Rôle des Cellules Endothéliales Progénitrices dans la Régulation de la Fonction Plaquettaire

Les Cellules Endothéliales Progénitrices ("Endothelial Progenitor Cells", EPCs) sont des précurseurs endothéliaux qui jouent un rôle émergeant en biologie vasculaire. Les EPCs ont été localisées dans le cordon ombilical, la moelle osseuse, le sang périphérique et dans certains tissus régénérateurs. Les interactions des EPCs avec les cellules sanguines et vasculaires peuvent largement influencer leurs propriétés biologiques et dicter leur fonctionnement pendant la réparation endothéliale. Plus spécifiquement, les interactions des EPCs avec les plaquettes circulantes induisent leur migration, leur recrutement et leur différentiation en cellules endothéliales aux sites de lésions vasculaires. Cependant, l’impact d’une telle interaction sur la fonction plaquettaire n’a pas été recherché. Le but de mon projet était de :1) générer des EPCs à partir des cellules mononucléaires du sang humain périphérique ("Peripheral Blood Mononuclear Cells", PBMCs); 2) étudier les interactions adhésives entre les EPCs et les plaquettes; 3) déterminer leur impact sur la fonction plaquettaire et la formation du thrombus et 4) décrire le mécanisme d’action des EPCs sur les plaquettes et le thrombus. Mises en culture sur une surface de fibronectine dans un milieu conditionné, les PBMCs fraîchement isolées possédaient une morphologie ronde et une petite taille. Après cinq jours, les PBMCs adhérentes donnaient naissance à des colonies, puis formaient une monocouche de cellules aplaties caractéristiques des EPCs après dix jours de culture. Les EPCs différenciées étaient positives pour l’Ulex-lectine et l’Acétyle des lipoprotéines de faible densité ("Acetylated Low Density Lipoprotein", Ac-LDL), exprimaient les marqueurs progéniteurs (CD34, P-sélectine, VEGFR2, vWF et VE-Cadhérine) tandis que les marqueurs leucocytaires (CD14, PSGL-1 et L-sélectine) étaient absents. Ces EPCs interagissaient avec les plaquettes activées par un mécanisme dépendant de la P-sélectine plaquettaire, inhibaient l’activation et l’agrégation plaquettaire et réduisaient significativement l’adhésion plaquettaire, principalement par l’action de prostacycline (PGI2). En fait, ceci était associé avec une augmentation de l’expression de la cyclooxygénase-2 (COX-2) et du monoxyde d’azote (NO) synthéthase inductible (iNOS). Toutefois, les effets inhibiteurs des EPCs sur la fonction plaquettaire ont été renversés par une inhibition de la COX et non pas du NO. Bien que les EPCs fussent en mesure de lier les plaquettes via la P-sélectine, leurs effets prédominants étaient médiés essentiellement par une sécrétion paracrine, impliquant la PGI2. Néanmoins, un rapprochement étroit ou un bref contact entre les EPCs et les plaquettes était requis pour que cette fonction soit complètement réalisée. D’ailleurs, cet aspect a été investigué chez des souris déficientes en P-sélectine (P-sel-/-) et chez leurs congénères de phénotype sauvage (Wild Type, WT). Chez les souris WT, les EPCs inhibaient l’agrégation plaquettaire dans le sang complet de manière concentration-dépendante alors que dans les souris P-sel-/-, l’action des EPCs n’avait pas d’effet significatif. De plus, en utilisant un modèle murin de thrombose artérielle, nous avons démontré que l’infusion systémique des EPCs altéraient la formation du thrombus et réduisaient significativement sa masse chez les souris WT, mais non pas chez les souris P-sel-/-. En outre, le nombre des EPCs incorporées au niveau du thrombus et de la paroi vasculaire était visiblement réduit chez les P-sel-/- par rapport aux souris WT. Dans cette étude, nous sommes parvenus à différentier adéquatement des EPCs à partir des PBMCs, nous avons étudié les interactions adhésives entre les EPCs et les plaquettes, et nous avons décrit leur impact sur la fonction plaquettaire et la formation du thrombus. De plus, nous avons identifié la PGI2 comme étant le principal facteur soluble sécrété par les EPCs en culture et responsable de leurs effets inhibiteurs sur l’activation, l’adhésion et l’agrégation plaquettaire in vitro. De surcroît, nous avons élucidé le mécanisme d’action des EPCs sur l’agrégation plaquettaire et la formation du thrombus, in vivo, et nous avons souligné le rôle de la P-sélectine plaquettaire dans ce processus. Ces résultats ajoutent de nouvelles connaissances sur la biologie des EPCs et définissent leur rôle potentiel dans la régulation de la fonction plaquettaire et la thrombogenèse.

Réduction des dommages myocardiques par le célécoxib suite à une ischémie transitoire chez le rat

Cette étude a été conçue afin d’évaluer l’effet d’un pré-traitement à long terme au célécoxib sur la taille d’infarctus suite à un infarctus du myocarde. Sachant que le célécoxib est un anti-inflammatoire et que des dommages myocardiques peuvent découler des processus inflammatoires, l’inhibition de l’inflammation devrait hypothétiquement réduire la taille d’un éventuel infarctus. Pour ce faire, un traitement au célécoxib (3 mg/kg/jour i.p.) ou au véhicule (DMSO 50% ; EtOH 15% ; eau distillée) a été administré chroniquement pendant 28 jours à des rats mâles Sprague-Dawley (n=18 par groupe) par pompes osmotiques ALZET. Après avoir été anesthésiés, les animaux ont été sujets à l’occlusion de l’artère coronaire gauche descendante, suivie d’une période de reperfusion de 24 heures. Les résultats démontrent que la taille de l’infarctus des animaux traités au célécoxib est significativement réduite comparativement à celle du groupe témoin (37,5±2,5% versus 48,0±2,6% de la zone à risque, p < 0,05). Par la suite, l’accumulation de neutrophiles indique une hausse de ces leucocytes pour la zone ischémique, sans toutefois discriminer entre les groupes traité et non-traité, qui contenaient aussi les couches sub-endocardique et sous-épicardique. Cependant, aucune différence significative est notée entre les groupes traité et témoin au niveau de l’expression de la prostaglandine E2 plasmatique et du facteur de nécrose tumorale alpha. D’un autre côté, l’apoptose, déterminée par le ratio de Bax/Bcl2 et par un essai TUNEL est significativement réduite pour la couche sub-endocardique de la zone à risque des animaux traités au célécoxib. Enfin, l’agrégation plaquettaire, induite à l’adénosine diphosphate et analysée dans le sang complet, suggère que le célécoxib diminue l’agrégation plaquettaire. Cette étude indique alors qu’un pré-traitement au célécoxib peut réduire la taille d’infarctus par un mécanisme impliquant l’apoptose.

Rôle des médiateurs lipidiques dans la réaction inflammatoire chez le lapin

Les médiateurs lipidiques de l’inflammation dont le leucotriène B4 (LTB4) et le facteur d’activation plaquettaire (PAF) permettent la régulation de la migration des neutrophiles polymorphonucléaires (PMNs) et l’extravasation plasmatique au site inflammatoire. Afin de déterminer leurs rôles dans la régulation de la migration des PMNs au site inflammatoire, nous avons étudié leur effet potentiellement coopératif en utilisant une approche pharmacologique à l’aide d’antagonistes sélectifs des récepteurs du LTB4 et du PAF dans un modèle d’inflammation dermique chez le lapin. Les résultats montrent un effet inhibiteur additif des antagonistes des deux médiateurs lipidiques, lorsque utilisés de façon concomitante, sur la migration des neutrophiles induite par le LTB4, le PAF et aussi sur des médiateurs non-chimiquement apparentés comme le facteur nécrosant des tumeurs (TNFα), ainsi que sur l'inhibition de l’extravasation plasmatique induite par le leucotriène D4, suggérant un rôle régulateur des récepteurs du LTB4 et du PAF dans la migration des PMNs au site inflammatoire. Nous avons déterminé le rôle de ces médiateurs dans la régulation de la migration des PMNs en réponse à une ischémie-reperfusion des membres inferieurs chez le lapin. Les résultats appuient l’hypothèse selon laquelle le LTB4 et le PAF exercent un rôle important dans l’accumulation des PMNs au site inflammatoire. En effet l’administration concomitante des antagonistes des récepteurs de ces deux médiateurs lipidiques a réduit de façon significative la migration des PMNs aux poumons, intestins et foie. Nos résultats contribuent à élucider le rôle du LTB4 et du PAF dans la régulation de l’extravasation des PMNs et du plasma au site inflammatoire.

Inhibition de l’absorption intestinale du glucose par les produits naturels issus de la pharmacopée traditionnelle des Cris de la Baie James

Le diabète de type 2 et l'obésité sont des problèmes de santé majeurs et les peuples autochtones sont particulièrement à risque. Pour remédier à ce problème largement répandu dans les populations autochtones canadiennes pour qui la médication moderne n’est pas culturellement adaptée, notre équipe s’est donné comme objectif d’étudier les activités potentielles antidiabétique et anti-obésité de la pharmacopée traditionnelle des Cris de la Baie James. Le but de cette étude est de tester l’hypothèse selon laquelle certaines plantes médicinales pourraient inhiber l'absorption intestinale du glucose, une activité anti-hyperglycémique qui, par la même occasion, contribuerait à combattre l’obésité. Les extraits éthanoliques de dix-sept plantes médicinales de la forêt boréale ont été testés dans des cellules intestinales Caco-2 et comparés à l’effet d’inhibiteurs compétitifs connus, tels que la phlorizine et la phlorétine. Ces inhibiteurs sont des composés polyphénoliques qui partagent de nombreuses caractéristiques structurelles avec des constituants moléculaires de plusieurs plantes Cri. Les résultats démontrent que treize des dix-sept extraits de plantes ont inhibé de façon significative l'absorption intestinale du 3H-D-glucose. Pour valider ces effets in vivo, quatre extraits ont été administrés à des rats Wistar par gavage intragastrique (250 mg/kg) en même temps qu’un bolus de glucose (3 g/kg). Suite à ce gavage, deux de ces extraits ont restreint l’augmentation de la glycémie d'environ 40% par rapport à un contrôle sans extrait. Ces résultats indiquent qu’une inhibition compétitive de l'absorption intestinale du glucose peut être atteinte par des extraits bruts de plantes médicinales. La prise de ces plantes durant les repas aiderait à un meilleur contrôle post-prandial de la glycémie, particulièrement chez les personnes à risque.

Étude de l’effet des médicaments antiplaquettaires sur la fonction plaquettaire : de la variabilité de réponse à l’effet rebond

En inhibant la formation de caillots dans le sang, les médicaments antiplaquettaires diminuent de façon importante le risque d’événements ischémiques aigus. Cependant, une sous-population de patients souffrant de maladie coronarienne présente une inhibition inadéquate de la fonction plaquettaire malgré la prise quotidienne d’acide acétylsalicylique (AAS). Le premier volet de cette thèse démontre qu’une régénération plaquettaire accélérée pourrait expliquer en partie la variabilité dans la persistance de l’effet antiplaquettaire de l’AAS chez certains sujets souffrant de maladie coronarienne. Ces données suggèrent qu’une augmentation de la fréquence d’administration d’AAS d’une à deux fois par jour pourrait être bénéfique chez ces sujets. Des méta-analyses ont suggéré qu’une réponse plaquettaire inadéquate à l’AAS pourrait augmenter le risque d’événements ischémiques récurrents. La nature rétrospective de ces analyses ne permet pas d’établir la causalité. Dans le deuxième volet de cette thèse, les résultats d’une étude prospective visant à comparer la pertinence clinique de 6 tests de fonction plaquettaire fréquemment utilisés pour évaluer la réponse plaquettaire à l’AAS est présentée. Les résultats démontrent qu’aucun des tests de fonction plaquettaire couramment employés ne prédit la survenue d’événements ischémiques aigus chez des patients souffrant de maladie coronarienne stable. Toutefois, la cessation de la prise d’AAS est un prédicteur important d’événements thrombotiques. La cessation de médicaments antiplaquettaires a souvent été associée à la survenue d’événements thrombotiques dans les jours suivant l’interruption. À savoir si la survenue de ces événements est attribuable uniquement au retrait d’un médicament protecteur ou plutôt à une sensibilisation plaquettaire, constitue un débat d’actualité. Dans le troisième volet de cette thèse, des données sont présentées démontrant que la cessation de clopidogrel après la période recommandée par les lignes directrices actuelles provoque une sensibilisation des plaquettes nouvellement formées aux stimuli plaquettaires physiologiques. Ces résultats encouragent la recherche sur différentes modalités pour atténuer le risque thrombotique accru chez ces patients souffrant de maladie coronarienne. En conclusion, cet ouvrage présente des études visant à identifier les sous-populations de patients qui sont plus à risque de complications cardiovasculaires récurrentes. Dans ce contexte, la personnalisation de traitement est une avenue thérapeutique prometteuse, où chaque patient pourra recevoir un traitement ciblé en fonction de ses besoins et de ses contre-indications. Ce changement de paradigme d’une thérapie empirique issue d’études de grande envergure sur des données populationnelles à une thérapie ajustée aux besoins individuels représente un vaste champ de recherche, où la majorité des découvertes sont à faire.

Hydrogen peroxide enhances the expression and function of Giα proteins in aortic vascular smooth muscle cells from Sprague-Dawley rats : role of growth factor receptors transactivation

Nous avons récemment démontré que les espèces réactives oxygénées induisent une augmentation de l’expression des protéines Giα dans les cellules du muscle lisse vasculaire (CMLV) provenant d’aortes de rats spontanément hypertendus (SHR, de l’anglais spontaneously hypertensive rats). La présente étude a pour but d’étudier les effets du peroxyde d’hydrogène (H2O2), un oxydant qui induit le stress oxydatif, sur l’expression de Giα et sur l’activité de l’adénylate cyclase, et d’explorer les voies de signalisation sous-jacentes responsables de cette réponse. Nos résultats montrent que H2O2 induit une augmentation de l’expression des protéines Giα-2 et Giα-3 de manière dose- et temps-dépendante avec une augmentation maximale de 40-50% à 100 µM après 1 heure, sans affecter l’expression de Gsα. L’expression des protéines Giα a été maintenue au niveau normal en presence de AG 1478, AG1295, PD98059 et la wortmannine, des inhibiteurs d’EGF-R (de l’anglais epidermal growth factor receptor), PDGFR-β (de l’anglais platelet-derived growth factor receptor β), de la voie de signalisation ras-ERK1/2 (de l’anglais extracellular regulated kinase1/2), et de la voie de la PI3Kinase-AKT (de l’anglais phosphatidyl inositol-3 kinase), respectivement. En outre, le traitement des CMLV avec H2O2 a induit une augmentation du degré de phosphorylation d’EGF-R, PDGF-R, ERK1/2 et AKT; et cette expression a été maintenue au niveau témoin par leurs inhibiteurs respectifs. Les inhibiteurs d’EGF-R et PDGF-R ont aussi induit une diminution du degré de phosphorylation de ERK1/2, et AKT/PKB. En outre, la transfection des cellules avec le siRNA (de l’anglais, small interfering ribonucleic acid) de EGF-R et PDGFR-β a atténué la surexpression des protéines Giα-2 et Giα-3 induite par le traitement au H2O2. La surexpression des protéines Giα induite par H2O2 a été corrélée avec une augmentation de la fonction de la protéine Giα. L’inhibition de l’activité de l’adénylate cyclase par de faibles concentrations de GTPγS après stimulation par la forskoline a augmenté de 20% dans les cellules traitées au H2O2. En outre, le traitement des CMLV au H2O2 a aussi accru l’inhibition de l’activité de l’adénylate cyclase par les hormones inhibitrices telles que l’angiotensine II, oxotrémorine et C-ANP4-23. D’autre part, la stimulation de l’adénylate cyclase induite par GTPγS, glucagon, isoprotérénol, forskoline, et le fluorure de sodium (NaF) a été atténuée de façon significative dans les cellules traitées au H2O2. Ces résultats suggèrent que H2O2 induit la surexpression des protéines Giα-2 and Giα-3 via la transactivation des récepteurs des facteurs de croissance EGF-R, PDGFR-β et l’activation des voies de signalisation ras-ERK1/2 et PI3K-AKT Mot-cles: Protéines Giα, peroxyde d’hydrogène, stress oxydant, récepteurs des facteurs de croissance, MAP kinases, adénylate cyclase, hypertension

Rôles du stress du réticulum endoplasmique et de l'immunité innée dans l'inhibition de la transcription du gène de l'insuline : étude du facteur de transcription ATF6 et du récepteur TLR4

Le diabète de type 2 (DT2) est caractérisé par une résistance des tissus périphériques à l’action de l’insuline et par une insuffisance de la sécrétion d’insuline par les cellules β du pancréas. Différents facteurs tels que le stress du réticulum endoplasmique (RE) et l’immunité innée affectent la fonction de la cellule β-pancréatique. Toutefois, leur implication dans la régulation de la transcription du gène de l’insuline demeure imprécise. Le but de cette thèse était d’identifier et de caractériser le rôle du stress du RE et de l’immunité innée dans la régulation de la transcription du gène de l’insuline. Les cellules β-pancréatiques ont un RE très développé, conséquence de leur fonction spécialisée de biosynthèse et de sécrétion d’insuline. Cette particularité les rend très susceptible au stress du RE qui se met en place lors de l’accumulation de protéines mal repliées dans la lumière du RE. Nous avons montré qu’ATF6 (de l’anglais, activating transcription factor 6), un facteur de transcription impliqué dans la réponse au stress du RE, lie directement la boîte A5 de la région promotrice du gène de l’insuline dans les îlots de Langerhans isolés de rat. Nous avons également montré que la surexpression de la forme active d’ATF6α, mais pas ATF6β, réprime l’activité du promoteur de l’insuline. Toutefois, la mutation ou l’absence de la boîte A5 ne préviennent pas l’inhibition de l’activité promotrice du gène de l’insuline par ATF6. Ces résultats montrent qu’ATF6 se lie directement au promoteur du gène de l’insuline, mais que cette liaison ne semble pas contribuer à son activité répressive. Il a été suggéré que le microbiome intestinal joue un rôle dans le développement du DT2. Les patients diabétiques présentent des concentrations plasmatiques élevées de lipopolysaccharides (LPS) qui affectent la fonction de la cellule β-pancréatique. Nous avons montré que l’exposition aux LPS entraîne une réduction de la transcription du gène de l’insuline dans les îlots de Langerhans de rats, de souris et humains. Cette répression du gène de l’insuline par les LPS est associée à une diminution des niveaux d’ARNms de gènes clés de la cellule β-pancréatique, soit PDX-1 (de l’anglais, pancreatic duodenal homeobox 1) et MafA (de l’anglais, mammalian homologue of avian MafA/L-Maf). En utilisant un modèle de souris déficientes pour le récepteur TLR4 (de l’anglais, Toll-like receptor), nous avons montré que les effets délétères des LPS sur l’expression du gène de l’insuline sollicitent le récepteur de TLR4. Nous avons également montré que l’inhibition de la voie NF-kB entraîne une restauration des niveaux messagers de l’insuline en réponse à une exposition aux LPS dans les îlots de Langerhans de rat. Ainsi, nos résultats montrent que les LPS inhibent le gène de l’insuline dans les cellules β-pancréatiques via un mécanisme moléculaire dépendant du récepteur TLR4 et de la voie NF-kB. Ces observations suggèrent ainsi un rôle pour le microbiome intestinal dans la fonction de la cellule β du pancréas. Collectivement, ces résultats nous permettent de mieux comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans la répression du gène de l'insuline en réponse aux divers changements survenant de façon précoce dans l’évolution du diabète de type 2 et d'identifier des cibles thérapeutiques potentielles qui permettraient de prévenir ou ralentir la détérioration de l'homéostasie glycémique au cours de cette maladie, qui affecte plus de deux millions de Canadiens.

Évaluation des mécanismes d'inhibition dans le trouble cognitif léger et la maladie d'Alzheimer

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Étude et inhibition de l'adhésine impliquée dans l'adhérence diffuse (AIDA-I) d'escherichia coli

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Inhibition de la réception des signaux de danger via les TLR TRIF-dépendants dans les cellules dendritiques myéloïdes infectées avec le virus de l'hépatice C in vivo : mécanisme d'évasion de l'immunité innée dans l'infection chronique

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Inhibition of respiratory syncytial virus by nasally administered siRNA modified with F-ANA

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

CD40 signalling in platelet function

Le CD40 est un membre de la famille des récepteurs du facteur de nécrose tumorale ("Tumour necrosis factor", TNF), initialement identifié sur des cellules de carcinome de la vessie. L'interaction du CD40 avec son ligand (CD40L) est d'une importance cruciale pour le développement des cellules B et de la commutation d'isotype au cours de la réponse immunitaire acquise. L'expression du complexe CD40/CD40L était initialement cru d'être limiter aux cellules du système immunitaire, mais aujourd'hui il est bien connu que ce complexe est également exprimé sur les cellules du système circulatoire et vasculaire, et est impliqué dans diverses réactions inflammatoires; de sorte que le CD40L est maintenant considéré comme une molécule thrombo-inflammatoire prédictive des événements cardiovasculaires. Les plaquettes expriment constitutivement le CD40, alors que le CD40L n'est exprimé que suite à leur l'activation. Il est ensuite clivé en sa forme soluble (sCD40L) qui représente la majorité du sCD40L en circulation. Il fut démontré que le sCD40L influence l'activation plaquettaire mais son effet exact sur la fonction plaquettaire, ainsi que les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents à son action demeurent inconnus. Ainsi, ce projet a été entrepris dans le but d’adresser les objectifs spécifiques suivants: 1) évaluer les effets in vitro du sCD40L sur l'activation et l'agrégation plaquettaire; 2) identifier les récepteurs plaquettaires impliqués dans l’action du sCD40L; 3) élucider les voies signalétiques intracellulaires induits par le sCD40L; 4) évaluer les effets du sCD40L sur la formation de thrombus in vivo. Nous avons trouvé que le sCD40L augmente fortement l'activation et l'agrégation des plaquettes en réponse à de faibles concentrations d'agonistes. Les plaquettes humaines traitées avec une forme mutante du sCD40L qui n'interagit pas avec le CD40, et les plaquettes de souris déficientes en CD40 ne furent pas en mesure d'induire de telles réponses, indiquant que le récepteur principal du sCD40L au niveau des plaquettes est le CD40. En plus, nous avons identifié la présence de plusieurs membres de la famille du facteur associé du récepteur du TNF ("TNF receptor-associated factor", TRAF) dans les plaquettes et nous avons montré que seulement le TRAF2 s'associe avec le CD40 suite à la stimulation par le sCD40L. Nos résultats indiquent aussi que le sCD40L agisse sur les plaquettes au repos par l'entremise de deux voies signalétiques distinctes. La première voie implique l'activation de la petite GTPase Rac1 et de sa cible en aval, soit la protéine kinase p38 activée par le mitogène ("p38 mitogen-activated protein kinase", p38 MAPK ), menant au changement de forme plaquettaire et à la polymérisation de l'actine; alors que la deuxième voie implique l'activation de la cascade signalétique du NF-kB. Par ailleurs, à la suite d'une lésion artérielle induite par le chlorure de fer, le sCD40L exacerbe la formation de thrombus et l'infiltration leucocytaire au sein du thrombus dans les souris du type sauvage, mais pas chez les souris déficientes en CD40. En conclusion, ce projet a permis d'identifier pour la première fois deux voies signalétiques distinctes en aval du CD40 plaquettaire et a permis d'établir leur implication dans l'activation et l'agrégation plaquettaire en réponse au sCD40L. De manière plus importante, ce projet nous a permis d'établir un lien direct entre les niveaux élevés du sCD40L circulant et la formation de thrombus in vivo, tout en soulignant l'importance du CD40 dans ce processus. Par conséquent, l'axe CD40/CD40L joue un rôle important dans l'activation des plaquettes, les prédisposant à une thrombose accrue en réponse à une lésion vasculaire. Ces résultats peuvent expliquer en partie la corrélation entre les taux circulants élevés du sCD40L et l'incidence des maladies cardiovasculaires.

Rôle de l’axe CD40L/CD40 dans les cellules endothéliales progénitrices

Les cellules endothéliales progénitrices («Endothelial Progenitor Cells», EPCs) sont des précurseurs endothéliaux qui possèdent un potentiel considérable dans la réparation et la régénération vasculaire. Dans le contexte des maladies cardiovasculaires, la compréhension du rôle des EPCs dans la régulation de la thrombogenèse et la réparation endothéliale est pertinente et nécessaire pour comprendre leur potentiel thérapeutique. Nous avons rapporté que les EPCs interagissent avec les plaquettes via la P-sélectine et inhibent l’adhésion, l’activation et l’agrégation des plaquettes ainsi que la formation de thrombus. Plus récemment, nous avons démontré que les EPCs expriment le récepteur inflammatoire CD40 et il est bien connu que les plaquettes constituent la source principale de la forme soluble de son agoniste le CD40L («soluble CD40 Ligand», sCD40L). Ainsi, nous avons émis l’hypothèse principale que l’axe CD40L/CD40 dans les EPCs influence leurs fonctions anti-thrombotique et pro-angiogénique. Pour vérifier cette hypothèse, nous avons réussi à générer des «early» et «late» EPCs à partir de cellules mononucléaires du sang périphérique («Peripheral Blood Mononuclear Cells», PBMCs) en culture. Nous avons mis en évidence l’existence de l’axe CD40L/CD40 dans ces EPCs en démontrant l’expression des protéines adaptatrices, nommées les facteurs associés au récepteur du facteur de nécrose tumorale («TNF Receptor Associated Factors», TRAFs). Dans une première étude, nous avons investigué l’effet du sCD40L sur la fonction des «early» EPCs dans l’agrégation plaquettaire. En effet, nous avons démontré que le sCD40L renverse leur effet inhibiteur sur l’agrégation plaquettaire, et ce sans avoir un effet significatif sur la sécrétion de prostacycline (PGI2) et d’oxyde nitrique («Nitric Oxide», NO) par ces cellules. De plus, aucun effet du sCD40L n’a été noté sur l’apoptose et la viabilité de ces cellules. Par contre, nous avons noté une augmentation importante du stress oxydatif dans les «early» EPCs suite à leur stimulation avec le sCD40L. L’inhibition du stress oxydatif renverse l’effet du sCD40L sur les «early» EPCs dans l’agrégation plaquettaire. Ces résultats pourraient expliquer, en partie, la fonction réduite des EPCs chez les individus présentant des niveaux élevés de sCD40L en circulation. Dans une deuxième étude, nous avons étudié l’effet de sCD40L dans la fonction des «early» EPCs en relation avec l’angiogenèse. Nous avons identifié, dans un premier temps,les métalloprotéinases de la matrice («Matrix Metalloproteinases», MMPs) qui sont sécrétées par ces cellules. Nous avons trouvé que les «early» EPCs relâchent principalement la MMP-9 et que cette relâche est augmentée par le sCD40L. Le sCD40L induit aussi la phosphorylation de la p38 MAPK qui contribue à augmenter la sécrétion de MMP-9. Des études fonctionnelles ont démontré que le prétraitement des «early» EPCs au sCD40L potentialise la réparation endothéliale des HUVECs. En conclusion, l’ensemble de nos travaux, dans le cadre de ce projet de doctorat, nous a permis d’élucider les mécanismes responsables de l’action du sCD40L sur les effets inhibiteur et angiogénique des «early» EPCs dans l’agrégation plaquettaire et l’angiogenèse, respectivement. Ces résultats ajoutent de nouvelles connaissances sur le rôle des EPCs et pourront constituer la base pour des études futures permettant de corréler les niveaux élevés du sCD40L circulant et l’incidence des maladies cardiovasculaires, particulièrement l’athérothrombose.

Inhibition du pathogène des salmonidés Saprolegnia parasitica par des bactéries aquatiques

Les maladies constituent présentement la cause la plus importante de perte économique en aquaculture moderne. Chez certaines espèces, notamment les salmonidés (Oncorhynchus sp. et Salmo sp.), on rapporte des pertes annuelles atteignant cinquante pour cent de la production. À l’heure actuelle, les infections fongiques occupent le second rang derrière les maladies bactériennes en fonction de leur importance économique. Ces poissons sont particulièrement vulnérables à une infection fongique causée par Saprolegnia sp. qui infecte habituellement les oeufs morts. Le saprophyte ubiquitaire se propage ensuite aux oeufs sains et aux individus matures. Malheureusement, le traitement efficace de cette infection, souvent primaire et parfois secondaire, est de plus en plus difficile en raison de nouvelles réglementations restrictives entourant le vert de malachite. Jadis, ce colorant constituait le fongicide le plus efficace dans la lutte contre la saprolégniose, mais son potentiel cancérigène en limite maintenant l’utilisation. Jusqu'à présent, aucun traitement disponible n’est aussi efficace que le vert de malachite pour le contrôle de la saprolégniose. Récemment, nous sommes parvenus à isoler trois bactéries capables d’inhiber la croissance de Saprolegnia sp. in vitro. Ces trois Pseudomonas fluorescens proviennent d’une pisciculture dans laquelle survenaient des cas d’infections à Saprolegnia parasitica. En poussant la caractérisation de l’activité grâce à des analyses de chromatographie liquide haute performance et de spectrométrie de masse, nous avons réussi à isoler et à identifier la molécule responsable. L’acide phénazine-1-carboxylique (PCA), sécrété par deux de nos trois souches, cause l’inhibition de la croissance de Saprolegnia.

L'implication de l'autophagie dans la chimiorésistance du neuroblastome et l'intérêt de son inhibition

Le neuroblastome (NB) est une tumeur fréquente et agressive du jeune enfant. Les tumeurs de haut grade de forme métastatique, généralement développées chez l'enfant de plus de 1 an, sont associées à une importante mortalité malgré un traitement lourd incluant une chimiothérapie à haute dose. La chimiorésistance est donc un problème majeur qui caractérise ces NB de haut grade. Une des hypothèses pour expliquer cette chimiorésistance est celle de l’activation de l’autophagie, un mécanisme auquel recourent les cellules afin de faire face aux situations de stress. D’ailleurs, plusieurs études ont démontré que l'autophagie était activée à la suite des thérapies anticancéreuses. Son inhibition pourrait donc représenter une stratégie thérapeutique très intéressante pour le traitement de cancers. Le but de ce projet de recherche a été de mettre en évidence l'importance de l'autophagie dans les cellules du NB ainsi que l'effet de son inhibition sur la sensibilité des cellules du NB à la chimiothérapie conventionnelle. La présence d'autophagie dans les cellules de NB et sa valeur pronostic ont été évaluées par une étude immunohistochimique et par western blot sur 184 tumeurs patient. Ensuite, dans le but de déterminer l'effet de la chimiothérapie conventionnelle sur le niveau d'autophagie, des études in vitro sur 6 lignées cellulaires ont été effectuées utilisant des tests de mesure d'autophagie (MDC, monodanylcadaverine), de viabilité cellulaire (MTT) et de western blot. Celles ci ont été suivies par des tests d'inhibition de l'autophagie par deux méthodes: l’inactivation du gène ATG5 par un lentivirus contenant un shRNA ciblant ATG5 ou de l'hydroxychloroquine (HCQ), un inhibiteur pharmacologique de l’autophagie. Cette inhibition a été testée seule ou en combinaison avec une chimiothérapie conventionnelle dans le but de déterminer le rôle de l'autophagie dans la sensibilisation des cellules de NB à la chimiothérapie. Ensuite, l’intérêt de l’inhibition de l’autophagie a été évalué sur des modèles murins. Enfin, le niveau d'autophagie a été testé dans des cellules souches de NB. Notre étude a démonté que l'autophagie est présente à un niveau basal dans une majorité des NB mais qu'elle ne représentait pas un facteur pronostic dans ce type de tumeur. Les différentes chimiothérapies testées induisent une augmentation de l'autophagie dans les cellules du NB. Les deux tests d'inhibition ont démontré in vitro que l'autophagie participe à la résistance des cellules aux traitements chimiothérapeutiques classiques du NB. Le blocage de l’autophagie in vivo augmente l’efficacité de la chimiothérapie, cependant certaines données associées au traitement par HCQ devront être complétées. Cette étude démontre que l'inhibition de l'autophagie en combinaison avec la chimiothérapie classique représente une approche thérapeutique prometteuse dans le traitement du NB.