus reflexos existenciais, à luz das Ciências Sociais e da Psicologia Analítica

Esta tese é o resultado de uma pesquisa sobre o uso e a influência do dinheiro no que tange às questões existenciais, no contexto capitalista, ligadas ao trinômio: saúde, amor e espiritualidade. Para isso, foram analisados vários tipos de vínculo, afetivos ou não, existentes nas relações humanas, no âmbito da família, do mercado e do Estado, convergindo para a busca do sagrado que dá sentido e significado existenciais. O eixo teórico se localiza em uma interface entre as Ciências Sociais e a Psicologia Analítica, de Carl Gustav Jung (1875-1961), que expressa em sua obra a necessidade humana de encontrar a realização do ser pela conquista consciente de um estado de integração evolutiva. Esta dimensão integral existe quando é realizada a unificação dos vários aspectos do eu com o inconsciente, expressos teleologicamente no processo de individuação. O resultado da evolução científica e tecnológica, acrescido pela supremacia do mercado, abrange praticamente todas as esferas da vida humana, imprimindo uma importância excessiva ao dinheiro. Por exemplo, até o campo religioso foi invadido pela lógica monetária, que se instalou impondo uma atitude monetarizada nas práticas e ritos religiosos, como ocorre em algumas igrejas neopentecostais. Por sua vez, a supervalorização do dinheiro contribui para um processo que combina dessacralização e exclusão social, bem como para o aumento significativo de doenças em todas as instâncias em que as trocas deixaram de acontecer livremente. Com a interdição das trocas, a vida se esvai, comprometendo a evolução humana nas instâncias físicas, psíquicas, sociais, espirituais, familiares, afetivas ou profissionais. Como os desejos de lucro e de acúmulo impedem as trocas, a conquista da dimensão integral vai ficando sombreada até ser substituída pela anestesia do consumo, no sentido de aliviar, apesar de não eliminar, os sentimentos de angústia pela falta de sentido existencial. Busca-se neste trabalho o entendimento da razão pela qual o ser humano contemporâneo deixou de trocar livremente e passou a acumular, muitas vezes por meio de consumo do supérfluo, ficando à mercê de um mercado que pretende ser hegemônico, colocando inclusive o dinheiro como caminho de cura e salvação. Fizemos um levantamento das possibilidades que podem restar para a concretização de uma readequação do uso do dinheiro a serviço da individuação e da realização existencial.(AU)

A Comunicação Mediada por Interfaces Digitais: a interação humana com os jogos digitais em celulares.

O trabalho é um estudo exploratório sobre o processamento de mensagens de entretenimento. O objetivo do trabalho foi propor e testar um modelo de processamento de mensagens dedicado à compreensão de jogos digitais. Para realizar tal tarefa realizou-se um extenso levantamento de técnicas de observação de usuários diante de softwares e mídias, para conhecer as qualidades e limitações de cada uma dessas técnicas, bem como de sua abordagem do problema. Também foi realizado um levantamento dos modelos de processamento de mensagens nas mídias tradicionais e nas novas mídias. Com isso foi possível propor um novo modelo de análise de processamento de mensagens de entretenimento. Uma vez criado o modelo teórico, fez-se preciso testar se os elementos propostos como participantes desse processo estavam corretos e se seriam capazes de capturar adequadamente as semelhanças e diferenças entre a interação entre jogadores e as diferentes mídias. Por essa razão, estruturou-se uma ferramenta de coleta de dados, que foi validada junto a designers de jogos digitais, uma vez que esses profissionais conhecem o processo de criação de um jogo, seus elementos e objetivos. Posteriormente, foi feito um primeiro teste, junto a praticantes de jogos digitais de diversas idades em computadores pessoais e TV digital interativa, a fim e verificar como os elementos do modelo relacionavam-se entre si. O teste seguinte fez a coleta de dados de praticantes de jogos digitais em aparelhos celulares, tendo como objetivo capturar como se dá a formação de uma experiência através do processamento da mensagem de entretenimento num meio cujas limitações são inúmeras: tamanho de tela e teclas, para citar algumas delas. Como resultado, verificou-se, por meio de testes estatísticos, que jogos praticados em meios como computadores pessoais atraem mais por seus aspectos estéticos, enquanto a apreciação de um jogo em aparelhos celulares depende muito mais de sua habilidade de manter a interação que um jogo praticado em PC. Com isso conclui-se que o processamento das mensagens de entretenimento depende da capacidade dos seus criadores em entender os limites de cada meio e usar adequadamente os elementos que compõe o ambiente de um jogo, para conseguir levar à apreciação do mesmo.(AU)

A Comunicação Mediada por Interfaces Digitais: a interação humana com os jogos digitais em celulares.

O trabalho é um estudo exploratório sobre o processamento de mensagens de entretenimento. O objetivo do trabalho foi propor e testar um modelo de processamento de mensagens dedicado à compreensão de jogos digitais. Para realizar tal tarefa realizou-se um extenso levantamento de técnicas de observação de usuários diante de softwares e mídias, para conhecer as qualidades e limitações de cada uma dessas técnicas, bem como de sua abordagem do problema. Também foi realizado um levantamento dos modelos de processamento de mensagens nas mídias tradicionais e nas novas mídias. Com isso foi possível propor um novo modelo de análise de processamento de mensagens de entretenimento. Uma vez criado o modelo teórico, fez-se preciso testar se os elementos propostos como participantes desse processo estavam corretos e se seriam capazes de capturar adequadamente as semelhanças e diferenças entre a interação entre jogadores e as diferentes mídias. Por essa razão, estruturou-se uma ferramenta de coleta de dados, que foi validada junto a designers de jogos digitais, uma vez que esses profissionais conhecem o processo de criação de um jogo, seus elementos e objetivos. Posteriormente, foi feito um primeiro teste, junto a praticantes de jogos digitais de diversas idades em computadores pessoais e TV digital interativa, a fim e verificar como os elementos do modelo relacionavam-se entre si. O teste seguinte fez a coleta de dados de praticantes de jogos digitais em aparelhos celulares, tendo como objetivo capturar como se dá a formação de uma experiência através do processamento da mensagem de entretenimento num meio cujas limitações são inúmeras: tamanho de tela e teclas, para citar algumas delas. Como resultado, verificou-se, por meio de testes estatísticos, que jogos praticados em meios como computadores pessoais atraem mais por seus aspectos estéticos, enquanto a apreciação de um jogo em aparelhos celulares depende muito mais de sua habilidade de manter a interação que um jogo praticado em PC. Com isso conclui-se que o processamento das mensagens de entretenimento depende da capacidade dos seus criadores em entender os limites de cada meio e usar adequadamente os elementos que compõe o ambiente de um jogo, para conseguir levar à apreciação do mesmo.(AU)

AS INTERFACES DA PROMOÇÃO DA SAÚDE E UM PROGRAMA DE APRENDIZAGEM PROFISSIONAL

O trabalho desenvolvido com adolescentes, pensando na promoção de sua saúde, bem como em seu desenvolvimento saudável por meio de espaços que atendam suas necessidades, tem sido de responsabilidade também de organizações sociais. Em especial, quando se tem o objetivo de prepará- los para o mundo do trabalho, porém com uma proposta mais ampla, ou seja, como uma preparação para suas relações na vida, pela passagem de um processo de aprendizagem, de amadurecimento, por meio da construção de ações significativas para vida. Esta é a proposta do Centro de Orientação ao Adolescente de Campinas COMEC , organização não governamental, que conta com um Progr ama de Aprendizagem Profissional- PAP . Sendo assim, esse estudo tem como objetivo caracterizar, por meio de prontuários, uma amostra de 280 adolescentes, compreender a percepção deles no processo vivido e identificar as expectativas na admissão, demissão e desligamento do programa - PAP. A pesquisa teve como participantes adolescentes de 14 a 17 anos, do gênero feminino e masculino, do ensino fundamental e médio (7ª série E.F até 3ª série E.M). Os formulários foram preenchidos em três momentos: primeiro quando o adolescente participava da seleção para ingressar no programa, segundo, quando ele iniciava o trabalho na empresa e no término do contrato do adolescente com o programa. Os resultados obtidos por meio dos prontuários dos adolescentes mostraram que a percepção que eles têm a respeito do programa é positiva. Perceberam-se sentimentos de medo, insegurança, alegrias e desejos a respeito das atividades que os preparam para a inserção no mercado formal de trabalho, e o quanto o acompanhamento pelo programa permite outro olhar para esta inclusão. Ainda que o trabalho juvenil não seja a solução para as necessidades econômicas de muitas famílias, o trabalho educativo tem sido visto como uma forma de permitir que o adolescente vivencie sua primeira experiência de trabalho, respeitando sua condição de pessoa em desenvolvimento. Porém, em alguns casos, acabam por contribuir de forma significativa no orçamento familiar.(AU)

AS INTERFACES DA PROMOÇÃO DA SAÚDE E UM PROGRAMA DE APRENDIZAGEM PROFISSIONAL

O trabalho desenvolvido com adolescentes, pensando na promoção de sua saúde, bem como em seu desenvolvimento saudável por meio de espaços que atendam suas necessidades, tem sido de responsabilidade também de organizações sociais. Em especial, quando se tem o objetivo de prepará- los para o mundo do trabalho, porém com uma proposta mais ampla, ou seja, como uma preparação para suas relações na vida, pela passagem de um processo de aprendizagem, de amadurecimento, por meio da construção de ações significativas para vida. Esta é a proposta do Centro de Orientação ao Adolescente de Campinas COMEC , organização não governamental, que conta com um Progr ama de Aprendizagem Profissional- PAP . Sendo assim, esse estudo tem como objetivo caracterizar, por meio de prontuários, uma amostra de 280 adolescentes, compreender a percepção deles no processo vivido e identificar as expectativas na admissão, demissão e desligamento do programa - PAP. A pesquisa teve como participantes adolescentes de 14 a 17 anos, do gênero feminino e masculino, do ensino fundamental e médio (7ª série E.F até 3ª série E.M). Os formulários foram preenchidos em três momentos: primeiro quando o adolescente participava da seleção para ingressar no programa, segundo, quando ele iniciava o trabalho na empresa e no término do contrato do adolescente com o programa. Os resultados obtidos por meio dos prontuários dos adolescentes mostraram que a percepção que eles têm a respeito do programa é positiva. Perceberam-se sentimentos de medo, insegurança, alegrias e desejos a respeito das atividades que os preparam para a inserção no mercado formal de trabalho, e o quanto o acompanhamento pelo programa permite outro olhar para esta inclusão. Ainda que o trabalho juvenil não seja a solução para as necessidades econômicas de muitas famílias, o trabalho educativo tem sido visto como uma forma de permitir que o adolescente vivencie sua primeira experiência de trabalho, respeitando sua condição de pessoa em desenvolvimento. Porém, em alguns casos, acabam por contribuir de forma significativa no orçamento familiar.(AU)

Targeting Gβγ signaling in arterial vascular smooth muscle proliferation: A novel strategy to limit restenosis

Restenosis continues to be a major problem limiting the effectiveness of revascularization procedures. To date, the roles of heterotrimeric G proteins in the triggering of pathological vascular smooth muscle (VSM) cell proliferation have not been elucidated. βγ subunits of heterotrimeric G proteins (Gβγ) are known to activate mitogen-activated protein (MAP) kinases after stimulation of certain G protein-coupled receptors; however, their relevance in VSM mitogenesis in vitro or in vivo is not known. Using adenoviral-mediated transfer of a transgene encoding a peptide inhibitor of Gβγ signaling (βARKct), we evaluated the role of Gβγ in MAP kinase activation and proliferation in response to several mitogens, including serum, in cultured rat VSM cells. Our results include the striking finding that serum-induced proliferation of VSM cells in vitro is mediated largely via Gβγ. Furthermore, we studied the effects of in vivo adenoviral-mediated βARKct gene transfer on VSM intimal hyperplasia in a rat carotid artery restenosis model. Our in vivo results demonstrated that the presence of the βARKct in injured rat carotid arteries significantly reduced VSM intimal hyperplasia by 70%. Thus, Gβγ plays a critical role in physiological VSM proliferation, and targeted Gβγ inhibition represents a novel approach for the treatment of pathological conditions such as restenosis.

20-Hydroxyeicosatetraenoic acid mediates calcium/calmodulin-dependent protein kinase II-induced mitogen-activated protein kinase activation in vascular smooth muscle cells

Norepinephrine (NE) and angiotensin II (Ang II), by promoting extracellular Ca2+ influx, increase Ca2+/calmodulin-dependent kinase II (CaMKII) activity, leading to activation of mitogen-activated protein kinase (MAPK) and cytosolic phospholipase A2 (cPLA2), resulting in release of arachidonic acid (AA) for prostacyclin synthesis in rabbit vascular smooth muscle cells. However, the mechanism by which CaMKII activates MAPK is unclear. The present study was conducted to determine the contribution of AA and its metabolites as possible mediators of CaMKII-induced MAPK activation by NE, Ang II, and epidermal growth factor (EGF) in vascular smooth muscle cells. NE-, Ang II-, and EGF-stimulated MAPK and cPLA2 were reduced by inhibitors of cytochrome P450 (CYP450) and lipoxygenase but not by cyclooxygenase. NE-, Ang II-, and EGF-induced increases in Ras activity, measured by its translocation to plasma membrane, were abolished by CYP450, lipoxygenase, and farnesyltransferase inhibitors. An AA metabolite of CYP450, 20-hydroxyeicosatetraenoic acid (20-HETE), increased the activities of MAPK and cPLA2 and caused translocation of Ras. These data suggest that activation of MAPK by NE, Ang II, and EGF is mediated by a signaling mechanism involving 20-HETE, which is generated by stimulation of cPLA2 by CaMKII. Activation of Ras/MAPK by 20-HETE amplifies cPLA2 activity and releases additional AA by a positive feedback mechanism. This mechanism of Ras/MAPK activation by 20-HETE may play a central role in the regulation of other cellular signaling molecules involved in cell proliferation and growth.

Characterization of the α1B-adrenergic receptor gene promoter region and hypoxia regulatory elements in vascular smooth muscle

We previously demonstrated that α1B-adrenergic receptor (AR) gene transcription, mRNA, and functionally coupled receptors increase during 3% O2 exposure in aorta, but not in vena cava smooth muscle cells (SMC). We report here that α1BAR mRNA also increases during hypoxia in liver and lung, but not heart and kidney. A single 2.7-kb α1BAR mRNA was detected in aorta and vena cava during normoxia and hypoxia. The α1BAR 5′ flanking region was sequenced to −2,460 (relative to ATG +1). Transient transfection experiments identify the minimal promoter region between −270 and −143 and sequence between −270 and −248 that are required for transcription of the α1BAR gene in aorta and vena cava SMC during normoxia and hypoxia. An ATTAAA motif within this sequence specifically binds aorta, vena cava, and DDT1MF-2 nuclear proteins, and transcription primarily initiates downstream of this motif at approximately −160 in aorta SMC. Sequence between −837 and −273 conferred strong hypoxic induction of transcription in aorta, but not in vena cava SMC, whereas the cis-element for the transcription factor, hypoxia-inducible factor 1, conferred hypoxia-induced transcription in both aorta and vena cava SMC. These data identify sequence required for transcription of the α1BAR gene in vascular SMC and suggest the atypical TATA-box, ATTAAA, may mediate this transcription. Hypoxia-sensitive regions of the α1BAR gene also were identified that may confer the differential hypoxic increase in α1BAR gene transcription in aorta, but not in vena cava SMC.

Smooth particle hydrodynamics study of surface defect machining for diamond turning of silicon

Acknowledgments The authors would like to thank EPSRC (EP/ K018345/1) and Royal Society-NSFC International Exchange Scheme for providing financial support to this research.

Both N-terminal myosin-binding and C-terminal actin-binding sites on smooth muscle caldesmon are required for caldesmon-mediated inhibition of actin filament velocity

It has been suggested that the tethering caused by binding of the N-terminal region of smooth muscle caldesmon (CaD) to myosin and its C-terminal region to actin contributes to the inhibition of actin-filament movement over myosin heads in an in vitro motility assay. However, direct evidence for this assumption has been lacking. In this study, analysis of baculovirus-generated N-terminal and C-terminal deletion mutants of chicken-gizzard CaD revealed that the major myosin-binding site on the CaD molecule resides in a 30-amino acid stretch between residues 24 and 53, based on the very low level of binding of CaDΔ24–53 lacking the residues 24–53 to myosin compared with the level of binding of CaDΔ54–85 missing the adjacent residues 54–85 or of the full-length CaD. As expected, deletion of the region between residues 24 and 53 or between residues 54 and 85 had no effect on either actin-binding or inhibition of actomyosin ATPase activity. Deletion of residues 24–53 nearly abolished the ability of CaD to inhibit actin filament velocity in the in vitro motility experiments, whereas CaDΔ54–85 strongly inhibited actin filament velocity in a manner similar to that of full-length CaD. Moreover, CaD1–597, which lacks the major actin-binding site(s), did not inhibit actin-filament velocity despite the presence of the major myosin-binding site. These data provide direct evidence for the inhibition of actin filament velocity in the in vitro motility assay caused by the tethering of myosin to actin through binding of both the CaD N-terminal region to myosin and the C-terminal region to actin.

Smooth muscle myosin mutants containing a single tryptophan reveal molecular interactions at the actin-binding interface

Elucidation of the molecular details of the cyclic actomyosin interaction requires the ability to examine structural changes at specific sites in the actin-binding interface of myosin. To study these changes dynamically, we have expressed two mutants of a truncated fragment of chicken gizzard smooth muscle myosin, which includes the motor domain and essential light chain (MDE). These mutants were engineered to contain a single tryptophan at (Trp-546) or near (Trp-625) the putative actin-binding interface. Both 546- and 625-MDE exhibited actin-activated ATPase and actin-binding activities similar to wild-type MDE. Fluorescence emission spectra and acrylamide quenching of 546- and 625-MDE suggest that Trp-546 is nearly fully exposed to solvent and Trp-625 is less than 50% exposed in the presence and absence of ATP, in good agreement with the available crystal structure data. The spectrum of 625-MDE bound to actin was quite similar to the unbound spectrum indicating that, although Trp-625 is located near the 50/20-kDa loop and the 50-kDa cleft of myosin, its conformation does not change upon actin binding. However, a 10-nm blue shift in the peak emission wavelength of 546-MDE observed in the presence of actin indicates that Trp-546, located in the A-site of the lower 50-kDa subdomain of myosin, exists in a more buried environment and may directly interact with actin in the rigor acto-S1 complex. This change in the spectrum of Trp-546 constitutes direct evidence for a specific molecular interaction between residues in the A-site of myosin and actin.

Slow cycling of unphosphorylated myosin is inhibited by calponin, thus keeping smooth muscle relaxed

A key unanswered question in smooth muscle biology is whether phosphorylation of the myosin regulatory light chain (RLC) is sufficient for regulation of contraction, or if thin-filament-based regulatory systems also contribute to this process. To address this issue, the endogenous RLC was extracted from single smooth muscle cells and replaced with either a thiophosphorylated RLC or a mutant RLC (T18A/S19A) that cannot be phosphorylated by myosin light chain kinase. The actin-binding protein calponin was also extracted. Following photolysis of caged ATP, cells without calponin that contained a nonphosphorylatable RLC shortened at 30% of the velocity and produced 65% of the isometric force of cells reconstituted with the thiophosphorylated RLC. The contraction of cells reconstituted with nonphosphorylatable RLC was, however, specifically suppressed in cells that contained calponin. These results indicate that calponin is required to maintain cells in a relaxed state, and that in the absence of this inhibition, dephosphorylated cross-bridges can slowly cycle and generate force. These findings thus provide a possible framework for understanding the development of latch contraction, a widely studied but poorly understood feature of smooth muscle.

Identification of protein–protein interfaces by decreased amide proton solvent accessibility

Matrix-assisted laser desorption ionization–time-of-flight mass spectrometry was used to identify peptic fragments from protein complexes that retained deuterium under hydrogen exchange conditions due to decreased solvent accessibility at the interface of the complex. Short deuteration times allowed preferential labeling of rapidly exchanging surface amides so that primarily solvent accessibility changes and not conformational changes were detected. A single mass spectrum of the peptic digest mixture was analyzed to determine the deuterium content of all proteolytic fragments of the protein. The protein–protein interface was reliably indicated by those peptides that retained more deuterons in the complex compared with control experiments in which only one protein was present. The method was used to identify the kinase inhibitor [PKI(5–24)] and ATP-binding sites in the cyclic-AMP-dependent protein kinase. Three overlapping peptides identified the ATP-binding site, three overlapping peptides identified the glycine-rich loop, and two peptides identified the PKI(5–24)-binding site. A complex of unknown structure also was analyzed, human α-thrombin bound to an 83-aa fragment of human thrombomodulin [TMEGF(4–5)]. Five peptides from thrombin showed significantly decreased solvent accessibility in the complex. Three peptides identified the anion-binding exosite I, confirming ligand competition experiments. Two peptides identified a new region of thrombin near the active site providing a potential mechanism of how thrombomodulin alters thrombin substrate specificity.