Otimização automática de aplicações web usando templates client-side

O crescente poder computacional dos dispositivos móveis e a maior eficiência dos navegadores fomentam a construção de aplicações Web mais rápidas e fluídas, através da troca assíncrona de dados em vez de páginas HTML completas. A OutSystems Platform é um ambiente de desenvolvimento usado para a construção rápida e validada de aplicaçõesWeb, que integra numa só linguagem a construção de interfaces de utilizador, lógica da aplicação e modelo de dados. O modelo normal de interação cliente-servidor da plataforma é coerente com o ciclo completo de pedido-resposta, embora seja possível implementar, de forma explícita, aplicações assíncronas. Neste trabalho apresentamos um modelo de separação, baseado em análise estática sobre a definição de uma aplicação, entre os dados apresentados nas páginas geradas pela plataforma e o código correspondente à sua estrutura e apresentação. Esta abordagem permite a geração automática e transparente de interfaces de utilizador mais rápidas e fluídas, a partir do modelo de uma aplicação OutSystems. O modelo apresentado, em conjunto com a análise estática, permite identificar o subconjunto mínimo dos dados a serem transmitidos na rede para a execução de uma funcionalidade no servidor, e isolar a execução de código no cliente. Como resultado da utilização desta abordagem obtém-se uma diminuição muito significativa na transmissão de dados, e possivelmente uma redução na carga de processamento no servidor, dado que a geração das páginasWeb é delegada no cliente, e este se torna apto para executar código. Este modelo é definido sobre uma linguagem, inspirada na da plataforma OutSystems, a partir da qual é implementado um gerador de código. Neste contexto, uma linguagem de domínio específico cria uma camada de abstração entre a definição do modelo de uma aplicação e o respetivo código gerado, tornando transparente a criação de templates clientside e o código executado no cliente e no servidor.

Distribuição espacial e características dos criadouros de Aedes albopictus e Aedes aegypti em Fortaleza, Estado do Ceará

INTRODUÇÃO: desde seu registro, em 2005, no município de Fortaleza, o Aedes albopictus tem exibido uma rápida dispersão. Um estudo visando à identificação das áreas de sua ocorrência, os seus criadouros e a associação com Aedes aegypti e outros culicídeos foi realizado durante o ano de 2008. MÉTODOS: foram coletadas, de janeiro a julho de 2008, amostras de formas imaturas de culicídeos provenientes de imóveis situados nos bairros de Fortaleza, ressaltando-se algumas características dos criadouros, tais como localização (intradomicílio ou peridomicílio), presença de cobertura (proteção contra a incidência de raios solares e chuva), turbidez da água (água límpida e não límpida), material constituinte, volume, altura em relação ao nível do solo e presença simultânea de diferentes espécies de culicídeos no mesmo criadouro. RESULTADOS: a localização no intradomicílio foi um fator importante para os criadouros do Aedes albopictus [RP=0,52 IC95% (0,33-0,81)], por outro lado, a turbidez da água e a cobertura do depósito não se mostraram como diferenciadores para a infestação [p>0,05]. Para o Aedes aegypti a ausência de turbidez da água foi significativa para a infestação nos criadouros [RP=1,14 IC95% (1,06-1,22)]. CONCLUSÕES: a ausência de uma das espécies nos criadouros favorecia sua infestação por outra; criadouros não infestados por Aedes albopictus tinham uma prevalência de infestação de 2,05 [IC95%1,72-2,44] vezes maior pelo Aedes aegypti. Não houve associação significativa entre volume e altura do criadouro e infestação por ambas as espécies. As duas espécies encontram-se dispersas por todo o município, ocupando os mais diversos tipos de criadouros. No entanto, pode-se identificar uma ligeira separação física, com uma infestação maior do Aedes albopictus no peridomicílio.

Hepatite C e gestação: análise de fatores associados à transmissão vertical

INTRODUÇÃO: Informações sobre hepatite C durante a gestação em serviços brasileiros são escassas. O objetivo deste estudo foi verificar os fatores associados à transmissão vertical do vírus da hepatite C em gestantes. MÉTODOS: Estudo observacional, transversal, realizado em gestantes procedentes do município de Campo Grande/MS, que apresentaram sorologia reagente e confirmada para VHC, no período de 2002 a 2005. Considerou-se transmissão vertical sorologia VHC positiva por ELISA, confirmada com PCR, após os 18 meses de vida do recém-nascido. Considerou-se fatores associados a TV: tipo de parto, tempo de rotura de membranas, amamentação, histórico de transfusões sanguíneas prévias, uso de drogas ilícitas, número de parceiros sexuais e presença de tatuagens pelo corpo. RESULTADOS: Identificou-se 58 gestantes portadoras do VHC, revelando prevalência de infecção de 0,2% (58/31.187). Das 58 pacientes, 23 (39,6%) preencheram os critérios de inclusão no estudo. A taxa de TV foi de 13% (3/23), sendo os subtipos virais mais frequentes: 1a (53%), 1b (30%), 2b (4%) e 3a (13%). Duas (8,7%) pacientes apresentaram co-infecção pelo HIV. Houve associação (p < 0,05) entre TV e carga viral elevada (> 2,5x10(6)) e entre TV e uso de drogas ilícitas pela mãe (p < 0,05). CONCLUSÕES: O presente estudo demonstra que elevada viremia materna e o uso de drogas ilícitas pela mãe associam-se a transmissão materno-fetal do VHC.

Produção e caracterização de espumas 3D obtidas por electrofiação para aplicação em engenharia de tecidos

A produção de estruturas tridimensionais poliméricas tem sido foco de estudo por parte da Engenharia de Células e Tecidos, pelo que mimetizam melhor as condições in vivo dos tecidos. A conjugação das propriedades eléctricas com arquitectura 3D permite uma regeneração tecidual mais eficaz. Desta forma este estudo incidiu na construção de scaffolds, que conjugasse as propriedades mecânicas, eléctricas e biológicas num só suporte. O processo utilizado para produção de scaffolds baseou-se na electrofiação de soluções poliméricas de PCL (8% m/m) com incorporação de óxido de grafeno em diferentes concentrações: 0.01%, 0.1% e 0.25% (m/V). Foram avaliados os parâmetros de electrofiação que permitiram a organização tridimensional. A composição química e a morfologia das membranas foram avaliadas por FTIR-ATR e por microscopia electrónica de varrimento (MEV), respectivamente. Através de ensaios de tracção e de permeabilidade estudou-se a influência de óido de grafeno na matriz polimérica. Foram feitas experiências de redução de óxido de grafeno nas fibras electrofiadas, tanto nas membranas como das espumas, através do uso de vapores de hidrazina. Este mecanismo mostrou-se ineficaz, uma vez que afectou a sua morfologia. As espumas foram avaliadas quanto à sua bioactividade e propriedades mecânicas (ensaios de compressão). Também foram realizados testes de viabilidade celular nas membranas e de adesão celular nas espumas, de forma a avaliar o seu potencial para aplicação biomédica. Os resultados destes ensaios revelaram que óxido de grafeno não apresenta efeitos citotóxicos para o organismo e a sua presença promove a adesão celular ao scaffold.

Contribuição para o estudo de um sistema integrado de abastecimento de água e tratamento de água residual doméstica. Caso de estudo: Cidade da Praia

O problema de escassez de água em muitas regiões do globo acompanhado do acelerado crescimento da população e das decorrentes alterações climáticas, constituem um conjunto de preocupações ligadas à gestão dos recursos hídricos, principalmente no que diz respeito à satisfação das necessidades de consumo quer em termos quantitativos, quer em termos qualitativos. Tanto o abastecimento de água para o consumo humano, como a descarga e reutilização de águas residuais urbanas, requerem, à priori, um conjunto de processos e operações de tratamento tanto mais exigentes quanto maior o nível de qualidade final pretendido, tendo sempre em consideração aspectos como a saúde e a exposição humana como também o tipo de actividade a que se destina a água. Com o presente trabalho pretende-se dar um contributo para a avaliação da viabilidade de implementação de um sistema integrado de abastecimento de água e de tratamento de águas residuais domésticas na cidade da Praia, em Cabo Verde, tendo por base a situação actual, e um ano horizonte de 20 anos (2015 a 2035). Cabo Verde é um país com sérios problemas no que se refere aos recursos hídricos uma vez que carece de chuva e de reservas de águas subterrâneas. Circundado pelo mar, quase a totalidade dos municípios é abastecida pela água proveniente de processos de dessalinização da água do mar, através de tecnologias de membranas - Osmose Inversa (OI). Neste estudo, através de inquérito directo (260 inquéritos) e visitas presenciais a instituições, empresas e directamente à população, fez-se a caracterização dos sistemas de gestão da água e de águas residuais da referida cidade, por forma a perceber o funcionamento dos mesmos. Em 2014, cerca de 90% da água distribuída à população da Praia (10.000 m3.dia-1) proveio da água dessalinizada na central da ELECTRA. No mesmo ano, o caudal médio diário de água residual afluente à ETAR do Palmarejo foi de 2245 m3.dia-1. A deficiente cobertura da rede de drenagem de águas residuais da cidade (26,5%, segundo resultados do inquérito) é a principal razão pela baixa afluência à ETAR. Neste trabalho, procedeu-se ainda, à avaliação comparativa de custos para produção de água para a rega de áreas verdes da cidade, quer a partir de técnicas de dessalinização quer a partir da reutilização de água residual tratada. Com a reutilização de água residual tratada na rega das áreas verdes da cidade da Praia (92,4 ha), concluiu-se que, ao fim dos próximos 21 anos, poupar-se-á, na dessalinização, cerca de 32 milhões de euros (3.520 milhões de ECV). Da análise efectuada, concluiu-se que o volume necessário para o sistema de armazenamento da água residual tratada (estimado com base no mês de maior necessidade de rega do ano horizonte, Junho de 2035, assumindo um tempo de retenção hidráulico de um dia) é de 5.000 m3.

Metanólise de óleo de soja em reator de membrana compósita PVA/casca de ovo calcinada. Estudo do efeito da reticulação

Com a crise energética atual e os efeitos nocivos associados ao consumo de combustíveis fósseis e seus derivados, tornou-se imperativo pesquisar e desenvolver alternativas sustentáveis e economicamente viáveis face a esse recurso. Surgiu então o biodiesel, um combustível derivado de recursos renováveis e potencial substituto do diesel convencional de base petroquímica. A transesterificação de óleos vegetais apresenta ser a principal via na produção de biodiesel. A utilização de catalisadores básicos homogéneos, tal como o hidróxido de sódio, na produção de biodiesel apresenta algumas adversidades, nomeadamente, o aparecimento de reações secundárias de hidrólise dos triglicéridos, na presença de água, que promovem a formação de sabões e emulsões. Mesmo com o uso de reagentes secos, ocorrem reações entre o hidróxido e o álcool, formando-se água. Uma solução para este tipo de problemas é a utilização de catalisadores heterogéneos. Contudo, a produção de biodiesel apresenta custos associados elevados que podem ser diminuídos com a utilização de catalisadores provenientes de resíduos alimentares. Este trabalho consistiu na preparação de membranas catalítica de álcool polivinílico (PVA) incorporadas com um catalisador heterogéneo sólido básico (óxido de cálcio) obtido a partir de resíduos alimentares industriais (casca de ovo de galinha). Procedeu-se à caraterização das membranas por determinação da espessura, ângulos de contato, grau de inchamento e por espectroscopia de infravermelho. As membranas de PVA foram testadas na transesterificação de óleo de soja com metanol em reator de membrana catalítica. Analisou-se o efeito da reticulação química nas propriedades das membranas e na atividade catalítica.

Descrição geral do Reino do Peru, em particular de Lima

Em 1970, o historiador peruano Guillermo Lohman Villena dava a conhecer ao público as suas pesquisas sobre a autoria da Descrição geral do Reino do Peru, em particular de Lima, que agora editamos, com uma solidez que torna até hoje muito credível a hipótese de o autor ser um cristão-novo português, chamado Pedro de León Portocarrero. De qualquer forma, este texto, escrito durante a primeira metade do século XVII, reflecte a experiência de muitos portugueses que no período da união das coroas ibéricas circularam pelo território andino, muitos deles dedicados ao comércio. Os artigos que acompanham a edição abordam esta circulação entre impérios, a partir de diferentes perspectivas, mostrando as relações que existiram entre os súbditos ibéricos, à margem da separação legal estabelecida em Tomar. O leitor interessado em aspectos como o comércio, a natureza do território peruano, a sua geografia e agricultura encontrará na Descrição... um manancial de informação muito pormenorizado, bem como sobre os diferentes grupos humanos que vivam e circulavam no Peru. A edição tem dois tipos de notas: por um lado, notas de carácter histórico, com o objectivo de esclarecer termos e conceitos próprios da história colonial peruana e hispano-americana e, por outro, comentários à tradução que pretendem chamar a atenção sobre peculiaridades linguísticas da Descrição... Por fim, editamos a transcrição de um documento relacionado com o processo inquisitorial que o autor sofreu, conservado no Arquivo Histórico Nacional de Madrid.

Desenvolvimento e implementação de técnicas avançadas usando desvios com aplicação a calibrações no domínio de metrologia angular

O trabalho desenvolvido no decurso da elaboração da dissertação aqui apresentada decorreu no departamento de Metrologia do Instituto Português da Qualidade no âmbito de estágio. O tema que foi abordado está inserido na área de Metrologia Angular, onde a grandeza que se mede é o ângulo plano. Por esse facto os dois equipamentos de medição principais que foram utilizados foram o autocolimador e a mesa rotativa. O objectivo principal do trabalho visou a utilização de novas técnicas de avaliação de dados, que consistiu na separação dos erros do autocolimador e da mesa rotativa, quando a calibrar o autocolimador e trabalhá-los separadamente com o propósito de verificar se as incertezas são mais baixas relativamente aos métodos clássicos de calibração e assim garantir uma maior exactidão nos resultados. Este trabalho implicou a implementação de uma nova técnica de medição, assim como a implementação de um novo processo de obtenção dos dados. Estas técnicas baseiam-se em aplicar certos desvios aos dois sistemas que vão permitir a construção dos erros separadamente, tanto do autocolimador como da mesa rotativa, e que vai permitir, deste modo, que não seja necessário recorrer a padrões externos. A obtenção desses erros foi construída utilizando as Transformadas de Fourier Discretas, pois através destas é possível recuperar/gerar valores que entretanto se perderam, ou não foram possíveis de adquirir. Com o trabalho realizado, o laboratório implementou um novo método de calibração do sistema composto pelos instrumentos de medição, autocolimador e mesa rotativa, garantindo que os erros estão em conformidade

Estudo da alteração das características das águas de lavagem dos plásticos recuperados no tratamento mecânico – caso de estudo da VALNOR

A presente dissertação tem como objetivo avaliar, em termos técnicos, funcionais e ambientais o processo da unidade de lavagem de filmes plásticos instalado na VALNOR SA. (a primeira unidade em Portugal com este material direto), bem como analisar as características do efluente produzido na estação de tratamento de modo a identificar as ações a desenvolver que permitam a reutilização deste efluente, em condições adequadas, no processo de lavagem. A referida instalação procede à lavagem do filme plástico que é retirado no processo de triagem mecânica e automática da instalação de Tratamento Mecânico e Biológico (TMB) da VALNOR SA, de modo a obterem-se mais-valias na sua retoma pelos operadores que o encaminham para reciclagem. Salienta-se que o filme plástico, após a separação e triagem no tratamento mecânico da TMB contém ainda uma percentagem residual elevada de matéria orgânica retida em grande parte da sua área superficial. Esta situação ocorre devido à sua mistura com os bio-resíduos, quer nos contentores de deposição, quer depois durante o transporte efetuado pelas viaturas municipais. A análise a este processo de lavagem (após a sua separação dos restantes resíduos), tem como principal objetivo avaliar os resultados obtidos, analisar as características do efluente gerado e tratado e, avaliar a possibilidade da reutilização no processo de lavagem do efluente tratado. Com base nesta avaliação e tendo em conta a solução de tratamento existente, identificaram-se os parâmetros menos conseguidos no tratamento, propondo-se ações que se consideram mais ajustadas para uma eventual reformulação do processo de tratamento e, como consequência, na melhoria das características dos filmes plásticos (para venda) após a lavagem. Para o cumprimento dos objetivos a que nos propusemos foi necessário realizar uma campanha de caracterização da atual água residual produzida na lavagem dos plásticos bem como do efluente reutilizado no processo. Os resultados obtidos nas análises efetuadas demonstraram que existia uma elevada carga orgânica e inorgânica no efluente bruto á entrada e á saída da estação de tratamento do efluente (ETARI). Estas condições resultam da elevada concentração de sólidos e de uma elevada carência química de oxigénio. Assim foram estudadas e sugeridas propostas de alteração na ETARI com o objetivo de melhorar a qualidade da água residual tratada/reutilizada, conferindo robustez ao processo, quer para o normal funcionamento quer para eventuais situações anómalas. Esta avaliação reveste-se da maior importância, pois com base nos resultados observados e nas melhorias que se propõem, espera-se que se possa contribuir para uma tomada de decisão no sentido de aumentar a eficiência e eficácia, respetivamente ambiental e económica, deste processo de lavagem de filmes plásticos.

Optimização do nível de serviço de um armazém central

O estudo que se apresenta nesta dissertação reporta-se ao trabalho realizado na empresa Tintas Robbialac S.A., no Departamento de Logística, nomeadamente no Armazém Central (AC), entre Março e Agosto de 2012. Os principais objectivos a atingir eram:  Estudo do Nível de Serviço mensal realizado no AC na separação de encomendas;  Sistematização dos erros de separação de encomendas através da análise diária das faltas;  Identificação das causas das faltas através da análise “Caso a Caso”;  Análise das Anomalias de Entrega (clientes internos/Lojas próprias) e das Notas de Crédito (clientes externos);  Propostas de melhoria que resultassem numa optimização do Nível de Serviço prestado pelo AC. Desenvolveram-se diversos indicadores e mapas que permitiram uma avaliação/análise do nível de serviço realizado:  Nível de Serviço do AC, desde 2010;  Análise diária do Nível de Serviço para o AC e para o Armazém Regional de Ramalde;  Identificação, triagem e mapeamento das Anomalias de Entrega em lojas abastecidas pelo AC (clientes internos);  Identificação, triagem e mapeamento das Notas de Crédito (clientes externos). Através do estudo destes mapas e recorrendo a métricas como, por exemplo, o volume, a quantidade, as linhas encomendadas versus expedidas e as cargas expedidas foi possível identificar um nível de serviço para a companhia. De Janeiro a Julho de 2012, considerando o volume separado obteve-se uma média de 90% que representou um aumento de 3% em relação a 2010. Paralelamente reformulou-se o processo de reporting dos clientes internos (anomalias de entrega), resultando num aumento do n.º e da qualidade das ocorrências, atingindo-se um pico de reportes em Junho. Em relação às Notas de Crédito, o mapa criado permite analisar pormenorizadamente todas as ocorrências. Em termos qualitativos as anomalias de entrega não apresentam ocorrências significativas representando uma percentagem mínima de ocorrências quando comparada com o motivo de acordo. A sistematização desenvolvida irá permitir medir o nível de serviço e identificar as causas de faltas e de erros na separação de encomendas que permitem agir e tomar acções correctivas.

Elucidating the role of glycans in leucocyte function

RESUMO: O processo de glicosilação é a modificação pós-traducional de proteínas mais comum e está envolvido em vários processos fisiológicos e patológicos. Especificamente, certos perfis glicosídeos estão correlacionados a estados específicos de diferenciação celular, e podem modular vários eventos celulares, como sinalização celular, migração celular e interações hospedeiro-patogénio. Assim sendo, a glicosilação desempenha um papel crucial na modulação de vários processos imunológicos. No entanto, permanece por esclarecer como as estruturas glicosídicas influenciam a imunidade. Especificamente, algumas estruturas glicosídicas terminais que estão modificadas pela ligação de ácido siálico desempenham um papel importante em várias funções do sistema imune, nomeadamente migração leucocitária em contexto de inflamação e ativação de células imunes. Como tal, este trabalho teve como objectivo investigar como a expressão de certos glicanos influencia componentes importantes da resposta imune inata e adaptativa. Este trabalho está dividido em três componentes principais: 1) A imunidade está amplamente dependente da habilidade das células circulantes migrarem para os tecidos inflamados, sendo que a ligação de leucócitos à Eselectina endotelial é o primeiro passo. Assim, nós analisámos a estrutura e função dos ligandos de E-selectina que são expressos pelas células humanas mononucleares de sangue periférico (PBMCs), fornecendo novos conhecimentos para a compreensão dos intervenientes moleculares que mediam a ligação dos monócitos, células CD4+ e CD8+T e células B ao endotélio vascular. Surpreendentemente, os monócitos apresentaram maior capacidade de ligação à E-selectina comparativamente aos linfócitos. Esta observação pode ser explicada pelo facto de os monócitos humanos expressarem, uniformemente, um vasto reportório de glicoproteínas que exibem afinidade de ligação à E-selectina, nomeadamente: as glicoformas do CD43 (CD43E) e do CD44 (HCELL), em adição à já previamente reportada glicoforma da PSGL-1 (CLA). Consistentemente, a diferente capacidade que as diversas populações linfocitárias apresentam de se ligar à E-selectina, está integralmente relacionada com a sua expressão de glicoproteínas com afinidade de ligação à E-selectina. Enquanto que as células CD4+T apresentam uma elevada reatividade à E-selectina, as células CD8+T e B demonstram pouca ou nenhuma capacidade de ligação à E-selectina. Esta atividade de ligação à E-selectina das células CD4+T é conferida pela expressão de HCELL, em adição às já previamente reportadas CLA e CD43E. As células CD8+ T não expressam HCELL e apenas expressam pequenas quantidades de CLA e CD43E, enquanto que as células B não expressam ligandos de Eselectina. Mais, a exofucosilação da superfície destas células, levou ao dramático aumento da expressão dos ligandos de E-selectina em todos as populações leucocitárias, verificando-se que a criação de certos ligandos de E-selectina está dependente do tipo de célula, após fucosilação. Colectivamente, estes resultados redefinem o nosso conhecimento acerca dos mecanismos moleculares que governam o tráfico das células mononucleares de sangue periférico em contexto de inflamação. 2) A habilidade das células dendríticas (DCs) para extravasarem em locais de inflamação é crucial para o sucesso da terapia com DCs. Assim, analisámos a estrutura e função das moléculas de adesão que mediam a migração transendotelial (TEM) das DCs. Para isso, foram usadas DCs geradas a partir da diferenciação de monócitos (mo-DCS), obtidos quer pelo métodos de separação imuno-magnética de células CD14+ (CD14-S) ou por isolamento por aderência ao plástico (PA-S). Os resultados obtidos indicam que as glicoformas de ligação à Eselectina de PSGL-1, CD43 e CD44 são expressas pelas CD14-S mo-DCs, enquanto que as PA-S mo-DCs expressam apenas CLA. É importante notar que a ligação do CD44 nas mo-DCs, mas não nas PA-S mo-DCs, desencadeia a ativação e consequente adesão da VLA-4 ao endotélio na ausência de um gradiente de quimiocinas. Procedeu-se também à análise dos ligandos E-selectina expressos em mo-DCs geradas a partir de monócitos do sangue do cordão umbilical (UCB) e, inesperadamente, as UCB mo-DCs não expressam qualquer glicoproteína com reatividade à E-selectina. Além disso, a exofucosilação das mo- DCs humanas utilizando uma α(1,3)-fucosiltransferase aumenta significativamente a expressão de HCELL e, portanto, estas células apresentam uma capacidade aumentada para se ligarem à E-selectina em condições de fluxo hemodinâmico. Estes resultados destacam o papel do HCELL no desencadeamento do TEM das CD14-S mo-DCs e sugerem que estratégias para potenciar a expressão de HCELL poderão impulsionar o recrutamento de mo-DCs para locais de inflamação. 3) Outro obstáculo para alcançar o sucesso promissor de vacinas baseadas em DCs é o estabelecimento de abordagens eficientes que poderão melhorar o estado de maturação e apresentação antigénica das DCs. Por conseguinte, foram investigadas abordagens alternativas que podem superar este obstáculo. Através da remoção de ácido siálico de superfície celular das DCs, conseguiu-se induzir a maturação de DC humanas e de ratinhos. Notavelmente, tanto as DCs humanas como as de ratinho, ao serem desialiladas mostraram uma capacidade aumentada para induzir a proliferação de células T, para secretar citocinas Th1 e para induzir a morte específica de células tumorais. Em adição, as DCs desialiladas apresentam uma maior capacidade de apresentação cruzada de antigénios tumorais às células T citotóxicas. Colectivamente, o presente estudo oferece uma visão chave para optimizar a capacidade das DCs em induzir respostas imunitárias anti-tumorais, e indica que o tratamento com sialidase é uma nova tecnologia para melhorar a eficácia e aplicabilidade das vacinas baseadas em DCs. Coletivamente, os nossos resultados demostram como a glicosilação e a sua manipulação podem modular a imunidade. Concretamente, através de uma reação de exofucosilação conseguimos aumentar fortemente a capacidade de os leucócitos extravasarem para os tecidos afectados, enquanto que a remoção dos níveis de ácido siálico da superfície celular das DCs, induz potentes respostas anti-tumorais mediadas por células T citotóxicas. ------------------------------------ ABSTRACT: Glycosylation is the most widely form of protein post-translational modification and is involved in many physiological and pathological processes. Specifically, certain patterns of glycosylation are associated with determined stages of cell differentiation and can modulate processes like cell-signaling and migration and host-pathogen interactions. As such, glycosylation plays a crucial role in the modulation of several immune events. However, how glycans execute this immune-modulation and, therefore, influence immunity is still poorly unknown. Specifically, some terminal sialic acid-modified determinants are known to be involved in several physiological immune processes, including leukocyte trafficking into sites of inflammation and cell immune activation. Therefore, in this work, we sought to investigate more deeply how the expression of these glycosidic structures affects events form both innate and adaptive immune responses. To this end, we divided our work into three main parts: 1) Immunity critically depends on the ability of sentinel circulating cells to infiltrate injured sites, of which leukocyte binding to endothelial E-selectin is the critical first step. Thus, we first analyzed the structure and function of the E-selectin ligands expressed on native human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), providing novel insights into the molecular effectors governing adhesion of circulating monocytes, and of circulating CD4+T, CD8+T and B cells, to vascular endothelium under hemodynamic shear conditions. Strikingly, monocytes show a higher ability to tether and roll on endothelial cells than lymphocyte subsets. This is due to the fact that human circulating monocytes uniformly display a wide repertoire of E-selectin binding glycoproteins, namely the E-selectin-binding glycoforms of CD43 (CD43E) and CD44 (HCELL), in addition to the previously described E-selectin-binding glycoform of PSGL-1 (CLA). In addition, we also observed a differential ability of the different lymphocyte subsets to bind to Eselectin under hemodynamic shear stress conditions, and these differences were highly correlated with their individual expression of E-selectin binding glycoproteins. While CD4+T cells show a robust E-selectin binding ability, CD8+T and B cells show little to no E-selectin reactivity. CD4+T cell potent Eselectin rolling activity is conferred by HCELL expression, in addition to the previously reported E-selectin-binding glycoproteins CD43E and CLA. CD8+T cells display no HCELL and low amounts of CLA and CD43E, whereas B cells lack E-selectin ligand expression. Moreover, enforced exofucosylation of cell surface of these cells noticeably increases expression of functional E-selectin ligands among all leukocytes subsets, with cell type-dependent specificity in the protein scaffolds that are modified. Taken together, these findings redefine our understanding of the molecular mechanisms governing the trafficking patterns of PBMCs that are relevant in the context of acute or chronic inflammatory conditions. 2) The ability of circulating dendritic cells (DCs) to extravasate at inflammatory sites is critical to the success of DC-based therapies. Therefore, we assessed the structure and function of adhesion molecules mediating the transendothelial migration (TEM) of human monocyte derived-DCs (mo-DCs), obtained either by CD14 positive immune-magnetic selection (CD14-S) or by plastic adherence of blood monocytes (PA-S). We report for the first time that the E-selectin binding glycoforms of PSGL-1, CD43 and CD44 are all expressed on CD14-S mo-DCs, in contrast to PA-S mo-DCs that express only CLA. Importantly, CD44 engagement on CD14-S mo-DCs, but not on PA-S mo-DCs, triggers VLA-4-dependent adhesiveness and programs TEM in absence of chemokine gradient. We also analyzed the E-selectin ligands expressed on mo-DCs generated from umbilical cord blood (UCB) monocytes, and unexpectedly, UCB mo-DCs do not express any glycoprotein with E-selectin reactivity. Furthermore, exoglycosylation of human mo-DCs using an α(1,3)-fucosyltransferase significantly increases expression of HCELL, and therefore exofucosylated mo-DCs exhibit an augmented ability to bind to E-selectin under hemodynamic shear stress conditions. These findings highlight a role for HCELL engagement in priming TEM of CD14-S mo-DCs, and suggest that strategies to enforce HCELL expression could boost mo-DC recruitment to inflammatory sites. 3) Another obstacle to achieve the promising success of DC-based vaccines is the establishment of efficient approaches that could successfully enhance maturation and cross-presentation ability of DCs. Therefore, we investigated an alternative approach that can overcome this problem. Through removal of sialic acid content from DC cell surface we are able to elicit maturation of both human and mouse DCs. Notably, desialylated human and murine DCs showed enhanced ability to induce autologous T cell to proliferate, to secrete Th1 cytokines and to kill tumor cells. Moreover, desialylated DCs display enhanced cross-presentation of tumor antigens to cytotoxic CD8+ T cells. Collectively, this study offers key insight to optimize the ability of DCs to boost anti-tumor immune responses, and indicates that the treatment with an exogenous sialidase is a powerful new technology to improve the efficacy and applicability of DC-based vaccines. Overall, our findings show how glycosylation and its manipulation can modulate immunity. Concretely, through an exofucosylation reaction we are able to greatly augment the ability of leukocytes to extravasate into injured tissues, while removal of sialic acid moieties from cell surface of DCs, significantly potentiate their ability to induce anti-tumor cytotoxic T cell-mediate responses.

Elucidating the role of glycans in leucocyte function

RESUMO:O processo de glicosilação é a modificação pós-traducional de proteínas mais comum e está envolvido em vários processos fisiológicos e patológicos. Especificamente, certos perfis glicosídeos estão correlacionados a estados específicos de diferenciação celular, e podem modular vários eventos celulares, como sinalização celular, migração celular e interações hospedeiro-patogénio. Assim sendo, a glicosilação desempenha um papel crucial na modulação de vários processos imunológicos. No entanto, permanece por esclarecer como as estruturas glicosídicas influenciam a imunidade. Especificamente, algumas estruturas glicosídicas terminais que estão modificadas pela ligação de ácido siálico desempenham um papel importante em várias funções do sistema imune, nomeadamente migração leucocitária em contexto de inflamação e ativação de células imunes. Como tal, este trabalho teve como objectivo investigar como a expressão de certos glicanos influencia componentes importantes da resposta imune inata e adaptativa. Este trabalho está dividido em três componentes principais: 1) A imunidade está amplamente dependente da habilidade das células circulantes migrarem para os tecidos inflamados, sendo que a ligação de leucócitos à Eselectina endotelial é o primeiro passo. Assim, nós analisámos a estrutura e função dos ligandos de E-selectina que são expressos pelas células humanas mononucleares de sangue periférico (PBMCs), fornecendo novos conhecimentos para a compreensão dos intervenientes moleculares que mediam a ligação dos monócitos, células CD4+ e CD8+T e células B ao endotélio vascular. Surpreendentemente, os monócitos apresentaram maior capacidade de ligação à E-selectina comparativamente aos linfócitos. Esta observação pode ser explicada pelo facto de os monócitos humanos expressarem, uniformemente, um vasto reportório de glicoproteínas que exibem afinidade de ligação à E-selectina, nomeadamente: as glicoformas do CD43 (CD43E) e do CD44 (HCELL), em adição à já previamente reportada glicoforma da PSGL-1 (CLA). Consistentemente, a diferente capacidade que as diversas populações linfocitárias apresentam de se ligar à E-selectina, está integralmente relacionada com a sua expressão de glicoproteínas com afinidade de ligação à E-selectina. Enquanto que as células CD4+T apresentam uma elevada reatividade à E-selectina, as células CD8+T e B demonstram pouca ou nenhuma capacidade de ligação à E-selectina. Esta atividade de ligação à E-selectina das células CD4+T é conferida pela expressão de HCELL, em adição às já previamente reportadas CLA e CD43E. As células CD8+ T não expressam HCELL e apenas expressam pequenas quantidades de CLA e CD43E, enquanto que as células B não expressam ligandos de Eselectina. Mais, a exofucosilação da superfície destas células, levou ao dramático aumento da expressão dos ligandos de E-selectina em todos as populações leucocitárias, verificando-se que a criação de certos ligandos de E-selectina está dependente do tipo de célula, após fucosilação. Colectivamente, estes resultados redefinem o nosso conhecimento acerca dos mecanismos moleculares que governam o tráfico das células mononucleares de sangue periférico em contexto de inflamação. 2) A habilidade das células dendríticas (DCs) para extravasarem em locais de inflamação é crucial para o sucesso da terapia com DCs. Assim, analisámos a estrutura e função das moléculas de adesão que mediam a migração transendotelial (TEM) das DCs. Para isso, foram usadas DCs geradas a partir da diferenciação de monócitos (mo-DCS), obtidos quer pelo métodos de separação imuno-magnética de células CD14+ (CD14-S) ou por isolamento por aderência ao plástico (PA-S). Os resultados obtidos indicam que as glicoformas de ligação à Eselectina de PSGL-1, CD43 e CD44 são expressas pelas CD14-S mo-DCs, enquanto que as PA-S mo-DCs expressam apenas CLA. É importante notar que a ligação do CD44 nas mo-DCs, mas não nas PA-S mo-DCs, desencadeia a ativação e consequente adesão da VLA-4 ao endotélio na ausência de um gradiente de quimiocinas. Procedeu-se também à análise dos ligandos E-selectina expressos em mo-DCs geradas a partir de monócitos do sangue do cordão umbilical (UCB) e, inesperadamente, as UCB mo-DCs não expressam qualquer glicoproteína com reatividade à E-selectina. Além disso, a exofucosilação das mo- DCs humanas utilizando uma α(1,3)-fucosiltransferase aumenta significativamente a expressão de HCELL e, portanto, estas células apresentam uma capacidade aumentada para se ligarem à E-selectina em condições de fluxo hemodinâmico. Estes resultados destacam o papel do HCELL no desencadeamento do TEM das CD14-S mo-DCs e sugerem que estratégias para potenciar a expressão de HCELL poderão impulsionar o recrutamento de mo-DCs para locais de inflamação. 3) Outro obstáculo para alcançar o sucesso promissor de vacinas baseadas em DCs é o estabelecimento de abordagens eficientes que poderão melhorar o estado de maturação e apresentação antigénica das DCs. Por conseguinte, foram investigadas abordagens alternativas que podem superar este obstáculo. Através da remoção de ácido siálico de superfície celular das DCs, conseguiu-se induzir a maturação de DC humanas e de ratinhos. Notavelmente, tanto as DCs humanas como as de ratinho, ao serem desialiladas mostraram uma capacidade aumentada para induzir a proliferação de células T, para secretar citocinas Th1 e para induzir a morte específica de células tumorais. Em adição, as DCs desialiladas apresentam uma maior capacidade de apresentação cruzada de antigénios tumorais às células T citotóxicas. Colectivamente, o presente estudo oferece uma visão chave para optimizar a capacidade das DCs em induzir respostas imunitárias anti-tumorais, e indica que o tratamento com sialidase é uma nova tecnologia para melhorar a eficácia e aplicabilidade das vacinas baseadas em DCs. Coletivamente, os nossos resultados demostram como a glicosilação e a sua manipulação podem modular a imunidade. Concretamente, através de uma reação de exofucosilação conseguimos aumentar fortemente a capacidade de os leucócitos extravasarem para os tecidos afectados, enquanto que a remoção dos níveis de ácido siálico da superfície celular das DCs, induz potentes respostas anti-tumorais mediadas por células T citotóxicas. ---------------------------- ABSTRACT: Glycosylation is the most widely form of protein post-translational modification and is involved in many physiological and pathological processes. Specifically, certain patterns of glycosylation are associated with determined stages of cell differentiation and can modulate processes like cell-signaling and migration and host-pathogen interactions. As such, glycosylation plays a crucial role in the modulation of several immune events. However, how glycans execute this immune-modulation and, therefore, influence immunity is still poorly unknown. Specifically, some terminal sialic acid-modified determinants are known to be involved in several physiological immune processes, including leukocyte trafficking into sites of inflammation and cell immune activation. Therefore, in this work, we sought to investigate more deeply how the expression of these glycosidic structures affects events form both innate and adaptive immune responses. To this end, we divided our work into three main parts: 1) Immunity critically depends on the ability of sentinel circulating cells to infiltrate injured sites, of which leukocyte binding to endothelial E-selectin is the critical first step. Thus, we first analyzed the structure and function of the E-selectin ligands expressed on native human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), providing novel insights into the molecular effectors governing adhesion of circulating monocytes, and of circulating CD4+T, CD8+T and B cells, to vascular endothelium under hemodynamic shear conditions. Strikingly, monocytes show a higher ability to tether and roll on endothelial cells than lymphocyte subsets. This is due to the fact that human circulating monocytes uniformly display a wide repertoire of E-selectin binding glycoproteins, namely the E-selectin-binding glycoforms of CD43 (CD43E) and CD44 (HCELL), in addition to the previously described E-selectin-binding glycoform of PSGL-1 (CLA). In addition, we also observed a differential ability of the different lymphocyte subsets to bind to Eselectin under hemodynamic shear stress conditions, and these differences were highly correlated with their individual expression of E-selectin binding glycoproteins. While CD4+T cells show a robust E-selectin binding ability, CD8+T and B cells show little to no E-selectin reactivity. CD4+T cell potent Eselectin rolling activity is conferred by HCELL expression, in addition to the previously reported E-selectin-binding glycoproteins CD43E and CLA. CD8+T cells display no HCELL and low amounts of CLA and CD43E, whereas B cells lack E-selectin ligand expression. Moreover, enforced exofucosylation of cell surface of these cells noticeably increases expression of functional E-selectin ligands among all leukocytes subsets, with cell type-dependent specificity in the protein scaffolds that are modified. Taken together, these findings redefine our understanding of the molecular mechanisms governing the trafficking patterns of PBMCs that are relevant in the context of acute or chronic inflammatory conditions. 2) The ability of circulating dendritic cells (DCs) to extravasate at inflammatory sites is critical to the success of DC-based therapies. Therefore, we assessed the structure and function of adhesion molecules mediating the transendothelial migration (TEM) of human monocyte derived-DCs (mo-DCs), obtained either by CD14 positive immune-magnetic selection (CD14-S) or by plastic adherence of blood monocytes (PA-S). We report for the first time that the E-selectin binding glycoforms of PSGL-1, CD43 and CD44 are all expressed on CD14-S mo-DCs, in contrast to PA-S mo-DCs that express only CLA. Importantly, CD44 engagement on CD14-S mo-DCs, but not on PA-S mo-DCs, triggers VLA-4-dependent adhesiveness and programs TEM in absence of chemokine gradient. We also analyzed the E-selectin ligands expressed on mo-DCs generated from umbilical cord blood (UCB) monocytes, and unexpectedly, UCB mo-DCs do not express any glycoprotein with E-selectin reactivity. Furthermore, exoglycosylation of human mo-DCs using an α(1,3)-fucosyltransferase significantly increases expression of HCELL, and therefore exofucosylated mo-DCs exhibit an augmented ability to bind to E-selectin under hemodynamic shear stress conditions. These findings highlight a role for HCELL engagement in priming TEM of CD14-S mo-DCs, and suggest that strategies to enforce HCELL expression could boost mo-DC recruitment to inflammatory sites.3) Another obstacle to achieve the promising success of DC-based vaccines is the establishment of efficient approaches that could successfully enhance maturation and cross-presentation ability of DCs. Therefore, we investigated an alternative approach that can overcome this problem. Through removal of sialic acid content from DC cell surface we are able to elicit maturation of both human and mouse DCs. Notably, desialylated human and murine DCs showed enhanced ability to induce autologous T cell to proliferate, to secrete Th1 cytokines and to kill tumor cells. Moreover, desialylated DCs display enhanced cross-presentation of tumor antigens to cytotoxic CD8+ T cells. Collectively, this study offers key insight to optimize the ability of DCs to boost anti-tumor immune responses, and indicates that the treatment with an exogenous sialidase is a powerful new technology to improve the efficacy and applicability of DC-based vaccines. Overall, our findings show how glycosylation and its manipulation can modulate immunity. Concretely, through an exofucosylation reaction we are able to greatly augment the ability of leukocytes to extravasate into injured tissues, while removal of sialic acid moieties from cell surface of DCs, significantly potentiate their ability to induce anti-tumor cytotoxic T cell-mediate responses.

Projecto e construção de uma câmara de cultura celular para uso em microscopia óptica

O grupo de Engenharia de Tecidos da FCT/UNL desenvolve membranas biodegradáveis que servem de substrato a culturas celulares e que se destinam a substituir temporariamente tecidos humanos danificados. O objectivo desta dissertação é desenvolver uma câmara que permita manter uma cultura celular em incubação por um período de tempo indefinido e que simultaneamente permita a sua observação através de microscopia óptica. Foi projectada e construída uma câmara de cultura compatível com o microscópio disponível no laboratório do Grupo de Engenharia de Tecidos da FCT/UNL, capaz de manter um ambiente interno adequado às necessidades fisiológicas das células: 37 ºC, CO2 a 5% e entre 90 a 100% de humidade sem interferir com a capacidade de formação de imagens do microscópio. Os testes efectuados permitiram verificar que o sistema desenvolvido é capaz de controlar e monitorizar a temperatura e a percentagem de CO2, proporcionando um ambiente adequado para manter as células em incubação por um período de tempo indefinido e permitindo a sua observação num microscópio óptico invertido.

Estudo preliminar das sementes e do óleo de cinco espécies da amazônia.

Resultadospreliminares são apresentados sobre a composição das sementes e dos óleos das seguintes espécies da Amazônia: Couroupita guianensis, Pachira aquatica, Eglerodendron pariri, Parkia gigantocarpae Parkia opositifolta,o que representa parte de uma tentativa de se estabelecer, aditivamente, o potencial econômico daquela região. Enquanto as duas primeiras, pelo teor de óleo apresentado (29,4 e 44,1%, respectivamente) podem ser considerados como oleaginosas, as duas espécies de Parkiaapresentaram proteínas com altoteor de triptofano, merecendo ser estudadasmais detalhadamente. A espécie Eglerodendron pariri,ao contrário, não se revelou como fonte potencial,quantitativa ou qualitativa, quer de óleo, quer de proteína. Na espécie Couroupia guianensisencontrou-se predominância de ácido linoleico (>80%) enquanto que nas amostras de óleo de Parkia gigantocarpae P. opositifoliasobressai a presença de 12-15% de ácidos de peso molecular elevado (C20:0 e C22:00) e um teor de aproximadamente 40% de C18:2. 0 ácido palmítico é o principal componente dos Óleos de Pachira aquaticae Eglerodendron pariri.A separação e a identificação de ácidos responsáveis, no Óleo de P. aquatica,pela resposta positiva ao teste de Halphen, não foram definitivas. Nos cinco óleos o β-sitosterol foi o componente maior da fração esterólica, isoladaa partir do material insaponificável.